下载掌阅APP，畅读海量书库
立即打开
HD发病的本质即基因突变导致ENS发育缺陷，过去20余年科学家们对HD相关的遗传变异进行了深入研究。1992年，意大利研究团队鉴定出第1个HD易感基因—— RET 基因，并被后续大量研究所证实。 RET 信号通路在ENS的发育过程中极为重要，影响ENS形成的多个方面。约50%的家族性及1/3的散发性HD存在 RET 编码区的突变。1994年，Puffenberger发现另一个基因 EDNRB 在ENS发育过程中也发挥重要作用，以往认为EDNRB通路是独立的信号通路，现发现其与RET通路存在交互作用，仅5%的HD患儿携带 EDNRB 基因杂合子突变；而其他与HD相关的基因突变更加少见，有时仅见于1个家族。随着研究的进一步深入，新的相关基因在不断被发现。
作为HD高发生率国家，我国科学家在HD基因方面的研究取得了瞩目的成就，谭广亨团队在这方面的工作尤为突出。缪小平等通过病例-对照关联研究，发现 PHOX2B 基因 IVS2 + 100G ＞ A 明显增加HD的患病风险。2009年，谭广亨团队通过全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）在我国人群中发现1个新的HD易感基因 NRG1 ，其单核苷酸多态性位点rs7835688［优势比（odds ratio， OR ）=1.98］和rs16879552（ OR =1.68）与HD发病密切相关。然而荟萃分析显示中国人群 NRG1 常见的单核苷酸多态性位点（rs7835688，rs16879552），与欧洲人群HD并无明显关系，反映出了HD遗传背景的种族差异。其后汤绍涛等通过病例-对照分子流行病学研究证实，位于 NRG1 基因的单核苷酸多态性位点rs2439302与我国人群HD发病风险明显相关。动物实验（以斑马鱼为模型）显示敲低 NRG1 后肠神经元从头端至尾端的迁移过程受阻，并且影响了迷走神经纤维由肠道近端向远端延伸过程。
通过对1个国人HD家系（母子均患病）进行全外显子测序并运用疾病网络分析研究，发现 NRG 家族的另外一个基因 NRG3 亦与HD发病关系密切。姜茜等通过GWAS研究，发现轴突导向因子 SEMA3C/SEMA3D 在ENS发育过程中起着关键作用，其单核苷酸多态性位点rs11766001、rs12707682变异明显增加HD的患病风险。进一步研究发现， SEMA3C/SEMA3D 错义突变严重影响其蛋白的表达量而妨碍蛋白功能的正常发挥，从而引发HD表型。蔡威团队通过病例-对照模型定点研究了 PTCH1 基因与我国汉族人群HD患病风险的关系，发现该基因单核苷酸多态性位点rs357565、rs2236405与我国人群罹患HD相关。
最近谭广亨团队联合中国和越南10多家医院，应用443例短段型HD标本采用全基因组测序，发现 BACE2 基因突变与HD发病相关。李爱武等认为，HD是基因异常与肠壁微环境异常共同作用的结果。研究表明，Neuroligin-I与Neurexin Ⅱ表达失调可影响ENS发育，导致HD表型。
2代测序的发展为HD易感基因的研究提供了有力手段。最近谭广亨及唐维兵团队相继通过全外显子测序发现新的HD易感基因 DENND3 、 NCLN 、 NUP98 、 TBATA 、 COMT 和 ARVCF ，并通过细胞或动物模型进行了功能验证，具有很好的临床应用前景。此外，唐维兵等对miRNA（非编码基因）在肠神经嵴细胞迁移、分化的影响方面做了大量卓有成效的研究。夏慧敏团队历时10年，收集了1 470份HD患儿样本，同时收集1 473例正常患儿样本作为对照，通过基因组关联性研究，发现了HD新的易感基因 IRAK1 ，初步功能验证表明该基因可能与 RET 相互作用调控ENS的发育。同时，该团队利用2 943例病例对 RET 基因的16个易感位点在中国人群进行了验证。
通过HD病变组织与正常组织基因表达差异来确定HD易感基因也是目前的研究方向之一。金先庆等发现，HD痉挛段 HA117 mRNA表达明显增高，该基因与HD发病高度相关。江逊等利用RNA芯片技术，通过差异筛选法筛选出HD相关基因 PTPRR ，后期功能实验发现，该基因对于维持ENCC处于干细胞状态至关重要。高亚等通过优化生物信息分析流程，从RNA芯片数据中筛选出HD相关的候选基因（ FOS 、 EGR1 、 ATF3 、 NOS1 、 CCL5 、 DUSP1 、 CXCL3 、 VIP 、 FOSB ），为进一步功能验证奠定了基础。我国学者对HD患病基因的研究对推动HD的防治作出了巨大贡献。
对HD遗传变异的深入研究给该疾病的基因治疗带来了新的契机。迄今为止，已确定15个以上基因与HD的发病密切相关，分别有 RET 、 EDNRB 、 GDNF 、 ECE1 、 GFR α 1 、 NRG1 、 PHOX2B 、 NRTN 、 TCF4 、 SOX10 、 EDN3 、 NTN 、 PSPN 、 ZFHX1B 、 L1CAM 、 Semaphorin 3C/D 等。这些基因主要编码与ENS发育相关的配体、受体、转录因子及细胞外基质的关键成分。如果能使远端无神经节细胞的病变肠管重新获得神经支配，并形成有效的蠕动，那么肠道将恢复正常的功能。目前已有大量文献从干细胞及组织工程层面通过体外实验及动物模型进行研究，试图通过引入具有正常遗传背景的肠神经干细胞或体外培育的肠道类器官来修复替代病变肠管，从而达到完全治愈HD的目的。
HD的基因治疗首先要解决的问题是获得肠神经干细胞，即“种子细胞”。1992年，Stemple等首次从小鼠胚胎分离出一种p75+的神经嵴细胞（enteral neural crest cell，ENCC），该细胞亚群具有自我更新及多向分化能力，能分化为肠神经元及神经胶质细胞，因此，被称作肠神经干细胞，也叫ENCC。随后的研究着重通过优化筛选特异性的表面标记从迁移后的ENS细胞谱系中分离出ENCC，然后加入特殊的生长因子诱导得到感兴趣的细胞。
在能够获得足够数量的ENCC后，研究者开始将目光投向HD的细胞替代治疗。细胞移植的初期实验主要为向培养的小鼠胃肠道组织注入少量干细胞，然后观察其生物学行为。研究表明，无论是野生型小鼠，还是Ret -/- 无神经节细胞小鼠，其胚胎原始胃基壁内注入Ret + ENCC后均可分化为神经元及神经胶质细胞。进一步的体内移植实验证实，向出生后的 SOX10 缺陷无神经节小鼠肠壁注射ENCC，7日后在黏膜下层找新生的神经节细胞，为HD的细胞治疗带来了希望。
2009年，Metzger等通过内镜获得健康小儿肠道黏膜组织，并从中分离出ENCC，将得到的ENCC通过显微注射到鸡的无神经节细胞肠壁，与对照组相比，其肌间及黏膜下形成了大量的神经丛。随后，研究者对HD患儿的切除肠管进行了体外组织培养，随后将ENCC移植到培养的组织中。结果发现，数日后移植组的病变肠管组织内以ENCC细胞球体为中心开始出现神经发生，1周后新生的神经元之间出现广泛的神经连接并形成神经丛。该研究的意义在于从人体肠道黏膜组织获得ENCC，为将来HD细胞治疗真正进入临床奠定了基础。
然而，异体细胞体内移植面临一个最大的问题，即免疫排斥，这一问题也出现在动物模型。最理想的方式是从患儿自身有神经节细胞的肠段提取ENCC作为“种子细胞”。但由于HD患儿携带突变基因，这些突变同样存在于提取的ENCC中，很大程度上可能影响其形成ENS的能力。近年来兴起的 CRISPR/Cas9 基因编辑技术为解决这一难题提供了新的手段。研究人员从1例TCA患儿身上诱导多能干细胞系，该细胞系存在 RET G731del 突变；又从2例无 RET 突变但存在 VCL M209L 突变的典型HD患儿身上诱导多能干细胞系，以 IMR90 作为对照细胞系。然后利用基因编辑技术修复干细胞系中存在的 RET G731del 和 VCL M209L 突变。结果发现，修复后的ENCC恢复了分化迁移的能力。该研究突破了异体移植带来的免疫排斥相关问题。
目前，另外一个前沿技术是通过组织工程技术在体外培育肠道类器官，然后通过整体器官移植的方式替代HD病变肠管。该方法适合于长段型HD或TCA，而干细胞移植主要适合于短段型HD，二者可互为补充。
相关基因的基础研究让我们对HD有了更深入的理解。展望未来，或许可以在明确HD患儿突变基因的情况下，通过基因编辑技术修复突变基因，然后通过细胞移植或组织工程肠道移植的手段治愈HD，真正做到精准、无创。
（汤绍涛）