第三章
核分枝杆菌分子生物学

第一节
结核分枝杆菌分子生物学概述

一、分子生物学发展简史和重要成就

自1882年德国科学家罗伯特·柯赫（Robert Koch）首次证实结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）是结核病致病菌的很长一段时间里，对MTB的认识和研究基本停留在细菌形态学层面。MTB是一种慢生性、寄生于宿主细胞内的病原菌，它能够在巨噬细胞和其他哺乳动物细胞中存活和增殖，革兰氏染色呈阳性、不形成孢子、好氧。MTB的细胞壁很厚，其组分也十分复杂和独特，分枝酸占干重的比例很高，甚至达到50%以上，并且具有抗酸染色特征。1953年，DNA双螺旋结构的发现奠定了现代分子生物学的诞生与发展。20世纪70年代以后，基因工程技术的出现标志着人类在认识生命本质的基础上进入改造生命的新时期。随着分子生物学新技术不断涌现，对缓慢生长的MTB基因研究起到了很大推动作用。1985年，Yonug等首次在大肠杆菌中构建了第一个分枝杆菌DNA文库。1987年，实现了将重组DNA载体导入分枝杆菌。1988—1991年，科学家构建了整合型质粒可实现将报告基因及抗原基因导入MTB内。紧接着，针对MTB的基因操作技术陆续发展起来，包括基于重组质粒的基因敲除、基因突变以及基于噬菌体基因导入技术的基因删除等。至此，MTB分子生物学逐渐发展。

MTB分子生物学研究初期，主要集中于单个基因及其功能研究。这一阶段最重要的成就为发现并获得耐药相关基因的信息。如1992年，Zhang等首次发现MTB异烟肼耐药主要由过氧化氢-过氧化物酶编码基因 katG 的315密码子突变引起，而该耐药株早在1954年就被Middlebrook首次分离并报道；1993年，Telenti等通过对PCR产物直接测序发现利福平药物耐药性主要是由 rpoB 基因耐药决定区内的点突变引起，并克隆了该基因。可见，MTB分子生物学的发展快速推动了MTB耐药机制的研究。

20世纪90年代，全自动核酸测序仪的问世使生物整个基因组的结构与功能获得全面解析。1998年英国Sanger中心和法国Pasteur研究所科学家合作完成了结核分枝杆菌H ₃₇ Rv菌株的全基因组测序工作，这是标志结核分枝杆菌分子生物学进入快速发展阶段的重要里程碑。随着全基因组测序技术的进步，各类结核分枝杆菌全基因组也得到了全面解析，并且极大地促进了比较基因组学的研究。目前，已经完成全基因组测序并公布数据的结核分枝杆菌复合群菌株较多，包括结核分枝杆菌H37Ra、结核分枝杆菌临床分离株（CDC1551等）、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌以及多个卡介苗菌株等，通过比较不同菌株基因组的差异，获得了更多关于结核分枝杆菌毒力、致病性等表型方面的分子解释。

随着结核分枝杆菌基因组测序的完成，蛋白组学的研究也得到了更全面深入的发展，标志着结核病研究已经进入后基因组研究时代。2011年，科学家解析了结核分枝杆菌基因组中约8.5%可读框的分子结构，使蛋白质组数据得到补充、基因组注释得以完善。2012年，阐明了纯蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD）的蛋白质组组成，其中含有许多已知的结核分枝杆菌T细胞抗原、热休克蛋白、GroES、GroEL2等。2013年，Gunawardena等研究发现结核分枝杆菌与BCG菌株之间的294个显著差异膜蛋白。这些研究为揭示结核分枝杆菌的毒力因子提供了蛋白组学基础。2014年，中国科学家构建了首张结核分枝杆菌全蛋白质组芯片，该芯片包含4262个结核分枝杆菌基因组阅读框架编码产物，覆盖其基因组编码蛋白质的95%，利用该蛋白组芯片，可以完成结核分枝杆菌蛋白之间相互作用研究以及结核分枝杆菌与宿主相互作用蛋白机制研究。

结核分枝杆菌全基因组测序和蛋白质组的不断诠释，为结核病研究打开了新的窗口，可以系统性发现新的免疫原和新的标志物，从而发展新型高效疫苗、新药物和检测技术，是结核病基础研究强有力的新方法学平台。

二、分子生物学发展趋势

结核分枝杆菌分子生物学在近半个世纪发展较为迅速，但其研究历史却很短，结核分枝杆菌核酸、蛋白质组成的许多基本规律还未完全阐明，这些基因产物的功能、生物大分子之间的相互作用以及复杂的调控网络有待深入研究，以进一步揭示结核分枝杆菌致病机制、耐药机制，为研制新型诊断试剂、抗结核药物、免疫治疗策略和结核病新疫苗奠定基础。

结核分枝杆菌分子生物学的发展依赖于分子生物学技术的不断进步。复旦大学研究人员利用全基因组二代测序描绘了结核分枝杆菌北京家族菌株的特征和进化起源。通过对358株北京菌株进行全基因组测序确定了全球北京菌株的多样性特征，并证实在东亚地区流行的北京菌株显示遗传多样性，而在全球流行的北京菌株则主要属于与“现代”型菌株同源性更高的亚型，系统发生地理学和贝叶斯进化分析表明，北京菌株起源于距今大约3万年的东南亚地区，这一时间与现代人口早期定居于东南亚的年代相符。中科院生物物理所研究人员对中国12个省份的161株结核分枝杆菌（其中44株敏感菌，94株多耐药菌，23株广泛耐药菌）进行了全基因组二代测序和系统分析，获得了我国临床耐药结核分枝杆菌中已知耐药相关基因的突变情况，新发现了与结核分枝杆菌耐药性相关的72个编码基因和28个基因间隔区的突变。结果提示，中国地区的结核病患者主要受到lineage 2 和lineage 4两系结核分枝杆菌的侵染，其中95%的lineage 2 结核分枝杆菌属于国际上比较关注的毒性更强和更容易产生耐药的北京家族，该研究为结核分枝杆菌耐药性发生机制和相关药物研究提供了新的线索。哈佛大学Murray研究团队对全球123种具有代表性的结核分枝杆菌菌株进行了全基因组二代测序和分析，并构建了序列进化树，而且借鉴菌株之间的进化关系，开发了一种在微生物基因组中搜寻耐药性标记的新方法，在结核分枝杆菌基因组中确认了39个与耐药性相关的基因组区。Pankhurst等在欧洲和北美8个实验室平行比较了全基因组测序和常规实验室诊断流程在结核病诊断准确性、处理时间和成本的差异。与常规诊断结果相比，根据1次全基因组测序检测菌株和药物敏感型的准确性均为93%，全基因组测序在常规诊断完成前诊断出1例耐多药结核病，全基因组测序结果回报比常规诊断结果回报平均提前20天，全基因组测序比常规诊断流程的经济成本下降7%。这些结果提示全基因组测序是一种可扩展的、快速的、经济的结核病诊断方法。但是，全基因组测序真正应用于临床仍需要全球多个实验室的进一步验证和技术优化。未来测序技术的发展，如第三代测序已经可以实现多种结核分枝杆菌基因组的精确测定，这将促进结核分枝杆菌进化和耐药相关分子流行病学研究以及临床诊断。

目前，进行结核分枝杆菌重要基因功能的研究主要受限于缺乏有效的技术工具定向删除失活结核分枝杆菌的目标基因，虽然已有一些较为成熟的技术方法进行非必需基因的定向删除，包括转座子突变、基于噬菌体的转导和重组技术等，但对结核分枝杆菌必需基因的定向删除或失活一直没有开发出有效的研究方法。CRISPR- Cas9 基因编辑及表达调节技术的出现，为结核分枝杆菌基因功能的研究提供了新的途径。2015年首次利用该方法实现了分枝杆菌中多个基因的同时敲除。2017年，Yan等报道了新的Cpf1（CRISPR Cas12a ）系统可以高效敲除耻垢分枝杆菌中的目标基因。此外，CRISPRi不限于基因编辑，还可以针对性地失活耐药基因从而抑制耐药菌株的耐药性。近来，Zhang等发现利用CRISPR- dCas9 技术检测结核分枝杆菌DNA具有高特异性和敏感性。

未来的研究需要探索以序列特异性的方式靶向应用于耐药菌株以及重新使耐多药和广泛耐药菌株变成敏感株，这将有助于控制结核分枝杆菌耐药性的产生。该系统不断改进将拓展对结核分枝杆菌致病性的认识，鉴定新的治疗靶点并促进高效抗结核药物和疫苗的开发。

（吕翎娜 张宗德） HLepAq9Sw+AgFh+igpJ5GVYZkYu9rZ0yLjm1tAHc9AD/dWvnxspJcEJaDNrBFt5R