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术中快速组织活检是确定病变范围的重要手段。组织冰冻切片HE染色是常用的方法，可在游离肠管前或吻合前施行。对于有经验的病理医生而言，通过HE染色就可以作出有无神经节细胞的正确判断。此方法简单易行，花费时间不多，准确率较高，但对病理医生经验要求较高。有文献报道，HD患儿冰冻切片与石蜡切片符合率为89%；对304例HD患儿行700余次术中冰冻切片，诊断不符合率为3%。
术中取全层肠壁酶组织化学染色有助于提高诊断的准确性。常用的方法包括乙酰胆碱酯酶（AChE）染色、乳酸脱氢酶（LDH）染色、还原型辅酶1（NADPH）染色等。
AChE染色曾较长时间作为诊断和判断病变范围的金标准。在HD病变肠管中，AChE活性异常升高，通过AChE染色可看到胆碱能神经纤维大量增生，从而判断该部位正常与否。过去该流程要花费数小时，不能满足术中快速诊断的要求。有学者改进了染色方法，使染色时间缩短到6分钟，使术中快速诊断成为可能。但AChE既存在于胆碱能神经元也存在于非胆碱能神经元，假阳性率高，且在新生儿中易出现假阴性，所以目前较少单纯将AChE染色用于诊断HD。国内有学者联合应用快速AChE染色和冰冻切片HE染色来提高术中快速诊断的可信度。
LDH染色亦可清晰显示神经节细胞，且能显示其成熟度，区别发育良好和发育不良的神经节细胞，但无法显示神经纤维异常增生的情况。普通的LDH染色方法孵育时间长，达不到术中快速诊断的要求。改良LDH染色方法可于20分钟内在神经节细胞处产生蓝紫色的颗粒状沉淀物，可满足术中快速诊断的要求，且诊断结果与术后病理结果较吻合；结合AChE染色方法能准确、快速地判断出无神经节细胞肠段的范围。改良NADPH-d染色亦可在10分钟左右观察到神经节细胞的阳性染色反应，该结果可以用于术中诊断HD，评估狭窄段和移行段范围，可准确确认肠管切缘。
总之，不同染色方法在术中快速诊断中各有优点，也有不容忽视的局限性。最常用的方法还是HE染色，该方法作为病理检查的基础，各级医院均可开展，有条件者可以结合各种快速酶组织化学染色来提高诊断的准确性。目前，各种神经元标志物应用于肠神经节细胞的染色显示，结果判断更为直观，但这些标志物或因染色时间过长，或缺乏术中冰冻组织切片的染色特征，均不能满足术中快速诊断的要求。
（毛永忠）