下载掌阅APP，畅读海量书库
立即打开
甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV），1982年归类于小 RNA 病毒科的肠道病毒属，定为肠道病毒72型。随后研究发现，HAV的生物学特性与肠道病毒属差异较大：①HAV基因组G+C为38%，而肠道病毒为46%；②HAV基因组序列和多肽氨基酸序列与肠道病毒属的差异较大；③HAV复制周期很长，在细胞培养中增殖需要数周，而肠道病毒仅需数天；④HAV在60℃稳定，而肠道病毒不稳定。因此，1991年在小RNA病毒科中建立一个新的属，称为肝病毒属（ Hepatovirus ）。将HAV归为该属仅有的一个种，即肝病毒。有人将 Hepatovirus 译为嗜肝病毒，但“Hepato”仅表示“肝”，并无“嗜肝”意思。
HAV颗粒为圆球形，直径为27～32nm，无包膜，呈二十面体立体对称。电镜下可见空心和实心两种颗粒存在。实心颗粒为成熟的病毒颗粒，由衣壳蛋白和RNA基因组构成。空心颗粒是不完整的病毒颗粒，为空心的衣壳，不含核酸，仅含衣壳蛋白。衣壳上含有12个五聚体。
成熟的病毒颗粒在CsCl溶液的浮力密度为1.33g/cm 3 ，在蔗糖溶液中的沉降系数为150～160s。病毒粒子的核酸含量为29%，不含脂类。空心颗粒的浮密度为1.29g/cm 3 ，沉降系数为75～90s。
HAV的抵抗力比其他小RNA病毒更强。耐酸、耐碱（在pH值2～10稳定）、耐乙醚，耐热（60℃ 4h不能完全灭活，80℃ 5min可以完全灭活）。Mg 2+ 或Ca 2+ 可增强HAV对热的抵抗力。煮沸20min，干烤（160℃ 1h），高压蒸汽灭菌，甲醛（1：4000）37℃ 72h，氯（1mg/L）30min，均可灭活病毒，70%的乙醇迅速灭活病毒。HAV对紫外线照射敏感，依照射条件的不同在1～5min内可完全灭活。-20℃贮存数年仍保持其感染性。HAV能抵抗2%～5%来苏尔（甲酚皂溶液）来苏儿和200ppm的有效氯达1h以上，因此常规饮水消毒要考虑氯的有效含量和作用时间。曾发现含HAV的矿泉水置室温300天后，HAV仍具有感染性。
HAV的宿主范围局限于人类和数种非人类灵长类动物，不可能在除了灵长类动物以外的脊椎动物中播散。对HAV敏感的非人类灵长类动物有几种猴和类人猿。在捕获的非人灵长类动物，包括大类人猿（黑猩猩）以及数种旧大陆猴和新大陆猴［旧大陆食蟹猴（Old World cynomolgus）、非洲黑绒猴（African vervet）、短尾猕猴（stump-tailed）和新大陆猴（New World monkeys）］，发现HAV自发感染。在新捕获的上述猴子中存在HAV抗体，提示在其自然群落可能存在HAV感染的播散。自发感染猴的HAV分离株的抗原性与人HAV密切相关，但其基因组存在显著的差异。至少有4种独特的猴HAV毒株，它们各不相同且与人HAV分离株也不同，提示每种HAV只感染某一特定的宿主，反映了HAV毒株与其灵长类宿主的进化关系。
在原代非洲猴肾细胞、人胚肾细胞，传代猴肾细胞、人成纤维细胞和人肝癌细胞等，HAV可进行增殖和传代。Takeda-Y等发现小鼠细胞系NIH/3T3能支持HAV的增殖。HAV的初次分离在细胞培养增殖中缓慢，不阻断宿主细胞的大分子合成，一般不产生细胞病变（cytopathogenic effect，CPE）。但分离病毒经在细胞培养传数代适应后，可出现快速增殖及产生CPE的变异株。现已获得了数个细胞培养适应的能产生CPE的HAV毒株。如巴西学者将巴西HAV分离株HAF-203在FRhK-4细胞上连续传代8次，获得快速增殖的毒株。在第3代时，感染后21天，HAV RNA达到最大量，但HAV抗原仍为阴性。到第7代时，在感染后第7天时出现最大量的HAV RNA和抗原。第8次传代后14天，细胞出现明显形态学改变。日本学者将来自HAV感染的黑猩猩肝脏10%匀浆和急性甲型肝炎的粪便标本的HAV，在细胞系JTC-12.P3增殖成功。JTC-12.P3源于狨猴肾细胞，适宜在无血清、无蛋白的化学合成培养液生长。在溶酶体泡，HAV颗粒以串状形式存在，在细胞质呈游离晶格状排列。最初2次传代，HAV增殖需要至少8周时间，但随着传代次数的增加，所需增殖时间缩短。在培养基中加入0.1%的无HAV抗体的血清或前列腺素E 1 促进HAV增殖。
新近发现，保留许多分化功能的人小肠上皮细胞能够支持HAV的增殖，并释放大量的子代病毒，但不产生CPE。
HAV不阻断宿主细胞的大分子合成，有关致细胞病变的产生机制的研究结果并不一致。意大利学者发现，HAV分离变异株的2A蛋白通过对帽状结构依赖翻译的抑制，阻断宿主细胞的蛋白合成。然而HAV HM175株能够产生CPE的后代并不妨碍宿主细胞的代谢。另外，3A蛋白的变异也与CPE的产生有关。总的说来，HAV的细胞适应和产生细胞病变与HAV基因组的整个5'端非翻译区和P2、P3区的许多突变有关，因此，CPE的产生与HAV复制的总的效率有关。
最近有两项关于HAV CPE株引起细胞凋亡的研究报道。瑞士学者发现，在感染后期以及细胞培养死亡前，大量HM175/24a感染细胞呈现典型的细胞凋亡迹象，认为HM175/24a感染的细胞死亡为细胞凋亡所介导，而非细胞病理学所致。德国学者发现HAV cyt/HB1.1 诱导FRhK-4细胞的凋亡。
用于研究HAV基因组的是野毒株HM-175，该毒株分离自澳大利亚的一次急性暴发流行，随后在狨猴进行了3次传代，用于cDNA克隆的HM175是从患有急性肝炎的狨猴肝脏纯化的，从未进行过细胞培养。HAV基因组长度为7478bp，为单股线状正链RNA，由1个5'端非编码区（NCR）、1个开放阅读框（open reading frame，ORF）和1个3'-NCR 组成，还带有1个 poly（A）尾。HAV HM175株的核苷酸组成为：2188A、2459T、1202C、1629G，G+C 含量很低，仅为38%，低于其他小RNA病毒。5'端非编码区的G+C含量为47%，高于基因组的其他区域。
5'端非编码区（5'-noncoding region，5'-NCR）是 HAV 基因组的起始区，又称非翻译区（nontranslated region，NTR；untranslated region，UTR），全长为734bp，约占整个基因组的1/10。5'-NCR不仅片段长度很长，而且具有高度有序的结构，在HAV基因组的翻译过程中具有重要作用。翻译的起始是5'端非编码区的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry sites，IRES）直接与40S核糖体结合。通过HAV在不同细胞株的适应生长发现5'端非编码区的序列对决定病毒宿主细胞的范围有着至关重要的作用。HAV的快速生长和5'-NCR以及2B、2C区的突变有着很大的关系。另有研究表明，即使仅仅在5'-NCR存在突变就可使HAV快速复制。
P1区可进一步分为1A、1B、1C、1D 4个区，分别编码4种病毒衣壳蛋白。1A（nt735～803）编码 VP4，1B（nt804～1469）编码 VP2，1C（nt1470～2207）编码 VP3，1D（nt2208～3107）编码VP1。HAV颗粒的4个衣壳蛋白由VP1～VP4组成，其中VP1最大，VP2和VP4则是由共同的前体VP0中派生出来的，VP2有一丝氨酸残基，VP0被催化裂解成VP2和VP4，是小RNA病毒成熟的最后一步。
P2区编码3种非结构蛋白，即2A、2B和2C。
VP1-2A是嗜肝病毒所特有的。它与VP0和VP3相结合形成HAV颗粒形态发生的第一个中间体即五聚体，随后在形态发生的后期，VP1-2A被加工为成熟的VP1衣壳蛋白。
HAV 2B、2C、2BC具有与细胞内膜结合的特性，诱导这些膜结构重排，显著提高细胞膜通透性。HAV 2C和2BC属于整合膜蛋白，而2B以周围蛋白的形式和细胞膜结合。对于2B和2C有效释放到作为HAV RNA复制位点的细胞膜上，需要2BC和3ABC的作用。2C对细菌的生长和蛋白合成有抑制作用，但对宿主细胞的蛋白合成的影响仍不清楚。这两种蛋白在病毒RNA复制过程中具有重要作用，并且在宿主依赖过程中有重要意义。
HAV P3区编码3A、3B、3C和3D蛋白。3A蛋白的一段21个疏水氨基酸残基锚定细胞膜。致细胞病变的HAV FG株的3A蛋白可引起对大肠埃希菌细胞膜的穿孔和通透性改变，这一作用依赖于其N端和C端的带电荷氨基酸。3B蛋白为病毒基因组连接蛋白（viral genome-linked protein，VPg）。该蛋白又称引物蛋白（primer protein），与病毒基因组的5'-NCR的5'端结合，具有启动病毒RNA复制的作用。3C蛋白是HAV编码的唯一的蛋白加工酶，将HAV基因组编码单一的多聚蛋白进行剪切加工成为具有功能的结构和非结构蛋白。HAV 3D蛋白与其他小RNA病毒的3D蛋白具有很高的氨基酸序列同源性，是RNA依赖的RNA聚合酶。
3'-NCR位于编码区之后，长度为63个核苷酸，后接一多聚A尾，可能与HAV RNA的稳定性有关。
HAV主要通过粪-口途径传播，且该病毒耐酸，因此它有可能经过胃，并在肠的较低部位复制，然后转运到肝脏——复制的主要场所。与其他小RNA病毒一样，HAV是一种器官特异性极强的病毒。
病毒吸附在敏感的宿主细胞表面是启动感染的第一步，也是决定病毒感染成功与否的关键环节。HAV的吸附依赖病毒表面的特异性吸附蛋白与易感细胞表面的受体的相互作用。病毒进入宿主细胞的过程，即病毒侵入，是病毒感染的第二阶段。病毒感染性核酸从衣壳内释放出来的过程称为脱壳。小RNA病毒的脱壳与侵入是同步进行的，毒粒表面的吸附蛋白与细胞受体结合后，随即引起毒粒发生构型改变和衣壳膨胀，并导致VP4脱离毒粒，VP1暴露出疏水性的N末端，于是VP1的疏水性N末端与细胞膜相互作用构成膜通道，并由这一膜通道释放病毒基因组RNA到细胞质中。HAV虽然是小RNA病毒，但可能有不同的侵入方式，可能通过受体介导的细胞内吞实现侵入。HAV在感染后4h发生毒粒的脱壳。细胞内吞所形成的酸性环境，或者在钙离子的介导下（钙离子在体外能使HAV颗粒不稳定），使HAV暴露出疏水基团，造成病毒构型的变化，引起脱壳，释放出病毒RNA基因组至细胞质中。如上所述，HAV基因组5'端连接有病毒蛋白VPg，这种病毒特异性蛋白对稳定病毒核酸构型、保护病毒核酸免遭细胞内的核酸酶的破坏以及随后的转录起始都是非常重要的。
HAV基因组RNA能够直接作为编码合成蛋白质的模板即mRNA，属于是正单链RNA（+ssRNA）。HAV基因组的复制过程先以病毒基因组RNA为模板，复制形成互补的负单链RNA（-ssRNA）。再由-ssRNA合成子代+ssRNA。新合成的子代+ssRNA具有3种功能：①作为mRNA进行翻译，产生更多的病毒蛋白；②作为模板合成-ssRNA；③作为子代病毒基因组进行包装。HAV基因组复制和衣壳蛋白合成后，装配成病毒颗粒，释放至细胞外。
目前已知HAV只有一个血清型，但通过HAV基因序列分析，发现有若干基因型。1991年Robertson用HAV VP1区的247个碱基的不同片段作为分段标准，将来自世界不同地区的22株HAV分为3个基因型（Ⅰ～Ⅲ型）。继之1992年他又对全球29个国家的152株HAV进行分型，以VP1/2A连接区（含168个核苷酸）的不同序列作为基因型分类标准，结果发现HAV可以分为7个基因型（Ⅰ～Ⅶ型）。其中人类HAV（hHAV）有4型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型），非人灵长类HAV（sHAV）也有4型（Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型）。Ⅲ型为hHAV与sHAV所共有。此外，Ⅰ型和Ⅲ型还可以分为2个亚型，即ⅠA和ⅠB，ⅢA和ⅢB。
我国属于HAV高流行区，基因型分布为ⅠA亚型，由于分型株数尚少，是否存在其他基因型和亚型尚不清楚，有待进一步研究。
HAV的变异主要有自然变异、细胞培养变异及减毒变异。HAV自然变异常发生在HAV衣壳蛋白区的一些高度变异的氨基酸位点上。HAV野毒株在自然复制过程中在上述位点发生基因变异，并可以逃避某些单克隆抗体的中和作用。主要发生在P1区，其中VP1和VP3区变异较多见。HAV氨基酸的变异常发生在VP3的65、70和VP1的102、105、174、178和221位，而VP3的70位几乎在所有的HAV株中都存在变异。Funkhouser等将在非洲绿猴肾（AGMK）细胞上培养生长的HAV-175株，转种到MRC-5细胞上培养，然后进行核苷酸序列比较分析，发现该转种株（适应株）有13个核苷酸发生变异。其中有4个在5'非编码区，9个在编码区，Cohen等对HAV野毒株HM-175和减毒株HM-175/7MK5的cDNA核苷酸序列进行比较，发现有24个核苷酸发生变异，并导致12个氨基酸发生了变异。其中5'非编码区有7个核苷酸发生变异，P1、P2和P3区分别有3个、8个和5个核苷酸发生变异；3'端非编码区有一个核苷酸变异，因而认为HAV的减毒是由于其基因组中相对小量的核苷酸改变所致。
（林旭）