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基因克隆（gene cloning）技术是20世纪70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，它将DNA或基因组的DNA片段嵌入克隆载体，再将载体植入培养的宿主细胞，进行载体扩增或表达蛋白。基因克隆技术包括一系列的分子生物学技术，如目的基因片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等。基因克隆技术是分子生物学领域的重要技术之一，在结核病基础研究中也得到了广泛的应用。
基因克隆的过程简述如下：选择目的基因并设计相应引物；用引物扩增目的基因片段；选择合适的克隆载体，并将扩增片段连接入克隆载体中；将连接产物转化入感受态大肠杆菌，使之在含有抗生素的培养基上生长扩增；从大肠杆菌中提取质粒，酶切鉴定和测序鉴定均无误后将目的基因片段切下并与新的表达载体连接，转化入大肠杆菌中。许多细菌自身携带天然质粒，在分枝杆菌中只有溃疡分枝杆菌、鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和偶发分枝杆菌带有天然质粒，而在结核分枝杆菌中没有。许多染色体外的复制性质粒如大肠杆菌质粒pYUB12和pMV261已经应用到结核分枝杆菌中。另外，一些整合性质粒也被应用到结核分枝杆菌中。
基因克隆技术被广泛应用于结核病研究领域。
克隆表达蛋白作为MTB诊断靶标：16KD；38KD；ESAT-6；CFP-10；MPT64；细胞色素P450 cyp141；Rv3388蛋白的优势抗原片段；看家基因（housekeeping gene）MTB Rv2460c 编码的Clp蛋白酶；肝素结合血凝素黏附素（heparin-binding hemagglutinin adhesin，HBHA）；经人B细胞表位预测筛选得出的新抗原：Rv0432、Rv0674、Rv1566c、Rv1547；以MTB H 37 Rv标准株全基因组DNA为模板扩增得到 Rv2654c 、 Rv1985c 和 Rv3868 基因的完整序列，并与表达载体pET-32a构建重组质粒，原核表达上述蛋白。克隆表达的蛋白具有作为结核病诊断抗原的潜力，可以作为结核病免疫学快速诊断的候选蛋白。
目前利用基因克隆技术，已经表达出一系列的疫苗候选抗原：线粒体翻译控制（mitochondrial translation control，MTC）Z8蛋白、MPT64分泌蛋白、由 Rv0288 基因编码MTB早期分泌蛋白ESAT-6家族的TB10.4蛋白等。
克隆表达与结核潜伏感染密切相关的蛋白如复苏因子（resuscitation promoting factor，Rpf）、分枝菌酸环丙烷合成酶（PcaA）、小分子热休克晶体蛋白（Acr）等，为探讨这些蛋白在潜伏感染和MTB的持留存在机制中奠定了基础。
克隆编码MTB标准菌株H 37 Rv的毒素基因 higB 以及 VapBC家族蛋白，为毒素-抗毒素（toxin-antitoxin system，TAS）系统的深入研究奠定了基础。
以PhoPR双组分系统的 PhoP 基因、 PhoR 基因和 PhoPR 基因为目的基因，融合SOE-PCR技术和T载体技术构建MTB PhoPR双组分系统的一系列相关基因缺失突变载体并鉴定，为进一步研究MTB PhoPR双组分系统的功能奠定了基础。
Sir2蛋白具有ADP-核糖基转移酶活性和依赖于NAD的去乙酰化酶活性。烟酰胺是Sir2家族蛋白的天然抑制物，早期研究发现烟酰胺对MTB有良好的抑制效果，吡嗪酰胺（PZA）的作用机制可能与Sir2有关。克隆表达MTB的Sir2蛋白，可检测到PZA对其有抑制效果。
Eduard Melief等构建了一个MTB菌株重组文库，该文库将1733个克隆的文库排列在96孔板中用于快速筛选和监测生长。文库包含大多数注释的必需基因以及参与细胞壁和脂肪酸生物合成的基因、毒力因子、调节蛋白、外排和呼吸途径等重要基因。文库里的每个克隆通过至少3次传代以评估生长动力学和质粒稳定性。
基因扩增是指特异蛋白质编码基因的拷贝数选择性增加的过程。基因扩增实验主要指聚合酶链反应（PCR）。1985年，Cetus公司Mullis等发明了PCR基因扩增技术。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。在反应液中含有模板DNA、人工合成目的片段的5′端和3′端PCR引物、合成DNA的四种脱氧核苷酸底物（dNTP）、一种耐热的DNA聚合酶（Taq酶），以及含各种离子的缓冲液。此反应体系由高温促进DNA双链解离（变性）、低温促进引物与模板结合（退火）以及适温促进引物延伸合成新DNA链（延伸）三个步骤共同组成一个周期，然后反复循环进行，使目的DNA片段得以迅速扩增。由于每一周期所产生的新DNA链均能成为下一循环的模板，所以PCR产物以指数方式增加，经25～35轮循环就可使DNA扩增10 6 ～10 7 倍。PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，是生物医学领域中一项革命性创举和里程碑。
随着PCR技术日新月异的发展，目前在PCR基础上延伸出各类不同的基因扩增技术，已广泛应用于肺结核以及肺外结核的诊断与鉴别诊断、常见耐药基因型的检测与分析、MTB特异性抗原编码基因及其人T细胞表位的多态性、基因分型、菌种鉴定等。
1996年推出的实时荧光定量PCR技术和全世界首台荧光定量PCR仪，实现了PCR从定性到定量的飞跃，显著提高了检测的灵敏度和特异度。
环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是一种新型的核酸扩增方法，该方法无需昂贵的设备和严格的实验室环境条件，具有方法简单、反应快速灵敏等优点。目前，LAMP法对MTB的检测主要是针对其靶基因 gyrB 和 IS6110 。国内外已有研究者将该方法应用于痰标本以及脑脊液等的检测。已有研究表明，LAMP法比常规PCR方法的最低检测浓度提高了10倍，提示对于荷菌量更低的标本（如菌阴痰标本、CFS标本等）进行LAMP法检测可能更具优势。
免疫PCR（immuno PCR，Im-PCR）是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术，是用一段已知DNA分子标记抗体作为探针，用此探针与待测抗原反应，PCR扩增黏附在抗原抗体复合物上的这段DNA分子电泳定性，根据特异性PCR产物的有无，判断待测抗原是否存在。
该技术以半巢式实时定量PCR技术为基础，2010年得到WHO的推荐应用于肺结核的快速诊断。2013年WHO又推荐Xpert技术应用于肺外结核如淋巴结结核、结核性胸膜炎及结核性脑膜炎、骨关节结核等的诊断。Xpert技术以 rpoB 基因为靶基因，将PCR检测的3个步骤（样品准备、DNA扩增和检测）集于一体，可以同时检测MTB和利福平（RIF）耐药。其结果准确可靠，且结果报告时间可以控制在2小时以内。作为一种全自动的分子生物学检测技术，大大减少了对标本的人工处理步骤，不仅使生物安全度得到大幅提升，保护了实验室操作人员的健康与安全，而且通过集成一系列模块与荧光探测技术，大大缩短了检测时间。但是，由于Xpert MTB/RIF仍不能区分MTB死菌与活菌，因此Xpert MTB/RIF有可能会出现假阳性结果。日本一项研究将DNA染料叠氮溴化乙锭（ethidiumbromide monoazide，EMA）或叠氮溴化丙锭（propidiumMonoazide，PMA）与实时定量聚合酶链式反应（realtime PCR，RT-PCR）技术相结合，能很好地区分活的和死的MTB。
2017年3月，WHO推荐了新一代检测方法——超敏结核分枝杆菌和利福平耐药基因检测（Xpert MTB/RIF Ultra，简称“Xpert Ultra”）替代Xpert检测。与Xpert检测相比，Xpert Ultra检测对含菌量少的标本检测敏感度更高，如肺外结核、结核病合并艾滋病、儿童结核病等，对于正确选择治疗药物、制定合理的治疗方案有重要的意义。
PCR-基因芯片技术指将大量核酸分子以预先设计的方式固定在载体上，检测带标记的待测样品DNA。目前该技术用于杂交测序、鉴定分枝杆菌菌种以及耐药情况等。
数字PCR是一种全新的核酸分子绝对定量技术。作为PCR的最新一代技术，数字PCR技术通过将微量样品作大倍数稀释后进行样品分散，直至每个独立的微量样品中所含有的待测核酸分子数目不超过一个，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，并对发生了扩增反应的样品逐一进行计数，分别统计带有荧光信号的样本数量和样本总数，根据泊松分布最终实现初始样品核酸分子的绝对定量。有研究采用该技术检测全血中结核分枝杆菌特异性 CFP10 基因的拷贝数含量以及结核分枝杆菌循环DNA的数量。
杂交（hybridization）是分子生物学中常用的实验技术，主要包括核酸杂交和蛋白质杂交。核酸杂交的原理基于不同核酸单链通过互补核苷酸序列碱基配对形成杂化双链，这种杂化双链形式可为DNA-DNA、RNA-RNA或DNA-RNA。蛋白质杂交的原理基于抗原与特异性抗体的结合。由于嘌呤和嘧啶碱基具有特定配对关系、抗原和抗体为特异性结合，因此分子杂交具有高度的特异性。常用的分子杂交技术主要包括印迹技术和芯片技术，可用于核酸或蛋白质的定性或定量分析。
印迹技术可分为DNA印迹、RNA印迹和蛋白质印迹三大类，基本流程包括电泳、转移、杂交、显影或显色几个步骤。
DNA印迹也称Southern blotting。其主要步骤是将DNA样品用限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳，然后将含有DNA区带的凝胶变性处理，转移胶中的DNA至硝酸纤维素膜，交联固定后与标记探针进行杂交。DNA印迹主要用于DNA（如基因组中特异基因）的检测和定量分析。
RNA印迹也称Northern blotting。其技术原理与DNA印迹相同，但RNA分子较小，在转移前无需进行酶切。RNA印迹主要用于检测组织或细胞中已知RNA的表达情况。尽管RNA印迹技术的敏感性低于PCR方法，但因其特异性强、假阳性率低，仍被认为是mRNA和非编码RNA较可靠的定量分析方法之一。
蛋白质印迹也称Western blotting。其主要步骤是将蛋白质样本先进行聚丙烯酰胺凝胶电泳以按分子大小分开，然后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜或其他膜上，再用特异性抗体（第一抗体）杂交，用碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或放射性核素标记的第二抗体与之结合，通过显色或显影检测蛋白质信号。蛋白质印迹技术主要用于特定蛋白质的检测、半定量分析、蛋白质分子的相互作用等。
除了上述三种基本的印迹技术外，还有一些衍生的分子杂交技术应用于核酸和蛋白质的分析。例如，斑点印迹（dot blotting）可不经过电泳直接将样品点在膜上用于杂交分析；原位杂交（in situ hybridization，ISH）可将组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。
芯片技术是20世纪末发展起来的一项高通量生物分子分析技术，目前已被应用于基因表达检测、基因突变、基因诊断、新基因发现、基因组作图、功能基因组研究等众多领域。最常用的芯片包括基因芯片和蛋白质芯片。
基因芯片（gene chip）技术是指将特定的DNA片段高度紧密排列和固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样本进行杂交，再用荧光检测系统对芯片进行扫描，通过计算机对每一个位点荧光信号的采集和分析迅速得到定性和定量结果。该技术也称为DNA微阵列（DNA microarray）技术。基因芯片特别适用于不同组织细胞或不同状态下基因表达差异的分析。其原理基于双色荧光探针杂交，即两种不同来源的mRNA样本逆转录成cDNA时用不同的荧光分子标记，将等量cDNA混合后再与基因芯片进行杂交，最后用两种不同的激发光检测，获得两种杂交信号，从而分析得到某个基因在两种组织细胞或两种状态下的表达情况。
蛋白质芯片（protein chip）技术的原理与基因芯片类似，不同的是蛋白质芯片是将蛋白质分子高度密集排列和固定于固相支持物上，目的是对靶蛋白进行定性和定量分析。其基本原理是蛋白质分子间的亲和反应，如抗原-抗体、受体-配体的特异性结合。应用蛋白质芯片技术可对整个基因组水平的几千种蛋白质同时分析，是蛋白质组学研究的重要手段之一。该技术已广泛应用于蛋白质间相互作用、蛋白质表达、蛋白质功能、疾病标志物筛选、新药研发等各个方面。
总之，分子杂交是一种最基本和常用的分子生物学技术，其在结核病研究领域的应用也十分广泛。临床上，实验室诊断采用的线性探针检测法（line probe assay，LiPA）即利用了反向杂交技术检测结核分枝杆菌常见的耐药基因突变，能够将药敏检测时间从传统的1～2个月大大缩短至几个小时。基础研究中，印迹技术更是DNA、RNA和蛋白质研究中最常用的工具，芯片技术的应用也日益广泛。例如，人类蛋白质芯片常被用来分析结核病的致病机制；我国近年来也研发了国际上首张结核分枝杆菌全蛋白质组芯片，该芯片包含4262个蛋白，目前已用于结核分枝杆菌-宿主相互作用蛋白的筛选、结核病诊断标志物筛选以及生物分子的功能研究。
广义的基因转染（transfection）技术，即将具有生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能的过程。其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA）、反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。狭义的转染通常指借助一定的转染试剂（如早期使用的磷酸钙，目前最常用的阳离子脂质体和阳离子聚合物）将带有目的基因的载体运送到真核细胞内。在原核生物如细菌中，这一过程通常称为转化（transformation），针对结核分枝杆菌，主要介绍常用的基于电穿孔技术的转化和基于噬菌体感染的基因转染技术。
电转化的基本原理是当细胞放在电场中，细胞膜起电容器的作用，电流不能通过，随着电压升高，细胞膜组分被极化，并在细胞膜两边产生电位差，当电位差超过某一临界水平，细胞膜局部被击穿，形成瞬时孔洞，孔径大小足以让生物大分子（如质粒）进入或从细胞中排出。如果电场强度和脉冲持续时间不超过临界限度，这种通透性是可逆的，否则细胞会遭受不可逆损伤甚至死亡。主要操作流程包括培养对数期的结核分枝杆菌，10%预冷的甘油清洗三次制备感受态结核分枝杆菌，加入含目的基因的质粒，设置合适的电转参数进行电转，迅速加入培养液37℃振荡培养，将复苏后的菌体涂于含抗生素的培养基上，恒温培养后挑取单克隆进行目的基因扩增来验证转化是否成功。配合不同类型的质粒，如穿梭质粒、重组质粒以及自杀性质粒，电转化技术可实现过表达目的基因以及定向删除特定基因。
基于噬菌体的基因转染原理是采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，先将宿主菌处理成感受态细菌，再将重组噬菌体DNA直接导入受体细胞，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖。这里的转染是转化的一种特殊形式。采用噬菌体感染结核分枝杆菌在MOI≥3时即可实现DNA转入全部的受体细胞，转化效率远远高于电转化法。近年来，噬菌体转染技术已经成功应用于向菌体转入转座子、报告基因和等位交换底物（allelic exchange substrate，AES）等。如Jacobs等用分枝杆菌噬菌体D29和TM4构建的条件性复制的穿梭噬菌粒高效介导结核分枝杆菌发生转座突变。由此可建立包含数以千计独立突变的草分枝杆菌、BCG菌株、耻垢分枝杆菌或结核分枝杆菌的基因文库。第一个荧光噬菌体于2009年构建，无须发光底物直接导入后检测到至少100个结核分枝杆菌菌体。后来，Rondon等用TM4又构建了增强的绿色荧光（EGFP）噬菌体，可检测到混合样本中的耐药菌，在24小时内即可获得特异性和敏感性较高的结核分枝杆菌药物敏感性结果。通过将基于噬菌体的AES转运系统和重组系统结合，研究者在结核分枝杆菌中实现了更高效率的基因敲除。结核分枝杆菌噬菌体相关技术已成为一项受欢迎的靶向基因删除技术，在结核病诊断、抗结核治疗以及鉴定药物敏感性方面得到了广泛应用。
基因突变（gene mutation）是指基因组DNA分子在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变而产生可遗传的变异现象。目前，基因突变的检测都是建立在PCR技术的基础上，并且由此衍生出了多种新的检测方法，应用于多种疾病的突变基因检测，包括结核病。研究认为结核分枝杆菌发生耐药的原因主要是抗结核药物作用的相关靶基因发生突变，导致抗结核药物与药物作用结合位点亲和力下降。因此，基因突变检测多应用于结核分枝杆菌耐药基因的检测，主要技术包括聚合酶链式反应-单链构象多态性分析（polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）、限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、双脱氧指纹图谱法（dideoxy fingerprinting，ddF）、单链探针反向杂交法、直接测序法、基因芯片法，以及高分辨率熔解曲线分析（high resolution melting analysis，HRMA）等。
PCR-SSCP是通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），将空间构象有差异的单链DNA分子根据受阻力大小不同而分离开，可应用于检测PCR扩增产物的基因突变。若发现单链DNA带迁移率与正常对照相比发生改变，可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。该方法简便、快速、灵敏度高，不需要特殊的仪器，可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变，进一步分离不同迁移率的突变DNA片段，通过测序最终从DNA序列水平上鉴别突变。
HRMA技术是在常规PCR的基础上加入饱和染料，无须使用特异性探针，在PCR反应扩增完成后进行熔解分析，进而得到检测结果。HRMA技术建立在核酸分子物理性质不同的基础上，利用HRMA扩增含有碱基突变位点的耐药相关基因的过程中，由于突变位点的碱基不匹配，结合力相对较弱，双链DNA分子释放，其熔解温度反映在熔解曲线上就会相应降低，根据荧光强度和温度曲线就可以判断是否存在碱基突变。因此，HRMA能有效地检测结核分枝杆菌耐药突变的发生情况。
PCR-RFLP技术是在PCR技术基础上发展起来的。DNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶的识别位点上导致酶切位点增加或消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特异扩增包含碱基置换的这段DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常对照比较确定是否发生变异。应用PCR-RFLP可以快速检测结核分枝杆菌耐药株的基因突变位点，但可能会遗漏酶切位点之外其他位置的突变。
ddF基本原理是将任意一种双脱氧核苷酸掺入，进行DNA末端终止测序反应，然后将反应所得不同长度DNA片段在SSCP的中性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，观察不同长度DNA片段间单链构象的差异。由于ddF产生的含突变碱基的单链DNA片段可能有很多条，因此一次电泳发现泳动变位的机会比普通SSCP明显增加。而由于不同长度片段的存在，根据异常链出现的位置，可判定突变存在的大致位置。如果所用的双脱氧终止物（如ddATP）与突变碱基有关，则可在相应位置上增加或减少一个条带，这有助于判定突变的性质。因此，从理论上讲，ddF有双倍的突变检测效率，既可检测单链DNA二级结构的改变，也可判定突变的大致位置和性质。
单链探针反向杂交技术基于探针杂交原理，设计合成一系列探针，覆盖整个待检基因的突变高发区，在严格条件下与带生物素标记的PCR产物杂交，检测杂交信号，根据不同杂交条带谱判定出有无突变及突变的大致位置。该法简便、快速、灵敏，但也存在一些缺点，如受探针数量的限制、不能检测新的突变类型等。
基因芯片法基本原理是将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在一块集成电路板上，彼此之间重叠1个碱基并覆盖全部所需检测的基因。将荧光标记的正常DNA和突变DNA分别与两块DNA芯片杂交，由于至少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，通过分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变。目前我国也研发出一款用于耐药结核病诊断的基因芯片，可检测INH/RIF基因突变。
直接测序法：现在的测序方法与经典方法有很大不同，其基本原理虽然仍是双脱氧终止法，但自动化程度大为提高，操作更简便，测序时间也大大缩短。该法是目前基因水平检测MTB耐药基因突变最可靠的方法，具有操作简便快捷、灵敏度高等特点，可用于突变耐药株的筛选，并能准确判定碱基突变的位置与类型，被公认为耐药相关突变分子生物学检测技术的金标准。
随着分子生物学技术的不断发展，突变基因的检测方法也更加多种多样，但大多数技术都是在PCR基础上衍生而来，并且对突变类型和突变位置的准确判定都需要测序分析最终确定。相信这些新技术新方法将助力耐药结核病的精准诊断及临床治疗。
测序技术的每一次变革都对基因组研究等领域产生巨大的推动作用。自1977年第一代Sanger测序技术诞生以来，DNA测序技术经历了三代变革，产生了第二代到第四代测序技术，统称为新一代测序技术。
第二代测序技术（next generation sequence，NGS）建立在PCR基础上，直接通过聚合酶或连接酶进行体外合成测序，高通量低成本齐头并进。根据其原理分为聚合酶合成测序和连接酶合成测序两类。第二代测序技术较第一代测序技术而言，测序通量明显提高，极大地推进了基因组相关研究进展，但是测序长度较短，对后续的拼接、组装及注释的生物信息学分析带来困难。序列读长较短和扩增前需要模板扩增步骤，成为第二代技术最集中的弊端所在。
第三代测序技术是单分子测序。通过在单一DNA分子组成的列阵上进行合成测序。在一个表面积限定的介质上使用单个分子，可以增加独立分析的DNA片段数量，也意味着不再进行昂贵的DNA扩增步骤，因此，可以使数据产出量更高，而且将进一步降低测序成本。但同时该技术也带来了一些新的挑战，主要问题是要降低没有参与到实际化学反应中的游离荧光分子的背景干扰。
在上述第二、三代测序技术中，DNA序列都是在荧光等发光物质的协助下，通过DNA聚合酶将不同的dNTP连接到DNA链上，读取此过程中释放出的不同光学信号而间接确定的。第四代测序技术以纳米孔技术为代表。它采用物理方法直接读出其碱基序列，完全摒弃了在复杂的DNA聚合酶生化反应中进行DNA序列的读取，基本原理为：单个碱基通过纳米孔道时会引起电化学性质的变化，而且由于ATCG这4种不同的碱基存在电化学性质的差异，使得它们穿越纳米孔时所引起的电化学参数的变化量也不同。因此，不同的电化学参数变化量也对应通过纳米孔的相应碱基。
应用第一、二代测序技术，极大推动了对结核分枝杆菌全基因组的诠释和耐药突变位点的发现。科学家们先后利用这些技术完成了结核分枝杆菌各亚类菌种的全基因组测序及耐药菌株的测序，对研究结核分枝杆菌的致病机制和耐药机制、实现结核病和耐药结核病的诊断有巨大帮助。
蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。在基因工程技术中占有核心地位。
蛋白表达系统一般由宿主、载体和辅助成分这三部分组成。
原核蛋白表达系统以大肠杆菌表达系统为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点。缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性蛋白质的概率较小。
酵母蛋白表达系统以甲醇毕赤酵母为代表，具有表达量高、可诱导、糖基化机制接近高等真核生物、分泌蛋白易纯化、易实现高密发酵等优点。缺点为部分蛋白产物易降解，表达量不可控。
哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统主要优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，最容易保留生物活性。缺点是表达量通常较低，稳定细胞系建立技术难度大，生产成本高。
蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，可利用不同蛋白内在的相似性与差异，利用各种蛋白的相似性除去非蛋白物质的污染，而利用各种蛋白的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。主要方法包括：
（1）根据分子大小不同的分离方法：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质）；密度梯度离心（蛋白质在介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快）；凝胶过滤（一种柱层析）。
（2）利用溶解度差别分离：等电点沉淀法（由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零，减少了分子间静电斥力，因而容易聚集沉淀，此时溶解度最小）；盐溶与盐析（利用一定浓度盐溶液增大或减小蛋白质的溶解度）。
（3）根据电荷不同的分离方法，主要包括电泳和离子交换层析分离。
（4）蛋白质的选择吸附分离（利用颗粒吸附力的强弱不同达到分离目的）。
（5）根据配体特性的分离-亲和层析（利用蛋白质分子与配体特异而非共价的结合这一生物性质）。
（6）低温有机溶剂沉淀法：用与水可混溶的有机溶剂，如甲醇、乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
蛋白的纯化一般可以分为前处理、粗分离、细分离三步。
前处理：分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。细菌细胞的破碎常用方法有超声波破碎、与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。组织和细胞破碎后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤方法除去。
粗分离：当获得蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。有些蛋白提取液体积较大，又不适合用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。
细分离：样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法，包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。
（黄银霞 李自慧 吕翎娜 杜凤娇 张宗德）