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诸多因素对消毒效果起到了促进或制约的作用，认识这些因素，掌握其作用规律及影响程度，对消毒方案的制订和消毒效果的保证具有重要意义。影响消毒效果的主要因素包括以下内容：
消毒剂量包括消毒因子的强度和作用时间两个因素，是杀灭微生物的基本条件。“强度”一词，在热力消毒中指温度；在紫外线消毒中指辐照强度；在电离辐射消毒中指剂量率；在化学消毒中指消毒剂的浓度。“作用时间”指处理方法对微生物作用的时间。一般来讲，强度越高，微生物越易死亡；时间越长，微生物被杀灭的概率越大。强度和时间的关系相辅相成，消毒因子强度增加，杀灭速度随之增加，因而，作用时间可以相应减少。作用强度减弱，杀灭速率降低，因而可通过延长时间来补偿。但任何消毒因子都有发挥作用的最小强度和最少时间。因此，在实际消毒中，必须明确消毒因子的强度和时间，并在操作中充分保证，才能达到预期的消毒效果。
多数消毒因子会随着温度的升高而增加对微生物的作用强度。在热力消毒法中，无论是干热还是湿热，随着温度升高，微生物杀灭速度都会加快。对于化学消毒法，温度提高，增加了消毒剂的扩散和渗透速度，及其与微生物蛋白或酶的化学反应速度，因而能够提高灭菌的程度和速度。
消毒效果受空气湿度的影响因方法不同而异。对于紫外线消毒法，相对湿度较大时，不利于紫外线的穿透，可减弱消毒效果。而对于粉剂喷洒消毒则需要在消毒对象或环境湿度较大的条件下进行，因为湿度有利于药物迅速潮解并发挥作用。随着空气湿度降低，空气中微生物的存活率会降低，这有利于提高空气过滤法的除菌效果。
多数细菌适宜生长在中性及微碱性（pH=6～8）环境下，霉菌和酵母菌可在pH=4～6的环境下生长。pH降低（pH<5），可削弱微生物对热的耐受力。不同消毒剂其稳定和发挥作用的最佳pH环境也不一样。例如，季铵盐类消毒剂在碱性溶液中作用较大，也更稳定。戊二醛在酸性条件下稳定，在碱性环境中杀菌力强。
是指存在于消毒物品中，阻碍或干扰消毒剂灭活作用的化学物质。当一些蛋白质、油脂等有机物包裹在微生物表面，会妨碍消毒因子的穿透，使其不能达到理想的消毒效果。这些有机物还会和次氯酸、过氧乙酸等氧化型消毒剂发生化学反应，使真正作用于微生物的消毒剂浓度不足，因而影响消毒效果。对于此类拮抗剂，有条件的可将污染物品清洗后再进行消毒或灭菌。
此外，对于化学消毒法，还可有其他拮抗物质。例如，季铵盐类消毒剂的作用可被肥皂或阴离子洗涤剂中和；次氯酸盐的作用可被硫代硫酸盐中和；过氧乙酸的作用可被还原剂中和。这些现象在消毒处理中都应避免发生。
不同消毒因子的穿透能力不同，达到的消毒效果也有区别。例如，电离辐射可穿透多种物质作用到物品内部深处，而紫外线只能作用于物体表面或浅层液体中的微生物。干热法的穿透能力比湿热法差；碘酊进行皮肤消毒时，穿透皮肤油脂层的能力强于碘液。因而，使用不同消毒方法应注意穿透条件，尽可能让消毒因子更多地接触到微生物，发挥作用。其实，消毒过程中，消毒因子穿透时间远大于杀灭微生物所需的时长，在某些消毒环境下，甚至需要十几至数十小时，才能达到消毒灭菌的效果。因此，在热力消毒过程中，物品不宜包扎太大、过紧；日光暴晒时，应将衣物摊开或挂起；化学消毒粪便、痰液时，应注意将药物与之搅拌均匀。
以蒸汽或气体形式发挥作用的消毒因子，其效果受消毒器内部压力的影响。某些消毒器在运行过程中需要负压，如环氧乙烷灭菌柜、预真空压力蒸汽灭菌器等，其负压程度越高，意味着空气残留越少，环氧乙烷或高温蒸汽的穿透力越强。在湿热消毒灭菌时，气压越高，水的沸点越高，水蒸气的温度越高，灭菌时间越短。但如果压力蒸汽灭菌器中的冷空气未排净，虽然压力达到要求，但可因热空气的穿透力不如水蒸气的穿透力强而降低湿热灭菌法的灭菌效果。
消毒剂的表面张力越低，杀灭微生物的作用越强。选用表面活性剂复配可增进消毒效果。因为表面活性剂可降低消毒液在微生物表面上的张力，有利于增大药物与微生物的接触面，从而促进杀灭作用，增进消毒效果。例如：用乙醇配制的碘酒比水配制的碘液表面张力低，在含氯消毒剂中加入表面活性剂、苯酚溶液中加入某些湿润剂、氯代二甲酚溶液中加入少许饱和脂肪酸肥皂，都可提高消毒效果。
微生物污染程度越高，数量越大，消毒就越困难。微生物彼此重叠，加强了机械保护作用，并且耐力强的个体也随之增多。因此，需要加大消毒剂量，增加消毒因子作用强度或作用时间来保证消毒效果。
微生物对消毒因子的抵抗力决定于其理化性质和遗传因素。不同种类的微生物或是同种但非同株的微生物对消毒因子的耐受力是不一样的。例如：在热力消毒中，甲肝病毒在56℃，湿热30min，或煮沸1min可被破坏其传染性，而乙肝病毒在85℃加热60min才能被杀灭。因此，要根据被杀灭微生物对消毒因子的耐受力，有针对性地选择合适的消毒灭菌条件。