第四节
结核分枝杆菌的耐药性

20世纪中叶，抗结核药物的问世以及生活状况的改善，使结核病得到有效控制，特别是在工业发达国家结核病发病率迅速下降，人们乐观地认为人类将很快消灭结核病。但20世纪90年代，人类消灭结核病的势头受到诸多因素的挑战，结核病在全球范围内“死灰复燃”。其中耐药结核病尤其是耐多药结核病在全球的蔓延是全球结核病控制领域严峻的挑战之一。近年来采用分子生物学及遗传学技术，了解了部分抗结核药物作用的分子机制，阐明了其耐药的分子基础，这不仅成为当代耐药结核病分子诊断的理论依据，同时有利于开发新的抗结核病药物和开展更有效的化疗。

一、结核分枝杆菌耐药性的产生

耐药结核病的发生通常分为两种情况，即原发耐药和继发耐药。原发耐药是指患者感染的MTB为耐药菌，即还没有开始治疗部分药物已不再起效。继发耐药是在用药过程中逐渐产生。原发耐药反映了耐药结核病在人群中的流行传播情况，当原发耐药比例增高时，提示耐药结核病的控制工作需要进一步加强。继发耐药反映了MTB在药物的筛选作用下不断进化获得耐药表型的过程。MTB基因组的自发突变是耐药产生的重要基础，染色体自发突变的频率为10 ^-8 ～10 ^-6 /分枝杆菌每次复制，并且不同药物发生自然突变的频率各不相同，这种突变频率与后期的耐药率呈现一定的相关性。此外，药物在临床大规模使用的时间也和临床分离的MTB菌株耐药密切相关。理论上，每种药物耐药基因突变发生是相互独立的，同时使用3种药物发生耐药的可能性为10 ^-24 ～10 ^-18 ，在实际情况中不存在。因此，在结核病的治疗过程中使用多药联合的方式，可提高患者的治疗效果。

MTB中参与耐药的分子机制主要包括以下4种：①药物靶标发生突变：当药物靶标发生碱基突变、缺失等，药物靶标结构发生变化，导致药物无法与靶标有效结合，从而产生耐药表型，其中利福平耐药相关基因 rpoB 、氟喹诺酮耐药相关基因 gyrA 等突变均属于此类情况；②药物活化酶发生突变：部分抗结核药物并非活性形式，需要在MTB的酶催化转化为活性形式而发挥作用，当编码相关酶的基因发生突变或基因缺失时，因为无法形成有效的酶活化抗结核药物，不能在细胞内发挥作用导致耐药的发生，其中异烟肼耐药相关基因 katG 、吡嗪酰胺耐药相关基因 pncA 等均属于此类情况；③药物外排泵：当药物进入MTB细胞内，MTB部分跨膜转运蛋白会发挥作用，将细胞内的药物采用主动运输的方式运输到细胞外，从而降低细胞内的药物有效浓度，因此能够产生低水平的耐药；④细胞壁通透性：抗结核药进入MTB内部需要穿过致密的细胞壁，因此细胞壁交联度和厚度的增加会导致药物进入细胞的效率降低，无法达到有效胞内浓度从而作用靶标发挥抗菌效果，导致对药物产生抗性，细胞壁通透性改变引发的耐药通常具有广谱耐药性，即对多种抗结核药物同时耐药。有研究表明，使用透射电镜扫描全敏感的MTB、耐多药结核分枝杆菌和广泛耐药结核分枝杆菌，结果表明广泛耐药菌株的细胞壁厚度显著大于其他菌株，提示细胞壁通透性在MTB广谱耐药性中的作用。MTB耐药的分子机制中，前两种机制尤为重要，大多数MTB的耐药性都可以归因于这两种机制，并且通常导致MTB高水平耐药；后两种机制作为重要补充，通常导致MTB低水平耐药。

二、结核分枝杆菌耐药的分子机制

（一）利福平耐药的分子机制

利福平（RIF）是一种快速全效杀菌剂，对繁殖期和静止期的MTB均有明显的杀菌作用。RIF通过与结核分枝杆菌RNA聚合酶β亚基结合，抑制结核分枝杆菌RNA转录，阻碍蛋白质的生物合成从而发挥杀菌作用。RNA聚合酶β亚基由 rpoB 基因编码，对利福平耐药的MTB菌株分析结果表明，约95%的利福平耐药MTB菌株的 ropB 序列存在基因突变，突变一般发生在长度81个碱基的利福平耐药决定区（RRDR），编码 rpoB 基因507位至533位氨基酸（基于大肠杆菌氨基酸序列编码），其中531、526和516位点的突变是利福平耐药菌株中最常见的突变，上述突变通常导致高水平的耐药和对其他利福类的交叉耐药；而511、516、518和522密码子的突变与利福平和利福喷丁低水平耐药相关，但是这些突变菌株对利福布汀仍然保持敏感（表1-2-3）。

（二）异烟肼耐药的分子机制

异烟肼（INH）是酰胺类药物，异烟肼只对生长的MTB有效，对于非复制杆菌无效。异烟肼在体内过氧化氢-过氧化物酶（ katG 基因编码）的作用下，转化为活化形式，活化的异烟肼产生自由基攻击MTB细胞壁中的分枝菌酸、DNA、脂类等成分，从而达到杀灭MTB的作用。研究表明 katG 、 inhA 启动子区及 oxyR-ahpC 间隔区是最主要影响MTB对异烟肼敏感性的基因。

1.katG基因

katG 基因编码过氧化氢-过氧化物酶，其突变和缺失是引起INH耐药性的主要原因。INH经过氧化氢-过氧化物酶的活化，可与烯酰-酰基载体蛋白还原酶（ inhA 基因编码）结合，抑制分枝杆菌合成过程中脂肪酸的延长。 katG 基因315位突变是异烟肼耐药MTB最常见突变，通常导致对异烟肼的高水平耐药，先期研究对比了不同国家和地区异烟肼耐药菌株 katG 基因突变频率，结果表明不同国家和地区异烟肼耐药菌株中 katG 的突变频率为7%～93%，提示 katG 基因突变频率存在明显的地域差异。此外，发现极少量异烟肼耐药菌株 katG 基因缺失，上述突变导致对异烟肼的高水平耐药，鉴于 katG 是MTB重要的防御性毒力决定因子，对于MTB抵抗宿主产生的氧化胁迫攻击具有重要作用，因此， katG 缺失的发生频率极低。

2.inhA基因

烯酰-酰基载体蛋白还原酶（ inhA 基因编码）属于Ⅱ型脂肪酸合酶系统，催化分枝杆菌合成，同时也是活化的异烟肼的主要作用位点。 inhA 基因突变可以导致 inhA 与活化异烟肼相互作用的下降，诱发耐药表型的出现；同时 inhA 基因启动子突变导致 inhA 的过度表达，补偿活化异烟肼对 inhA 基因功能的影响，进而产生异烟肼耐药表型。研究表明， inhA 基因突变通常与低水平异烟肼耐药相关，同时其突变可能导致对其他异烟肼结构类似药物，如乙硫异烟胺和丙硫异烟胺的交叉耐药。

3.其他基因

作为异烟肼耐药最主要的基因， katG 和 inhA 通常作为检测MTB菌株对异烟肼耐药性的分子标志物，然而10%～25%低水平耐药的菌株并未携带上述两种突变。近年来鉴定出与异烟肼耐药相关的基因还包括编码烷羟基丙二酸还原酶的 ahpC 启动子区，β酮酰基载体蛋白合成酶 kas 基因，NADH脱氢酶 ndh 基因等，这些基因的突变均与异烟肼耐药相关，但上述基因突变在异烟肼耐药菌株中发生的频率较低。随着对异烟肼耐药机制研究的不断深入，将会有更多可能与异烟肼耐药相关的基因不断被发现。

（三）链霉素耐药的分子机制

链霉素（SM）是一种由灰色链球菌中分离得到的抗结核药物，同时也开创了结核病化学治疗的新纪元。链霉素对于对数生长期的MTB具有很好的杀灭效果，但对于潜伏菌及胞内菌无效。其作用机制是通过结合在16S rRNA（ rrs ）和S12核糖体蛋白（ rpsL ），阻断蛋白质的合成。链霉素的耐药性主要发生在 rpsL 和 rrs 基因。其中最常见的突变类型包括 rpsL 基因的43位和88位氨基酸，以及 rrs 基因的530位和912位密码子。既往研究表明，约70%链霉素耐药的MTB是由 rpsL 基因突变引起。尽管 rpsL 基因在链霉素耐药菌株中占主导地位，但不同突变位点的突变频率在不同国家和地区呈现出很大的差异。

（四）乙胺丁醇耐药的分子机制

乙胺丁醇（EMB）是一线抗结核药物的重要组成部分，其主要作用为抑制MTB细胞壁阿拉伯半乳聚糖的合成，对于活跃代谢的MTB生长具有抑制作用，但对于非复制期的MTB没有杀灭作用。通常认为 embCAB （编码阿拉伯糖基转移酶）操纵子中的基因，尤其是 embB 基因，是乙胺丁醇的主要靶标，与MTB对乙胺丁醇耐药密切相关。其中 embB 基因的306位、406位及497位密码子是最常见的乙胺丁醇耐药突变，50%～70%乙胺丁醇耐药菌株的突变发生于这3个位点。此外，有文献报道， embC-embA 的间隔区、 ubiA 基因等发生突变也可能导致MTB对乙胺丁醇耐药。

（五）吡嗪酰胺耐药的分子机制

吡嗪酰胺（PZA）是一线抗结核药物之一，与其他一线抗结核药物不同，吡嗪酰胺能够杀死其他药物无效的细胞内酸性环境中的MTB，因此对于杀灭休眠菌具有重要意义，在缩短疗程中起关键作用。在酸性条件下，吡嗪酰胺通过结合分枝杆菌吡嗪酰胺酶（ pncA ）转换成活性形式，吡嗪酸能够破坏MTB细胞膜。通常与吡嗪酰胺耐药相关的基因包括 pncA 、 rpsA 和 panD 基因，其中最常见的突变发生在 pncA 基因。基于 pncA 基因的序列分析结果表明， pncA 基因中与吡嗪酰胺耐药性相关的基因具有广泛的多态性，来自不同国家和地区的研究结果能够发现新的与吡嗪酰胺耐药相关的新突变，同时由于吡嗪酰胺表型药敏检测方法学的不足，限制了其耐药相关基因研究的进展（表1-2-3）。

（六）氟喹诺酮耐药的分子机制

氟喹诺酮是目前应用最广泛的二线抗结核药物，近期的临床试验表明，氟喹诺酮类药物是缩短抗结核疗程的关键药物。氟喹诺酮作用于结核分枝杆菌DNA促旋酶，阻断细菌DNA复制，从而有效抑制MTB的生长。DNA促旋酶包括两个GyrA和两个GyrB亚基，上述两个亚基分别由 gyrA 和 gyrB 基因编码，其中与氟喹诺酮耐药相关的区域被称为喹诺酮耐药决定区，分别位于 gyrA 基因密码子74位到113位和 gyrB 基因密码子500位到540位。既往研究结果表明，氟喹诺酮耐药的MTB中60%～70%的菌株携带有 gyrA 基因突变，而5%～10%的菌株携带有 gyrB 基因突变。 gyrA 基因中最常见的突变发生在密码子90位、91位和94位，上述位点突变通常与氟喹诺酮高水平耐药相关；而 gyrB 基因突变通常与低水平耐药相关。少量临床菌株发现同时携带 gyrA 基因突变和 gyrB 基因突变，双突变导致对氟喹诺酮高水平耐药。值得注意的是， gyrA 部分位点突变引起对第三代氟喹诺酮氧氟沙星和左氧氟沙星的耐药，但是部分菌株对第四代氟喹诺酮莫西沙星表现为敏感，因此，尽管发生的比例较低，在解读 gyrA 基因突变与莫西沙星等第四代氟喹诺酮耐药性时特别注意。

（七）二线注射类药物耐药的分子机制

二线注射类药物主要包括卡那霉素（KAN）、阿米卡星（AMK）和卷曲霉素（CAP），其中卡那霉素和阿米卡星与链霉素类似，属于氨基糖苷类药物，通过与核糖体16S rRNA结合抑制蛋白质翻译；而卷曲霉素为多肽类抗生素。上述三种药物耐药最主要的耐药相关基因为编码16S rRNA的 rrs 基因，通常 rrs 基因A1401G突变引起对三种药物的高水平耐药，而C1402T和G1484T突变仅引起对卡那霉素和卷曲霉素的耐药。A1401G突变是最常见的二线注射类药物耐药突变位点，其在卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素耐药菌株中发生的频率分别是56%、78%和76%。近年来，陆续鉴定出 eis 和 tlyA 两个基因与二线注射类药物耐药性相关，其中 eis 基因编码氨基糖苷酰基转移酶，其-10位到-35位启动子区突变与低水平卡那霉素耐药相关，有研究表明在所有卡那霉素低水平耐药的菌株中，约有80%的菌株携带有 eis 基因启动子突变；而 tlyA 基因编码rRNA甲基转移酶，其突变仅与卷曲霉素耐药相关。

（八）乙硫异烟胺耐药的分子机制

与异烟肼类似，乙硫异烟胺（ETO）亦是一种前药，需要经过活化发挥抑制烯酰-酰基载体蛋白还原酶（ inhA ）的作用。乙硫异烟胺的活化需要单加氧酶（ ethA 基因编码）的作用，从而使乙硫异烟胺转变为乙硫异烟胺-NAD的复合物。 ethA 和 inhA 基因的突变均能导致乙硫异烟胺耐药。因此， inhA 基因编码区的突变可能导致MTB对乙硫异烟胺和异烟肼的交叉耐药。此外，参与分枝杆菌细胞壁合成的 mshA 基因（编码糖基转移酶）同样也是乙硫异烟胺的可能靶标之一。

（九）对氨基水杨酸耐药的分子机制

对氨基水杨酸是一种早期发现的具有抗结核活性的药物之一，曾与异烟肼和链霉素联合使用治疗结核病患者，然而对于对氨基水杨酸耐药机制的研究却尚不完全明晰。有研究提示，对氨基水杨酸可能与对氨基苯甲酸竞争，通过抑制四氢叶酸的合成从而抑制MTB生长。编码胸苷酸合酶的 thyA 基因被认为与MTB产生的对氨基水杨酸耐药性相关，但是分子流行病学研究表明，仅有37%左右的对氨基水杨酸耐药菌株带有 thyA 基因的突变，并且上述突变类型具有明显的MTB株系特异性，尤其在拉美-地中海型菌株中常见。因此，亟待后续研究阐明对氨基水杨酸耐药的分子机制。

（十）利奈唑胺耐药的分子机制

利奈唑胺是噁唑烷酮类抗生素，通过与核糖体50S亚基结合抑制蛋白质合成的早期过程。利奈唑胺在体内体外实验中均表现出良好的杀菌活性。尽管利奈唑胺耐药不常见，但是研究表明利奈唑胺耐药的MTB主要由23S rRNA基因的G2061T和G2576T突变引起，同时少量对利奈唑胺耐药的菌株是由于核糖体蛋白L3（ rplC ）和L4（ rplD ）突变引起。

（十一）新型抗结核药物耐药的分子机制

近年来，随着贝达喹啉的上市，终止了近半个世纪没有抗结核新药的窘境，同时有更多的新型化合物作为备选抗结核药物处于临床试验的不同阶段，包括德拉马尼、SQ109等一系列药物，这些药物的作用机制也已经被部分阐明，此处选取研究相对较多的几种药物阐述其主要机制。其中，贝达喹啉通过特异性抑制结核分枝杆菌ATP合酶发挥作用，体外诱导实验表明贝达喹啉耐药的MTB菌株通常由 atpE （编码ATP合酶）突变引起；德拉马尼属硝基咪唑类化合物，其主要作用机制为抑制甲基或酮基-分枝菌酸的合成，目前少量研究表明德拉马尼在MTB内发挥作用依赖于 ddn 基因（编码脱氮黄素依赖的硝基还原酶）的活化，因此， ddn 是目前证实与德拉马尼耐药相关的重要基因，此外， fgd1 、 fbiA 、 fbiB 和 fbiC 4个辅酶F420相关基因均与德拉马尼耐药有关；SQ109是一线抗结核药物乙胺丁醇的结构类似物，其作用靶标为 mmpL3 （编码海藻糖单分枝菌酸转运蛋白），通过与乙胺丁醇不同的机制抑制分枝杆菌细胞壁的合成，因此， mmpL3 基因突变与SQ109耐药密切相关。此外，在对异烟肼、乙胺丁醇和SQ109都耐药的MTB中发现 ahpC 基因表达的上调，提示可能与SQ109耐药有关。

（十二）药物外排泵与结核分枝杆菌耐药

除了药物靶标基因及参与药物活化基因发生突变以外，药物外排泵是MTB耐药机制的重要组成部分。通过对MTB全基因组的解析，发现了一系列潜在的药物外排泵基因。通过药物外排泵的主动运输过程，将MTB细胞内的抗结核药物排出细胞，从而降低细胞内的药物浓度并产生耐药性。此外，药物外排泵机制也增加了MTB在药物暴露过程中积累点突变的可能性，使得MTB有可能产生高水平耐药甚至耐多药表型。药物诱导的外排泵基因通常对多种药物均有活性，因此导致MTB对多种抗结核药物耐药。

根据药物外排泵的结构特点，通常可以分为5类，包括ATP结合盒转运蛋白家族（ABC）、耐药结节细胞分化家族（RND）、主要协同转运蛋白家族（MFS）、多药及毒性化合物外排家族（MATE）、小多重耐药家族（SMR）。其中MTB中参与药物运输的药物外排泵主要来自ABC家族和MFS家族。通过使用结核药物诱导，并在多种模型（包括大肠杆菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌等）中通过表达药物外排泵，目前已经明确鉴定了多个可能参与MTB耐药相关的药物外排泵基因（表1-2-4）。尽管药物外排泵通常与低水平耐药相关，但是作为MTB固有耐药的重要组成部分，药物外排泵对积累高水平耐药的点突变、多药耐药等具有重要作用，因此，是未来潜在的新型抗结核药物的重要靶标。

三、结核分枝杆菌耐药性与补偿突变

由于基因突变产生的耐药性通常伴随细菌对环境适应能力的下降。为了更好地适应细菌间的竞争，耐药菌通常会采用两种进化策略：第一，尽量选用适应性降低程度较小的突变；第二，在第一种耐药突变的基础上，积累第二种突变，该突变可能导致细菌适应性的提高。通常第一种策略中，由于对于适应性影响程度较低，因此，细菌对抗生素的耐药性通常表现为低水平耐药；而第二种策略通常积累于第一种突变引发高水平的耐药，因此，在适应抗生素，特别是抗生素的筛选过程中将表现出更好的适应性，细菌积累的第二种突变被称为“补偿突变”。目前，包括大肠杆菌、淋病奈瑟菌、肠道沙门菌等多种细菌均被证实存在上述补偿突变现象。结核分枝杆菌中，研究证实对利福平、异烟肼、喹诺酮、氨基糖苷类药物中的任一药物耐药的菌株表现出适应性的下降，即在体内或体外试验中发现与敏感菌株对比，其生长速度显著下降，因此，在有药物筛选的情况下，上述菌株能表现出较好的适应性，但是，在没有药物筛选的情况下，上述菌株与其他结核分枝杆菌竞争中处于不利地位。

既往研究采用全基因组测序技术，通过对10对临床分离株进行全基因比较分析，证实在利福平耐药菌株中，编码DNA依赖的RNA聚合酶β亚基的 rpoB 存在突变的同时，在编码RNA聚合酶α亚基的 rpoA 基因和β′亚基的 rpoC 基因上存在某些突变，特别是 rpoC 基因，在原核生物中， rpoC 与 rpoB 所编码的β′/β亚基共同构成了RNA聚合酶催化活性中心80%的部分，从蛋白质结构和功能上， rpoC 的突变可能对 rpoB 突变引起RNA聚合酶活性下降进行某种程度的提升，从而保证了RNA聚合酶活性的提升，补偿了由于 rpoB 基因突变造成结核分枝杆菌适应性下降的情况，因此上述协同突变对提升利福平耐药菌的适应性具有重要作用。后续研究表明，大约30%的耐多药MTB菌株携带上述补偿突变，提示上述突变对耐多药结核病在人群中的传播具有重要意义。近期的分子流行病学研究表明，在耐多药MTB菌株中， rpoC 突变更易同时发生于新发结核病患者分离的菌株中，上述结果表明 rpoC 的补偿突变对提升耐多药结核病在人际间的传播能力具有重要影响。目前关于补偿突变的研究主要集中于利福平耐药 rpoB 突变后的补偿突变，其他药物是否也存在类似的机制尚不清楚。

四、展望

伴随着对耐药结核病发生机制认识的不断深入，将促进研究者研发更可靠的分子诊断工具，同时提高患者治疗效果。尽管现在已经对大多数抗结核药物的作用机制比较清晰，但关于耐药结核病的研究仍然存在诸多问题，主要表现在以下几方面：首先，仍然有少部分一线抗结核药物耐药菌株的耐药机制无法通过现有机制解释，探索外排泵、细胞通透性等多层次的原因将有利于全面理解结核分枝杆菌耐药；其次，部分二线抗结核药物以及新研发的诸多新药的作用机制仍是困扰人们的难题，伴随着全基因组测序及药物在临床中的使用，将逐渐阐明上述难题；再次，关于耐药MTB，特别是耐多药MTB耐药性以及适应性和毒力的相互关系，需要进一步流行病学试验及动物实验加以阐述，这将有利于评价耐药菌株在人际传播，从而制定有效的耐药结核病防控策略；最后，体外耐药机制与体内患者治疗效果的相关性还需要进一步确认，高质量的临床队列研究将为临床科学合理使用抗结核药物提供重要依据。

（逄 宇） +Ij27CqFYUnKaguWX2Z3NycqIHBEzziCUaPCzv/+gSEVXkopKtGJIDgAZL67GTRK