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当新生儿临床表现为腹胀、胎粪排出延迟、胆汁性呕吐，年长儿表现为顽固性便秘时，应该考虑HD。虽然可以通过钡剂灌肠显示狭窄段、扩张段诊断或通过直肠肛管测压提示，但确诊还需通过对受累无神经节细胞肠壁的组织学检查。最常用的是直肠黏膜活检术，通过对直肠黏膜组织的活检，最重要的是对直肠黏膜下层组织的活检，并行相应的组织学染色提示有无神经节细胞，进而确定是否为HD。亦有学者认为直肠黏膜活检存在一定盲目性，活检的部位和标本厚度难以统一，而采用结肠镜专用活检钳，在直视下取组织，深浅度和部位较易控制，诊断更准确，有条件者可以采用。
最初负压吸引活检器械是由Noblett设计，包括一个带有3mm侧孔的头端钝性的管，侧孔距离吸力管顶端约1cm。在器械体部有显示活检深度的标记，有一个嵌入的压力计用来测量吸引压力。当器械插入直肠并打开吸力时表浅直肠壁就被自动卷入侧孔，触发隐藏的圆形刀片并完成活检。随着技术的发展，出现了其他活检器械，但均采用Noblett活检钳的原理。国产直肠黏膜负压吸引活检钳已逐渐在国内广泛采用（图3-16）。其特点是操作更为方便，刀头可拆、可消毒、可更换。
图3-16 国产直肠黏膜负压吸引活检钳
Rbi2直肠黏膜负压吸引活检系统目前在国内逐渐被各大医疗中心所采用（图3-17）。该活检系统包括头端的刀仓、手件及尾部的注射器和导管。该系统的特点为操作简便，头端的刀仓为一次性使用，避免了反复消毒造成的刀头变钝及可能出现的交叉感染；手件可完全拆开并进行消毒处理，安装也比较方便。该系统配有负压指示器，能够随时掌握操作过程中空针抽吸的力度，防止操作损伤，但缺点是价格较为昂贵。
图3-17 Rbi2直肠黏膜负压吸引活检钳
使用直肠黏膜负压吸引活检钳进行直肠活检是小儿外科的常见手术操作，并开始逐渐取代之前的开放式直肠活检技术和借助乙状结肠镜或窥器的活组织检查。使用该技术活检时，标本的每个部位都要有足够的黏膜下层附着，所以要注意操作细节，以便能获得有诊断价值的直肠黏膜标本。
行直肠黏膜负压吸引活检前，需与家属进行沟通，告知家属该操作的必要性及相关术后可能出现的并发症，并签署知情同意书。知情同意书内容包括检查的方法、特殊风险及家属需要注意的事项。对于年龄较大的患儿需由家属或护士耐心安抚，避免患儿的焦躁情绪影响操作。操作前需对患儿进行1次清洁灌肠，对于之前有造瘘的患儿同样需对造瘘口远端结肠进行1次灌洗，清洗并润滑肠道，便于负压吸引活检操作。
操作可以在病房，不需要麻醉的情况下实施。只要活检部位在肛管敏感区上方（新生儿距离肛门边缘超过2.5cm，年长儿超过3.5cm）即可无痛操作。
（1）新生儿通常取截石位，年长儿取左侧屈膝位。新生儿术前应补充维生素K 1 。将润滑的器械插入肛门并使侧孔初始位置在齿状线上方约2cm。诊断标本通常取自直肠后壁或侧壁。如果在前壁全层活检，会增加向腹腔直肠膀胱陷凹或直肠子宫陷凹穿孔的风险。
（2）通过回抽连接吸引管的20ml注射器，在不超过300mmHg（20～30cmH 2 O）的前提下，达到最大吸引压力。2～3秒后，刀片被激发，然后撤回器械。小心旋松负压吸引活检钳的头端并用针取出活检标本。标本大小通常约3mm×1mm，并且包含黏膜下层（呈明显的白色层）。然后在距离肛门缘3cm和6cm处的部位重复该操作。
（3）活检完成后应进行直肠检查以排除活动性出血，应仔细观察患儿至少1小时。
（4）活检材料通常放置在水平标记的湿润的滤纸或纱布上，在运送过程中需要避免干燥。如果行HE染色或免疫组化染色，则需将标本直接放置于福尔马林中固定。
有研究报道，对组织学证实为全层活检的406例患儿的1 340次连续活检中穿孔率约1%。虽然这些穿孔大部分可以通过抗生素、胃肠减压、静脉营养等保守治疗而治愈，但严重情况下需要手术治疗。
一般为黏膜出血，表现为大便带血，或少量血丝自肛门排出。在凝血功能正常的情况下，出血在操作当日即可自行停止。一旦出现流血不止的情况，可给予止血药物观察，需警惕肠穿孔出血。活检后1日内不宜清洁灌肠。
一般是由于活检后肠穿孔所致。
HE染色是石蜡切片技术中常用的染色法之一。对于有经验的病理医生来讲，如果直肠标本取材足够深或为直肠全层组织标本，通常可以作出正确的诊断。取材直肠黏膜较少或较浅，或对于非巨结肠专业的病理诊断医生而言，常需要借助一些特殊的染色方法来显示肠神经节细胞或神经纤维，以作出正确的术前诊断。
乙酰胆碱（ACh）是肠神经系统主要的神经递质。胆碱能神经可促进肠蠕动，如调节肠道的收缩活动、参与黏膜离子的转运等。AChE活性是胆碱能神经常用的标志物，由于该酶使HD无神经节细胞肠段的外源性神经纤维染色，多年来被广泛用于HD的诊断。在正常神经支配的肠黏膜组织，副交感神经节后纤维由于纤维纤细、数量较少或酶活性低等原因，胆碱能神经酶反应均为阴性；HD患儿病变肠段无神经节细胞，也无节后神经纤维，而其副交感神经节前胆碱能神经纤维明显增生，染色呈强阳性，由此差异可予以诊断。
HD病变肠段黏膜组织神经分布特征：肠黏膜内出现不同数量的AChE阳性副交感神经纤维，酶活性强，通常位于固有层靠近黏膜肌层处最为丰富，经肠腺之间向上延伸，有的可达肠上皮基础膜下方。
AChE染色亦有一定缺点。AChE既存在于胆碱能神经元，亦存在于非胆碱能神经元，具有较高的假阳性率。此外，年龄较小的HD患儿黏膜下神经丛的神经节细胞尚未成熟，固有层和黏膜肌层增生的神经纤维有时不易检出，有假阴性可能，对新生儿HD诊断准确率较低。活检部位不同、酶系统发育不成熟及病理医生的技术差异均可能导致错误的AChE检查结果，临床实验室通常较少使用该染色方法。
CR是钙结合蛋白中较为重要的一种，分子量为29×10 3 g/mol，属于“EF-hand”家族中的一种。CR最早由Rogers于1987年从鸡的视网膜基因中被克隆发现，故得名。后被证实存在于中枢神经系统和外周神经系统，“EF-hand”家族中的钙结合蛋白是可标记中枢和外周神经系统神经元的敏感神经标志物。
近年来，越来越多的研究证明CR作为神经节细胞及神经纤维的标志物，可作为诊断HD的病理性标志物。CR用于诊断HD具有诸多特点。研究表明，HD痉挛段的固有层、黏膜下层、黏膜肌层CR染色均为阴性，而在HD有神经节细胞段及非HD患儿肠管各层CR染色均为阳性，CR染色用于HD的诊断具有特异性和敏感性高的特点。其次，CR检查为显色反应，结果的判定相对容易，对病理医生经验要求相对较低，各观察者间易达成一致。对于有经验的病理医生来讲，CR诊断HD阳性预测值、阴性预测值、敏感性、特异性均为100%；对于经验不丰富者，CR诊断HD的阳性预测值、特异性分别为97.6%和93.3%。
另外，CR染色对标本的要求低，当直肠黏膜活检标本不含神经节细胞或取材不足时，CR染色仍能通过神经纤维是否染色间接提示是否存在神经节细胞，减少直肠黏膜活检假阳性率的发生，避免误诊。CR染色还具有操作简单、无须冰冻切片等优点。鉴于CR染色的上述特点，越来越多的临床医生将直肠黏膜活检CR染色广泛用于HD的临床术前诊断。
当直肠黏膜活检取材足够深，或行直肠全层活检时，CR染色能够更好地显示肌间有无神经丛和神经节细胞，以明确诊断。
S-100蛋白属于钙结合蛋白中的一个大的亚族，存在于许多神经和非神经组织的细胞质和细胞核。S-100多表达于肠神经丛的神经胶质细胞和施万细胞内，是神经元周围成分标志物，而神经节细胞S-100蛋白无阳性表达，因此，S-100免疫组化表现为未被染色的神经节细胞周围环绕着染色阳性的施万细胞，神经节细胞为特征性的细胞样“空白区”。S-100抗体和PGP9.5抗体都能检测到HD无神经节细胞肠段黏膜层的神经纤维，但S-100免疫染色更加灵敏。
脑特异性蛋白PGP9.5是一种识别神经节细胞的最敏感性标志物之一，已经成为标记肠黏膜及黏膜下层神经节细胞和神经纤维的一种可靠标志物。PGP9.5染色比NSE染色神经节细胞的着色深，且PGP9.5对神经纤维的染色比S-100深。通过免疫组化方法评估石蜡切片中PGP9.5阳性神经纤维的数目，发现HD患儿肠平滑肌PGP9.5阳性神经纤维的数量显著减少。PGP9.5能够使正常肠管肌间丛和HD患儿增生的神经纤维明显着色。PGP9.5抗体适用于无神经节细胞肠段的全组织包埋切片。
NSE特异性分布于哺乳动物神经组织的神经元。当神经元开始其特异性代谢和突触活动时随即表达NSE，因此，NSE是神经元发育成熟的标志物，并可作为识别肠道神经节细胞的标志物。应用直肠活检标本的NSE免疫组化染色检查，有助于神经节细胞减少症和肠神经元系统发育不良的诊断。有报道表明，用NSE免疫组化染色检测神经节细胞的阳性率低于PGP9.5。HD狭窄段由于神经节细胞缺如，NSE染色神经节细胞为阴性。
CAD是溶酶体酸性蛋白酶家族成员之一，在细胞内的蛋白质分解代谢中发挥重要作用。CAD可分解P物质、生长抑素、β脂蛋白、血管紧张素原等神经肽类物质。人类肠黏膜下神经丛和肠肌间神经丛的神经节细胞，无论成熟还是未成熟，其胞质内都存在CAD染色阳性的粗大颗粒状物质。HD无神经节细胞肠段CAD免疫组化染色未见阳性细胞，增粗的神经纤维也无CAD阳性染色。因此，对神经节细胞（成熟或未成熟）CAD染色，对HD诊断有一定的价值。
由于神经细胞可以通过LDH反应被选择性地染色，故应用LDH酶联组织化学染色可以确定黏膜下神经丛内神经节细胞的缺如，因此，不进行合适的脱氢酶反应，就有可能作出假阳性或假阴性的诊断。常规使用LDH和琥珀酸脱氢酶（SDH）染色法可以使黏膜下和肌间神经丛的神经节和神经细胞着色，这就能够在有HD症状的患儿发现结肠神经细胞分布的其他异常。
利用还原型辅酶1（NADH）或LDH反应能够快速判定肠肌间神经丛并可以在结肠切除术中完成，这对外科医生术中判断已切除肠管边缘是否包括异常或正常神经分布很重要，在术中进行如此快速的检查，神经染色强度能被连续监测并且仅需最短时间即可作出可靠诊断（8～10分钟）。与免疫组化相比，酶组织化学法操作灵活性且能更快得出结果，如今酶组织化学试剂盒已经商品化（瑞士Districhem和意大利Bio-Optica）。
除上述染色方法外，其他神经标志物包括外周蛋白、神经细胞黏附分子、神经生长因子受体、神经肽Y等，但多数标志物仅供实验研究使用，临床上未广泛用于HD的术前诊断。
HD的组织学诊断主要是寻找有缺陷的肠神经。许多抗体的特异性强，且大多数在内源性和外源性的神经纤维中都表达。内源性神经纤维的表达有助于HD的诊断，而外源性神经纤维则对HD的诊断非但没有帮助，而且有混淆作用。
当黏膜活检标本过小、取材过浅时，黏膜下层组织较少或无黏膜下层组织，无法看到黏膜下层的神经节细胞，通过HE切片很难作出明确诊断。在此情况下，AChE染色可以协助诊断，但需要有一定经验的病理医生予以正确判断。PGP9.5内源性和外源性神经纤维均染色，而组织蛋白酶D内源性和外源性神经纤维均不着色，均无法用于此种情况下的诊断。NSE主要标记成熟的神经节细胞，主要用于神经节细胞减少症和肠神经元系统发育不良的诊断；S-100主要对神经胶质细胞染色，对黏膜下神经纤维亦可染色，但不能染色神经节细胞。
多数学者研究认为，在此情况下，CR染色是一种较理想的诊断方法。虽然活检组织切片中未见神经节细胞，但由于有神经节细胞的肠壁存在内源性的神经纤维末端，这些神经纤维CR呈阳性。所以只要CR染色发现阳性纤维，则提示肠壁有神经节细胞，可以排除HD；无阳性纤维时，提示肠壁无神经节细胞，支持HD的诊断。国内外研究表明，CR免疫组化染色在HD诊断中敏感性和特异性优于AChE染色，操作简单，评估方便准确，是一种值得推广的诊断HD的免疫组化试剂。近年来有学者推荐CR染色作为直肠黏膜活检诊断HD的首选方法。
（毛永忠）