第二十章
实验室诊断

第一节　生物化学诊断

肝脏疾病相关的生物化学检验具有无创、简便、快速、经济、有效等特点，成为病毒性肝炎诊断不可或缺手段，在临床诊疗中具有重要作用。

一、肝脏功能

肝脏是人体最大的消化腺，具有合成蛋白质、储存糖原、生物转化等重要功能。肝脏由实质细胞（肝细胞）和间质细胞组成。间质细胞主要包括肝窦内皮细胞、Kupffer细胞（即肝内单核巨噬细胞）、肝星形细胞（也叫贮脂细胞、窦周细胞、Ito细胞、脂肪细胞）、胆管上皮细胞和大颗粒淋巴细胞（又名隐窝细胞或Pit细胞，具有NK细胞活性）。每一类细胞对于肝脏发挥功能都是不可或缺的。广义的肝功能可定义为调节血中溶解物浓度，进而影响其他器官如脑、心脏、肌肉和肾脏的功能。这种调节，主要通过吸收、代谢、转化、贮存，进而重新合成、分泌各种内源性和外源性溶解物才能实现。

（一）肝细胞

肝细胞是组成肝小叶的主要细胞，属高度分化细胞。肝小叶横切面上可见放射状排列的肝细胞板（肝板）和肝血窦（图5-20-1）。

（二）胆汁生成

胆汁成分包括水、电解质、有机阴离子、脂类、蛋白质、多肽和氨基酸等（表5-20-1）。

肝细胞制造和分泌的胆汁先入胆小管，流向肝小叶周边，汇合成Hering管（canal of Hering），胆汁由此输入小叶间胆管。小叶间胆管在肝门处汇集成左右肝管出肝，汇成肝总管。小叶间胆管由立方形上皮细胞组成，直径为30～40μm，将胆汁输送至肝外胆管、胆囊和十二指肠。构成肝内胆管系统的胆管细胞在形态和功能上各不相同。水和电解质的调控运输主要在中等和较大的胆管中。

成人肝脏每天分泌700～1200mL胆汁，分泌量受食物等多种因素影响。如表5-20-1所示，胆汁中主要的阳离子为Na ⁺ 。无机盐在胆汁中的浓度与细胞质中的浓度相似。胆汁的渗透性主要由无机盐产生，因为大部分有机物，如胆汁酸，聚集形成混合微胶粒，失去了渗透性。

胆汁酸是胆汁的主要成分，除了具有调节胆固醇代谢的作用外，胆汁酸还能激活不同的信号转导通路，调节体内能量代谢的作用。胆汁酸主要包括胆酸、鹅脱氧胆酸、去氧胆酸及石胆酸等。前两者由胆固醇转变生成，称为初级胆汁酸。初级胆汁酸流入肠腔后，受肠道细菌作用，形成的胆汁酸成为次级胆汁酸，如去氧胆酸和石胆酸。胆汁酸在肝细胞内均可与甘氨酸或牛磺酸结合形成结合型胆汁酸，使其极性增高，利于排泄。未与甘氨酸或牛磺酸结合的胆汁酸称为游离胆汁酸。

结合胆汁酸，为胆汁中的主要胆汁酸。结合胆汁酸在回肠被主动吸收，而游离胆汁酸仅能通过弥散吸收。结合甘氨酸或牛磺酸的胆汁酸在小肠内运输，对胰酶的水解作用具有选择性抵抗力，使小肠内能积聚足够浓度的胆汁酸，以促进脂肪的消化和吸收。

结合后的胆盐为双亲分子，含亲水区（即羟基取代基团和结合在脂肪酸侧链上的酰胺基团）和亲脂区（即类固醇核）。这使其易与两性分子结合，在临界微胶粒浓度以上，即可形成微胶粒或多分子聚集体。其他双亲分子，如胆固醇和磷脂，可与胆盐微胶粒互溶，形成混合微胶粒。胆汁酸的这种类似去污剂的性质对于保持胆汁生理状态的稳定，促进脂肪的消化吸收有重要作用。

熊去氧胆酸（UDCA）为双羟基胆汁酸，可用于治疗慢性胆汁淤积性疾病。正常条件下，UDCA只占胆汁酸贮存量的3%以下，而其亲水性高于其他一些主要的双羟基胆汁酸，如鹅脱氧胆酸和去氧胆酸。UDCA可刺激胆汁分泌，抑制小肠对内源性胆汁酸的重吸收，从而在长期使用后成为血清和胆汁中的主要胆汁酸，保护胆小管和肝细胞免受脂溶性胆汁酸，如鹅脱氧胆酸、去氧胆酸和石胆酸，以及其他潜伏肝毒素的侵害。

肠肝循环：胆汁酸分泌可以看作分子在肝细胞、胆管系统、小肠、肠上皮细胞和肝门血液之间的循环流动。在肠道内的各种胆汁酸约有95%为肠壁重吸收，其余随粪排出。正常人每天从粪便排出胆汁酸0.4～0.6g。由肠重吸收的胆汁酸（包括初级胆汁酸和次级胆汁酸、结合胆汁酸和游离胆汁酸），经门静脉重新回到肝脏。经过肝细胞进行必要的加工转化之后，连同新合成的初级胆汁酸一起，再排入肠道，这一过程称为“胆汁酸的肠肝循环”（图5-20-2）。

肝脏除在胆汁代谢中的独特作用外，还是脂类、糖和蛋白质的代谢中心，也与药物代谢密切相关，如图5-20-3所示。

（三）胆固醇和脂蛋白的代谢

肝脏疾病易引起重要的脂质异常。早期胆汁性肝硬化中出现的胆汁淤积可引起下列并发症：主要由游离胆固醇引起的高胆固醇血症，轻度高脂血症的黄斑瘤，重症高脂血症形成的黄色瘤。这些患者血清中过高的胆固醇与一种新的LDL-X脂蛋白颗粒有关，后者很可能代表回流到细胞质中的胆汁囊泡。急性肝炎患者可见高甘油三酯血症、胆固醇酯明显减少、胆固醇总量略有上升。类似的脂质异常在慢性肝病中虽然不很明显，但也可观察到。

（四）药物代谢

药物摄入肝脏后，由定位在内质网、细胞质以及其他细胞器上的几种酶类进行加工或代谢（表5-20-2）。

（五）糖类代谢

进食期与空腹期的肝内糖代谢定位于肝内不同区域各自进行。进食期，肝脏参与葡萄糖合成糖原和糖酵解过程，主要在小静脉周围的肝细胞内进行。吸收后期或空腹期，通过糖原分解和糖原异生，产生葡萄糖，主要在门管区肝细胞。

（六）脂肪酸代谢

脂肪酸不断地在肝脏和脂肪组织之间进行循环。进食期，肝细胞合成脂肪酸，然后结合成脂蛋白运送到脂肪细胞中。空腹期，贮存在脂肪细胞中的甘油三酯衍生为脂肪酸，运送到肝脏，并在线粒体内氧化为酮体。超长链脂肪酸则在过氧化物酶体内氧化。肝硬化时，即使在非空腹期，脂肪酸首先被作为能量来源。线粒体对脂肪酸的氧化取决于氨基酸肉毒碱。肉毒碱缺失可能对丙戊酸诱导的肝细胞毒性具有一定的作用。微粒体脂肪酸氧化缺陷可引起孕期急性脂肪肝、Reye综合征和Jamaica呕吐病等。

（七）氨的代谢

肝脏处理氮的代谢产物氨，需通过Krebs-Henseleit循环合成尿素。还原型谷胱甘肽（GSH）在氨代谢过程中作用较小。循环中氨的清除在肝脏内单独进行。氨甲酰基磷酸合成酶是氨合成尿素的关键调控酶，该酶在中央静脉区，除一两个细胞以外，所有肝细胞内均有表达。中央静脉区其余的一两个肝细胞相应表达谷氨酰胺合成酶，从循环中清除任何剩余的氨用以合成谷氨酰胺，并释放到终末肝静脉和系统循环中。

（八）蛋白质的合成

白蛋白是血清中含量最丰富的蛋白质。肝脏每天合成和分泌12g白蛋白。除作为许多药物的运输载体外，白蛋白还在细胞质膨胀压的维持中起着关键作用。营养状况、渗透压、系统炎症和皮质类固醇的浓度变化均可对白蛋白的合成进行调控。

（九）细胞体积的调节

肝细胞功能由水化作用调控。水化作用可被激素、氧化压、氨基酸及胆盐等调控。肝细胞内特殊的运输过程激活后，可调节细胞体积。Na ⁺ -H ⁺ 和 交换，促进细胞体积增大；K ⁺ 和Cl ^- 通道促进细胞体积减小。通过这些调控过程，肝细胞合成蛋白质和糖原，形成胆汁，细胞体积增大。细胞收缩则诱发细胞衰老变性。细胞渗透调节的破坏与许多疾病及其并发症有关。肝细胞体积调控缺失与门静脉高压、慢性病毒性肝炎和肝癌发生有关。

二、试验选择与应用

肝脏疾病的实验室检查，也称为肝功能试验，是指能反映肝脏合成、代谢、转运和免疫调节功能的试验。应根据试验的目的、价值、效能和可行性来选择。

（一）目的

主要是用于确诊有无肝脏疾病，鉴别肝细胞性和胆汁淤积性黄疸，查找疾病原因，判断预后和严重程度。

（二）可行性

常规肝功能试验以简便实用为原则，可分为一、二、三线（表5-20-3）。

（三）试验分类

肝细胞具有合成、代谢、转运和排泄等“基本”功能。狭义的肝功能试验即指上述功能的检查。广义的肝功能试验尚包括反映肝病现状和疾病的各种“标记”。

三、胆色素试验

胆色素主要是血红蛋白辅基血红素的代谢产物，是胆绿素、胆红素、胆素原及胆素等一类化合物总称。肝脏既是胆色素主要成分胆红素改造及排泄的重要器官，又是胆色素肠肝循环的重要环节。胆色素代谢障碍的一个重要临床表现是黄疸。黄疸时有一系列胆红素和胆汁酸的代谢混乱。黄疸发生的可能原因有：肝细胞的胆红素负荷过高；肝细胞内胆红素摄取和运输障碍；结合缺陷；分泌入毛细胆管的功能损害和肝外胆道梗阻。据此将其分为肝前性、肝细胞性和阻塞性黄疸。

（一）血清胆红素

1.总胆红素

正常成人血清总胆红素浓度为3.4～17.1μmol/L，浓度在17.1～34.2μmol/L 称为“隐性黄疸”，超过34.2μmol/L出现肉眼可见的显性黄疸体征。其中总胆红素在34.2～171μmol/L为轻度黄疸，171～342μmol/L为中度黄疸，超过342μmol/L为重度黄疸。肝脏疾病中胆红素浓度明显增高常反映有严重的肝细胞损害。

2.结合胆红素

游离胆红素在肝内与葡萄糖醛酸结合成结合胆红素后，由肝细胞向小叶间胆管排泄入肠道，脂溶性小，不能透过肠黏膜入血。因此，正常人血清内没有结合胆红素。测出的少量结合胆红素，是正常血清内存在的胆汁酸盐、尿素、枸橼酸，使少量的游离胆红素与偶氮试剂呈直接反应的结果。黄疸时则大致反映结合胆红素的水平。正常人血清内结合胆红素浓度为0～3.4μmol/L，结合胆红素小于总胆红素20%时，提示微粒体前黄疸（游离胆红素）；大于总胆红素40%时，提示微粒体后黄疸（结合胆红素）；大于总胆红素75%～80%时，提示有胆汁淤积。

在血液循环中，结合胆红素和白蛋白可结合形成δ胆红素。临床上δ胆红素只有在长期的高结合胆红素血症患者血液内才能被检出。由于其半衰期长，在血液循环中的清除缓慢。δ胆红素的临床应用主要是与结合胆红素同时检测，用于梗阻性黄疸再通手术是否成功的重要指标：梗阻再通后结合胆红素迅速下降，而δ胆红素变化不明显。

3.同时测定总胆红素和游离胆红素的临床意义

（1）游离胆红素（又称未结合胆红素）增高主要见于溶血性黄疸、新生儿生理性黄疸、先天性非溶血性黄疸、肝炎后高胆红素血症、旁路性高胆红素血症。结合胆红素与总胆红素的比值为20%以下。

（2）结合胆红素增高见于轻型病毒性肝炎、代偿性肝硬化、胆道部分性阻塞或肝癌。

（3）结合胆红素与总胆红素的比值大于50%见于肝外或肝内胆汁淤积。

（4）先天性非溶血性黄疸分结合型与游离型，结合型患者（Dubin-Johnson综合征、Rotor综合征）血清结合胆红素增高。游离型（Crigler-Najjar综合征、Gilbert综合征）患者，未见结合胆红素升高。

（5）肝外因素如表5-20-4所示。

（二）尿胆红素定性

因未结合胆红素以白蛋白为载体，分子量大，不能从肾小球滤过；结合胆红素为水溶性，不能透过脂质的肠黏膜进入血液循环中，也不能从尿排出，故正常人尿中无胆红素存在。如果尿中出现胆红素，即表明有肝胆疾患存在。目前测定尿胆红素的常规方法能测出尿中≥0.85μmol/L的胆红素。肝炎黄疸时，在血清胆红素升高前，尿中即可查到胆红素，可用于肝炎的早期诊断。肝炎恢复期，尿胆红素可在黄疸尚未完全消退前消失，有助于预后的判断。黄疸病例，如尿胆红素阴性，提示为结合胆红素血症。但在某些类型的游离胆红素血症（如溶血时），血清中有少量结合胆红素存在（可能为在肝外组织中形成的色素Ⅰ），并见于尿中。

血清中结合胆红素愈高，尿中胆红素愈多。在某些情况下，尿中胆红素的排泄并不单纯取决于血清中结合胆红素的浓度。如前所述，在黄疸性肝炎的恢复期，尽管血清中结合胆红素仍可升高，但尿胆红素已转为阴性。其他肝病时偶也见到此种现象。

（三）尿中胆素原（尿胆原）测定

正常人肠腔内尿胆原大部分经粪便排泄，每天40～250mg。经肠黏膜重吸收的尿胆原被肝重新排入胆汁，仅少量从尿中排泄，为0～6μmol/L。

尿中尿胆原增多见于：①体内过量的胆色素产生（如溶血）；②肝细胞功能损害，不能处理自肠道吸收的尿胆原，而从尿中排出；③肠内容物在肠内停留过长（如便秘），尿胆原与肠壁接触时间长，吸收增多；④肠内细菌增多，增加了尿胆原的形成和重吸收；⑤胆道感染，细菌使胆汁内的胆红素转变为尿胆原，吸收入血，从尿中排出。

尿中尿胆原减少见于：①胆汁进入肠道受阻（肝内、外胆道梗阻）；②肠内菌群过少；③肠蠕动过速（如腹泻），肠内容物在肠内停留时间过短；④严重贫血，胆色素产生减少；⑤肾功能不全。

（四）黄疸的实验室检测

通过检测上述血清结合胆红素及未结合胆红素、尿液的胆红素及尿胆原，可鉴别溶血性黄疸、肝细胞性黄疸和梗阻性黄疸。如表5-20-5所示。

四、蛋白质测定

血浆的主要成分是蛋白质。除了免疫球蛋白外，血浆蛋白质均由肝脏内合成。通过醋酸纤维膜电泳可将血浆蛋白分为前白蛋白、白蛋白、α ₁ 球蛋白、α ₂ 球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白六类。每类均包含一种或多种蛋白质（图5-20-4）

（一）前白蛋白

前白蛋白在电泳中位于白蛋白之前，包括视黄醇转运蛋白和甲状腺素转运蛋白，分别运输视黄醇和甲状腺素T ₄ 。前白蛋白由肝合成，是反映肝脏合成障碍或分解加速的灵敏指标。参考区间4.55～7.28μmol/L（200～400mg/L）。其变化机制与白蛋白相似，主要与蛋白代谢有关。负氮平衡时，前白蛋白下降。但由于其半衰期仅1.9天，肝病时其血清水平下降早，变化更明显。

（二）白蛋白

白蛋白是血浆中含量最多的蛋白。肝是合成白蛋白的唯一场所。白蛋白一旦在肝细胞粗面内质网合成后，便从高尔基体分泌入肝窦。正常成人血浆白蛋白值为40～55g/L。肝功能损害时，血清白蛋白水平下降。

（三）α ₁ -抗胰蛋白酶（α ₁ -AT）

为α ₁ 球蛋白的最主要成分，广谱蛋白酶抑制剂。其生物学作用在于抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、透明质酸酶、纤溶酶、强力蛋白酶、皮肤胶原酶、肾素、尿激素、Hageman因子辅酶和多形核白细胞中性蛋白酶等。体内半衰期5.6天。分子量小于白蛋白，易于从血液循环进入组织和体液。

（四）α ₁ -酸性糖蛋白

又称类黏蛋白、小酸性糖蛋白、α ₁ -酸性浆液黏蛋白。是血浆中黏蛋白的主要成分。用免疫比浊法测定血清类黏蛋白含量为0.55～1.40g/L，平均0.90g/L。类黏蛋白在肝内合成，生理功能不详，属于急性时相反应物，在各种组织损伤或炎症、癌肿时升高。肝实质性疾病时降低，黄疸后2周内，血浆类黏蛋白常进行性下降，慢性活动性肝炎和亚急性重型肝炎时降低最明显。但在各种急性、亚急性或慢性胆道梗阻时，含量正常或升高，即使在转为严重的胆汁性肝硬化时，其血清中含量仍不降低。测定血清类黏蛋白，有助于鉴别肝细胞性黄疸和胆汁淤积性黄疸。

（五）GC球蛋白

GC球蛋白由肝细胞合成，是结合与运送维生素D及其代谢产物的工具。能和G-肌动蛋白结合，抑制G-肌动蛋白聚合为F-肌动蛋白，是肌动蛋白的主要清除剂。GC球蛋白参考区间为0.25～0.37g/L。急性肝炎恢复期和慢性非活动性肝炎时有增高倾向。

（六）α ₂ -热稳定性糖蛋白（α ₂ -HS）

含糖质13.4%，免疫电泳上位于GC球蛋白和结合珠蛋白之间。血中半衰期4～5天。测定血清α _2h S有助于判断肝损害的严重度和预后。正常人血清含量为0.69～0.064g/L。亚急性重型肝炎，平均为（0.24±0.093）g/L，明显低于正常，急性肝炎时为（0.743±0.16）g/L，与正常无明显差异，有助于早期诊断亚急性重型肝炎。

（七）触珠蛋白

又称结合珠蛋白，属于糖蛋白，为组成α ₂ 球蛋白的主要成分之一。由肝脏合成，每天生成量约0.5g。血中半衰期3.5～4天。在血液中，该蛋白与血红蛋白结合成一稳定复合物，阻止血红蛋白从肾小球排出阻塞肾小管，既贮存铁又保护肾小管免受游离血红蛋白的损害。测定方法有免疫法、电泳法、过氧化物酶法、葡萄糖凝胶法等。正常血清中含量约0.5～2.2g/L，平均1.6g/L。电泳上泳动于α ₂ 球蛋白位置。

肝病时结合珠蛋白下降，可作为肝脏蛋白合成的灵敏指标之一。肝癌时约75.8%的病例上升，但特异性不强，胃癌亦有47.4%的病例增高。急性炎症和结缔组织疾病时均可升高（属急性时相反应物之一）。但在肝硬化基础上发生肝癌的病例中，该蛋白常降低。

（八）α ₂ -巨球蛋白

血清中有两种，一种为α ₂ -巨球蛋白（α ₂ -macroglobulin，α ₂ -MG），另一种为IgM。两者分子量均甚大，所含碳水化合物量也相似，但电泳速率不同，抗原性质也不同。α ₂ -巨球蛋白无免疫功能。

α ₂ -巨球蛋白在血清中含量：男性2.4g/L（1.5～3.5g/L），女性2.9g/L（1.75～4.70g/L），儿童期偏高。α ₂ -巨球蛋白增高以肾病时最明显，血色病和肝硬化也升高，急性肝炎大致正常。

（九）铜蓝蛋白

铜蓝蛋白（ceruloplasmin，Cp）又称铜氧化酶。为一种含铜的糖蛋白，分子量为132kD。碳水化合物占8%～ 9.5%。电泳位置在α ₁ 和α ₂ 球蛋白之间，一般把它划为α ₂ 球蛋白。血清中约90%的铜与铜蓝蛋白结合。是铜的无毒性转运载体和储存库。铜蓝蛋白由肝脏合成，一部分由胆道排泄。尿中含量甚微。参考区间成人为0.15～0.30g/L（男性）；0.16～0.45g/L（女性）。

（十）转铁蛋白（transferrin，TRF）

TRF是血浆中β ₁ 球蛋白与铁结合成的一种复合体，电泳位于β ₁ 球蛋白位置。分子量79.6kD。体内半衰期12天。1mg转铁蛋白能结合1.25μg Fe ³⁺ 。转铁蛋白在体内主要功能是转运铁质，作为一种铁的传递体，从肝实质细胞和肠上皮细胞等处把铁运送给骨髓的铁生成细胞。

肝内转运蛋白有两种。一种是将物质转运到胆汁或血液中去，另一种是转入蛋白，为肝脏摄入物，在肝脏内代谢，再排出肝脏。正常血清铁为3～3.6g/L时，转铁蛋白浓度为2.40～2.80g/L。血浆中的β ₁ 球蛋白并不完全与血清铁相结合，仅以其总量的1/3结合成运铁蛋白。能够与血清铁相结合的β ₁ 球蛋白总量，称为总铁结合力。血清铁（μg/dL）÷总铁结合力（μg/L）×100%=转铁蛋白饱和度（%）。正常人转铁蛋白饱和度为31.2%±8.7%。运铁蛋白主要在肝脏合成，又能促进肝细胞再生。运铁蛋白可作判断肝病预后的一个指标，它与白蛋白一样，亦属急性期反应物。在各种急、慢性炎症、肿瘤、血色病、再生障碍性贫血、慢性溶血性贫血时常下降；上升除见于某些急性肝炎外，主要见于缺铁性贫血。

（十一）蛋白质代谢产物测定

1.血浆氨测定

肝脏在蛋白质代谢过程中会产生许多中间产物和终末产物，这些代谢产物反映出肝脏蛋白质代谢功能是否正常。血浆氨测定是临床常见的蛋白质代谢产物检测项目之一。氨是有毒物质，正常人体内含少量游离氨，主要是氨基酸、蛋白质及尿素经肠道菌群脱氨基作用吸收入血肿。氨在人体内主要通过鸟氨酸循环合成尿素，再由肾脏排出。正常人血浆氨浓度为18～72μmol/L（酶法）。肝衰竭或肝硬化有广泛侧支循环时，血氨浓度往往增高。但在急性重型肝炎，肝细胞严重坏死，由氨到尿素的转变减少，血氨浓度增高，但不显著；门静脉高压患者行门-腔静脉吻合术后（特别在进食蛋白质，服利尿剂后），血氨浓度往往增高。

2.血浆游离氨基酸测定

肝病时变化仅见于严重肝损害。无肝性脑病的慢性肝病无明显改变。并发肝性脑病时，必需氨基酸中有三种支链氨基酸（亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）明显降低，而苯丙氨酸和甲硫氨酸升高，几乎达正常的300%，色氨酸轻度升高（140%）。在非必需氨基酸中，天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸明显升高，其他则正常或轻度降低。急性重型肝炎伴肝性脑病时，血浆氨基酸改变与慢性肝病伴肝性脑病时不同，支链氨基酸多数正常或轻度降低（为正常的80%），其他必需和非必需氨基酸则均明显升高，甚至可高达正常的700%，升高最显著者为苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。

五、血清酶测定

肝细胞内酶含量十分丰富，约占肝蛋白总量的1/3。几乎所有的酶都多少不等的存在于肝细胞中。肝细胞内所含的酶是血浆（清）酶类的主要来源。血清酶活性测定对判断肝细胞的各种代谢功能和病理改变有一定价值。

（一）血浆特异酶

又称血浆功能酶，在血浆中发挥催化作用。血浆中的浓度明显高于其他组织。包括：①凝血因子和纤溶酶原：多数凝血因子和纤溶酶原都是血浆特异酶，主要有凝血酶原（第Ⅱ因子）、前激肽释放酶和纤维蛋白溶酶原；②脂蛋白代谢的两种酶包括脂蛋白脂肪酶和卵磷脂胆固醇酰基；③铜蓝蛋白；④肾素（即血管紧张肽原酶）；⑤血浆胆碱酯酶，由肝脏合成并存在于血浆之中，生理功能可能是水解干扰乙酰胆碱酯酶（真性胆碱酯酶）的一些化合物。

（二）非血浆特异酶

1.外分泌酶

来源于外分泌腺，有极少量溢入血浆。如淀粉酶（唾液腺和胰腺）、蛋白酶（胃底腺及胰腺）、脂肪酶（胰腺）及酸性磷酸酶（前列腺）等。它们在血浆中的浓度和腺体的分泌功能密切相关。当腺体中酶合成量增多时，分泌到腺体导管中的酶量增加，进入血液的酶量也相应增多。

2.细胞酶

细胞酶是指在细胞和组织中参与物质代谢的酶类。这些酶自身不断地进行合成与分解，在细胞内浓度很高，进入血浆的量很少，在血浆中也没有重要的催化作用。在讨论细胞酶时，一要注意酶在细胞内的分隔分布，二要重视酶的组织器官专一性分布。如天冬氨酸转氨酶（AST）为线粒体中的酶；丙氨酸转氨酶（ALT）、鸟氨酸氨基甲酰转移酶（ornithine carbamyl transferase，OCT）、精氨基琥珀酸裂解酶（ASAL）、黄嘌呤氧化酶和乙醇脱氢酶等，主要存在于肝细胞质中。

（三）同工酶在肝细胞内的分布

肝病诊断上应用价值较大的同工酶见表5-20-6。

（四）肝脏疾病的血清酶变化

病理情况下肝脏的酶含量常有改变，并可反映在血液内。根据血清内酶活力的增高或减少，可了解肝脏病变的性质和程度，辅助诊断肝胆系疾病。酶在血清内的含量极微，难以测定其绝对值，通常采用测定酶活力的方法，来衡量血清内酶的改变。在测定酶活力时，可因操作方法和条件的变动，影响其数值。现统一用国际单位制（sI），以nmol/s表示酶活性单位，即每秒酶促反应转化的底物的量。原用国际单位（IU）或U者，可按（IU）×16.67=（nmol/s）换算。诊断肝病的血清酶见表5-20-7。

（五）病毒性肝炎的血清酶测定

1.主要反映肝细胞损害的酶类

（1）转氨酶及其同工酶：

转氨酶及其同工酶是体内氨基酸代谢过程中必不可少的催化剂。血清天冬氨酸转氨酶（aspartatetransferases，AST）和丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活性，是迄今为止国内外应用最为广泛的反映肝细胞损害的试验。AST和ALT在肝细胞中的活性分别是血清中的7000倍和3000倍。ALT只存在于细胞质中，而AST在细胞质内只占20%，其余80%存在于线粒体中。在肝细胞质内，AST/ALT之比为0.6：l，在整个肝细胞内两者之比为3：1。肝内AST绝对值超过ALT。

ALT和AST特征见表5-20-8。

临床上常使用AST/ALT比值估计肝脏损伤程度、协助鉴别诊断病毒性肝炎、酒精性肝病和慢性肝病等。各种肝脏疾病AST/ALT比值如表5-20-9所示。

（2）腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）及其同工酶：

ADA系核酸分解酶，以同工酶形式存在于肝、肾、肺、心和红细胞中，以淋巴细胞中活性最高，肝细胞内90%存在于胞质内，当肝细胞炎症、坏死时，酶逸出至血中。血细胞内酶活性为血清的40～70倍，检测时应避免溶血。ADA对肝炎患者的阳性检出率明显高于AST、TBIL、DBIL、GGT、TBA的检出率，可明显提高肝炎患者阳性检出率。

（3）乳酸脱氢酶（LDH）及其同工酶：

LDH是一种糖酵解酶，广泛存在于人体组织内，以心肌、肾、横纹肌、肝、脑等组织内含量较多，肿瘤组织及正常人血中也可测得此酶。

（4）谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GLDH）：

该酶主要存在于肝线粒体中，为一种线粒体酶。参考值为4.5IU/L。可作为肝损害的特异性指标。该酶是一种异构蛋白，为六聚体结构，由6种相同的亚基组成。分子量为336kD。存在于细胞线粒体基质中，以肝脏含量最高，其次为肾脏、胰腺、脑、小肠黏膜及心脏等器官，在肝细胞中的分布也有所不同，小叶中央静脉周围肝细胞中活性为周边细胞的1.72倍。

（5）血清谷胱甘肽S-转移酶（GST）：

GST是一组与肝脏解毒功能和结合功能有关的小分子蛋白，又称胆红素结合蛋白，存在于细胞质，半衰期短。由于分子量较ALT小，更易透过肝细胞入血流，反映肝细胞损伤比ALT更敏感。参考区间为13.6IU/L±5.81IU/L。GST增高幅度：重型肝炎＞慢性肝炎＞急性肝炎＞肝硬化＞HBV携带者。重型肝炎GST水平持续升高，ALT进行性下降，出现“GST/ALT”分离现象，是预后不良的表现，有预测严重肝坏死的价值。

（6）醛缩酶（aldolase，ALD）：

ALD 通常指糖酵解途径中的果糖 -1，6二磷醛缩酶。该酶以1，6二磷酸果糖（FDP）为底物，使其分解为3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮，亦称为FDPALD，而以果糖磷酸（F-1-P）为底物时，ALD则称为F-1-PALD。ALD共有九型同工酶，包括三种纯聚体（A4、B4、C4）和六种杂化体（A3B、A282、AB3、AC3、A2C2、A3C），ALD-A（A4）催化FDP分解的活力比催化F-1-P分解的活力大50倍。ALD分布全身各组织中，以骨骼肌的活力最高，脑、心肌、肝次之，血清最低，红细胞中活力比血清高15倍，在正常人肝脏中，以B型为主，A、C型很少。

（7）异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrotenase，ICD，ICDH）：

ICD 是体内重要的有脱羧作用的氧化还原酶，系统名为苏（糖型）-D-异柠檬：辅酶氧化还原酶。各种肝病ICD均升高，升高程度由高到低，急性肝炎＞肝癌＞慢性活动性肝炎＞肝硬化＞慢性迁延性肝炎。急性肝炎时，ICD升高比ALT敏感性更高出现更早，升高程度更高。ICD可用于肝癌与肝外恶性肿瘤的鉴别诊断，肝癌时ICD/ALT比值显著增高，肝外恶性肿瘤不变或降低。

2.主要反映胆汁淤积的血清酶

（1）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP，ALP）及其同工酶：

肝脏中 ALP 由肝细胞合成分泌，自胆道排泄，半衰期为3天。儿童ALP活性可达正常成人的2～5倍。餐后（尤以高脂餐）小肠分泌的ALP进入血中，一般可增高30U/L或更高，在B型或O型血的人中可持续12h。妊娠3个月胎盘即可产生ALP，9个月达高峰，可达2～3倍正常值上限（ULN），分娩后1个月恢复正常。

（2）γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transferase，γ-GT，GGT）：

GGT 广泛分布于人体组织中，肾内最多，其次为胰和肝。正常人血清GGT主要来自肝脏。在肝脏，它由肝细胞线粒体产生，局限于细胞质及肝内胆管上皮中，从胆道排泄。半衰期为7～10天，酒精相关性疾病半衰期可达到28天。在大多数情况下GGT与ALP的变化一致，但骨病时GGT正常。GGT活性在不同肝病中增高程度为：肝外胆道梗阻＞原发性肝癌＞肝内胆汁淤积＞急性肝炎＞肝硬化＞慢肝中、重度。

（3）亮氨酸氨肽酶（leucine aminopeptidase，LAP）：

不同的肝病，LAP 活性增高程度不同。由高至低为：肝癌＞汁淤积＞急性肝炎＞肝硬化＞慢性活动性肝炎＞肝脓肿，肝癌阳性检出率最高。LAP的活性与肝病的部分酶类呈正相关：在急性肝炎中，LAP与ALT、AST以及LDH呈正相关；在肝硬化中，LAP与GGT呈正相关；但LAP比CCT反映肝脏疾病更加灵敏。酒精性肝炎时，LAP明显增高，甚至超过肝癌。

（4）5'-核苷酸酶（5'-NT）：

5'-NT在肝细胞内主要存在于胆小管和窦状隙面的肝细胞膜内。正常人血清5'-NT活性为＜10IU/L（酶比色法）。妊娠时升高，可能来自胎盘。除骨病时不增高外，其临床意义类似ALP，但升高幅度可能不一致。

3.肝细胞损害时活力降低的酶

（1）胆碱酯酶（cholinesterase，ChE）：

分为两大类，真性胆碱酯酶也称乙酰胆碱酯酶（AChE），存在于红细胞、肺、脑组织、交感神经节等处，主要作用是水解乙酰胆碱；假性胆碱酯酶（PChE）存在于血清或血浆中，除可作用于乙酰胆碱外，还可作用于其他胆碱类化合物，血清中的胆碱酯酶来源于PChE，目前实验室检测的也多为PChE。成人血清PChE参考区间：5000～12000U/L（速率法）。

（2）血清卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（LCAT）：

LCAT由肝合成，分泌入血。肝病时LCAT合成减少，血清酶活性降低，且与肝损害程度相一致。在反映肝储备功能方面，优于胆碱酯酶。

4.反映肝内纤维组织增生的酶

①单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）；②脯氨酸羟化酶（PH）。

5.酶学在肝病诊断中的展望

当前肝功能检测项目越来越多，如何正确和合理地使用这些指标，既能准确地诊断或监测病情，又能减少患者的负担，是每个临床医师必须考虑的问题。肝病酶学指标的作用和意义，对我们来说并不陌生，但如何以循证医学为基础，把它系统和合理的结合在一起，提高它们对肝病的诊断和监测能力，形成更加明确、有效的诊断标准，为临床建立更加合理的诊断流程，更好地发挥临床实验室的作用等方面，还有很多工作要做，这也是未来检验医学发展的方向之一。

六、肝纤维化试验

肝纤维化是各种原因导致的肝内结缔组织增生。肝细胞损伤后激活肝星形细胞（hepatic stellate cell，HSC），后者分泌大量Ⅰ型胶原导致肝脏细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积，是肝纤维化的发生机制。判断肝纤维化程度的“金标准”——肝穿刺活组织检查，是评估炎症与纤维化、明确诊断的重要手段。其局限性包括取样误差（取样部位不同影响纤维化程度的判断）、具有创伤性等。目前较成熟的无创性肝纤维化检测技术主要包括血清学检测及超声影像学检查。

肝纤维化的生物标志物及其试验

肝纤维化生物标志物主要分为两大类：一类为直接标志物，主要检测ECM及相关代谢产物；另外一类为间接标志物，主要通过生化指标的检测间接反映肝纤维化程度。

1.直接标志物

目前临床上应用最多的直接标志物包括透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原氨基端肽（procollagen Ⅲ N-terminal peptide，P ⅢNP 或 P ⅢP）和Ⅳ型胶原。某些细胞因子如TGF-β1、结缔组织生长因子（CTGF）等也可用于评估肝纤维化程度。这些指标虽与肝纤维化程度相关，然而并非属于肝脏特有，缺乏肝脏特异性，在临床诊疗中应予以鉴别。

2.间接标志物

间接标志物数量近几年迅速增加，出现了大量的生物化学诊断指标和多参数联合应用诊断模式，主要是通过各种统计方法和数学方法如多因素logistic回归分析完成的。这类标志物更适用于判断是否发生纤维化，而对于反映肝纤维化程度意义欠佳。

凝血酶原时间（PT）：肝纤维化肝功能失代偿时，PT时间显著延长。这是一项肝纤维化简便而实用的指标，应作为常规肝功能实验项目，尤其是作为肝纤维化的一项指标来检测。肝衰竭时PT也显著延长，但PT延长不一定是肝衰竭。

PGA指数如表5-20-10所示，PGA即PT-GGT-Apo A1指数计0～12分。当PGA指数＜2，肝硬化的可能性为0，肝组织学正常或轻度异常的可能性为83%；PGA指数＞9时，肝组织学正常或轻度异常的概率为0，肝硬化的可能性为86%。PGA指数有助于慢性肝病纤维化和肝硬化的诊断。

3.联合应用

联合应用多项指标固然具有一定诊断优势，但同样也存在一些问题。常规的临床化学参数检测结果变异系数通常在3%～6%，而透明质酸、Ⅲ型前胶原氨基端肽和其他的基质代谢相关参数等变异系数为4%～12%，甚至更高，且不同实验室采用的检测系统不同，参考范围也不尽相同，缺乏标准化方法来确定统一的临界值和计算方法，多参数联合应用的评价系统存在相对更高的变异。

七、脂质和脂蛋白测定

脂质是血浆中胆固醇、甘油三酯、磷脂、糖脂、游离脂肪酸、脂溶性维生素及固醇类激素的总称。脂质与蛋白质的结合物，称脂蛋白。肝脏是合成、贮存、转运、分解脂质的场所，具有促进脂类消化吸收，脂肪酸分解、合成和改造，胆固醇代谢，磷脂、脂蛋白合成等功能。脂肪的吸收又有赖于胆汁的作用。肝胆疾患必然影响到脂质代谢的正常进行，测定血清脂质和脂蛋白的变化可反映肝胆系统的情况。

（一）血清胆固醇和胆固醇酯

血清胆固醇为游离胆固醇和胆固醇酯的总和，与肝内胆固醇处于动态平衡之中。正常人血清总胆固醇含量的理想范围为＜5.18mmol/L（酶法），因年龄、性别和膳食习惯有所差异。胆道阻塞、动脉粥样硬化、肾病、妊娠、糖尿病、甲状腺功能减退等，可使血清总胆固醇含量增加；新生儿、肝硬化、急性传染病、急性胰腺炎及甲状腺功能亢进时，总胆固醇含量减少。肝细胞疾患时，胆固醇酯下降，常小于70%。肝细胞损害越重，胆固醇酯的降低也越严重。急性重型肝炎时，血清胆固醇酯含量可减至极低甚至消失，为预后险恶的表现。急性肝炎恢复期，胆固醇酯上升。胆汁淤积性黄疸时血清胆固醇含量升高，常超过8.7mmol/L。

（二）卵磷脂胆固醇酰基移换酶（LCAT）

由肝脏合成，可将卵磷脂分子上的脂肪酸与胆固醇结合成胆固醇酯。肝病时，该酶与胆固醇酯降低一致，而胆固醇增高。

（三）磷脂

正常人血清中磷脂含量为1.4～2.7mmol/L，主要为卵磷脂。胆道梗阻时，尤其是肝内胆汁淤积或胆管损伤性狭窄时，血清内磷脂浓度常明显升高，其升高幅度可超过胆固醇。

（四）血清甘油三酯

肝脏为内源性甘油三酯的唯一合成场所。肝脏不断地摄取血中游离脂肪酸（可来源于肠道吸收的脂类和糖类）以合成内源性甘油三酯，又不断地以脂蛋白的形式将其运送入血液，正常人血清甘油三酯浓度为0.56～1.70mmol/L。各种肝病时血清甘油三酯往往升高，尤其在急性病毒性肝炎时，病初多数升高，一个月后逐步下降。肝性脑病时，血清甘油三酯则多不升高，甚至低于正常。脂肪肝时甘油三酯的变化取决于其病因，一般由肥胖、饮食过量、高甘油三酯血症、糖尿病等引起者，甘油三酯升高。

（五）血清游离脂肪酸（FFA）

血清中FFA有两个来源：①血清乳糜微粒中甘油三酯（外源性）在脂蛋白酯酶作用下，分解为FFA；②饥饿时，脂库中甘油三酯（包括外源性和内源性）在激素敏感酯酶的作用下，分解为FFA，然后释放至血液。血液中FFA可被肝脏摄取，一部分被用于合成磷脂、胆固醇酯和甘油三酯（内源性），一部分被氧化。正常人血清FFA为（768±42）μmol/L（Stormont）或（14.21±1.38）mg/dL。几乎所有类型的肝病均升高。升高的机制有：①肝细胞自血中摄取FFA减少；②肝利用FFA减少，包括利用FFA合成胆固醇酯或氧化FFA的功能降低；③脂肪组织中FFA动员增加。

（六）载脂蛋白（apo）

载脂蛋白的特性如表5-20-11所示。

（七）血清脂蛋白

脂质不溶于水，血清中游离脂肪酸与血清白蛋白结合，甘油三酯、游离胆固醇、胆固醇脂和磷脂则与不同载脂蛋白结合成脂蛋白。脂蛋白按分子大小、密度不同分为高、低、极低密度脂蛋白和乳糜微粒四种。根据颗粒所带电荷不同，用电泳可将其分为α、β、前β移动和原点四条区带，分别与高、低、极低密度和乳糜微粒相对应。高密度脂蛋白主要含apoAⅠ和AⅡ，其他脂蛋白主要含apoB。

肝脏是合成血清脂蛋白的主要场所，脂蛋白的变化与血清脂类的升降相平行，但肝脏疾病时血清脂质的变化与脂蛋白不完全平行，可能与肝脏影响到载脂蛋白的合成及其与脂质的结合有关。

八、凝血因子和凝血试验

血浆凝血因子除Ⅷ和Ca ²⁺ 外，多在肝内合成。肝脏内单核巨噬细胞能清除激活的凝血因子及纤溶酶等。由于肝脏具有调控凝血与纤溶的功能，若肝组织发生病变，势必会影响机体的凝血及抗凝系统。测定血凝和纤溶系统的各种因子及有关凝血试验，对于判断肝合成功能具有重要意义。

PT正常说明凝血过程的外途径健全，PT延长提示一种或多种凝血因子异常。APTT正常说明凝血内途径健全。PT正常而APTT延长说明因子Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ或Ⅷ中单个或合并异常；PT延长而APTT正常提示Ⅶ因子缺乏，两者均延长提示因子Ⅹ、Ⅰ缺陷。若血中存在循环凝血抑制物，可引起所有凝血因子试验延长。

九、胆汁酸测定

胆汁酸是肝脏对胆固醇的代谢产物。就肝负荷而言，胆汁酸是胆红素的约100倍。胆汁酸池远大于胆红素池。当肝功能损害时，血清胆汁酸升高往往比胆红素早而明显，能更敏感地反映肝损害。

血清胆汁酸测定是一项对肝胆病具有中度敏感性和特异性的试验。该试验除诊断肝胆病外，主要用于：①鉴别肝胆疾病和先天性或溶血性黄疸，后两种疾病血清胆汁酸正常；②肝病随访，判断治疗反应；③证实某些酶试验（如碱性磷酸酶、转氨酶）异常的肝源性；④胆酸/鹅脱氧胆酸比率测定有助于鉴别肝细胞性和胆汁淤积性黄疸。

十、肝功能定量试验

肝功能定量试验指根据肝脏对物质清除率差异设计的肝功能试验，能定量反映有功能的肝细胞数及评估肝细胞受损严重程度。肝脏对物质的清除率与肝血流量和肝脏对物质的提取率（ER 0～1之间）成正比。ER 可分为高（ER 0.7～1.0）、中（ER 0.2～0.7）、低（ER＜0.2）三类。提取率高的物质通过肝脏时可以被瞬间清除。其肝脏清除率受肝血流量影响大，称流量限定性物质（如吲哚菁绿、利多卡因、半乳糖、色氨酸）；而提取率低的物质，清除率受肝血流量影响小，主要取决于肝脏药酶代谢功能，称能力限定性物质（如氨基比林、安替比林、咖啡因）。

作为肝功能检查的药物应具备以下条件：无毒；肝脏是其唯一的排泄器官；肝病时其代谢会受到影响；给药方便，胃肠道吸收完全且迅速；易于测定。观察的指标有半减期测定、药物清除率、呼吸试验及肝脏内在清除率等。

十一、肝癌标志物

理想的肝癌诊断标志物必须有以下特点：①对肝癌具有高度特异性，在肝不典型丧生结节及其他器官肿瘤中检测不到；②敏感性高；③方法简便、结果稳定、重现性好；④取样少，检测创伤小。为找到这样的肝癌诊断标志物，国内外学者付出了艰苦努力，发现了许多潜在的分子标志物，如磷脂酰肌醇蛋白聚糖（GPC）-3、异常凝血酶原（DCP）、HSP-70（热休克蛋白70）、谷氨酸转移酶、高尔基磷酸蛋白2、高尔基蛋白（GP）-73等，并初步证实了它们的临床应用价值，几种标志物联合应用有助于提高肝癌诊断的敏感性和准确性。

与肝癌相关的microRNA（miRNA）是一种非编码的短链RNA。miRNA通过多种信号通路调节细胞凋亡、增殖、分化，在肝癌的发生发展过程中具有重要作用。与肝癌诊断及治疗相关的miRNA如表5-20-12所示。

HCC联合检测血清甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）、AFP-L3以及DCP，不但可以提高HCC的诊断率，也有助于判断患者的预后。在今后工作中，应在既往研究工作基础上，建立多中心的协同研究网络，在同一组大样本的HCC、肝硬化、病毒性肝炎患者以及正常对照组中，联合检测上述多种肿瘤标记物，以组织病理学诊断为“金标准”，从中筛选出一组最具诊断价值的标记物，综合分析其诊断价值，期望总体敏感性和特异性大幅提高，并用于筛查肝癌高危人群，提高肝癌的整体诊疗水平。

（欧启水）

第二节　血清学诊断

肝炎病毒的血清学诊断主要是各型肝炎病毒相关抗原、抗体的检测。其方法包括胶体金免疫层析法（GICA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、微粒子化学发光免疫测定（CMIA）、电化学发光免疫测定（ECLIA）、时间分辨荧光分析法（TRFIA）等。

一、甲型肝炎病毒血清学诊断

甲肝病毒的血清学检测包括HAV抗原、抗-HAV IgM及IgG的检测。

（一）HAV抗原

HAV抗原是甲型肝炎感染的特异性标志。急性甲肝病毒感染后，发病前1～15天，粪便中HAV抗原阳性率最高。采用免疫电镜、免疫荧光、病毒分离等技术可检测HAV抗原或HAV颗粒。标本中检测出HAV抗原，提示甲肝急性感染。但由于病毒抗原持续时间短、技术设备要求高、目前尚缺乏商品化试剂，临床上难以常规开展。

（二）HAV抗体

HAV抗体包括抗-HAV IgM和抗-HAV IgG。检测方法主要为ELISA和CMIA。前者经济简便，无需大型仪器，在一般实验室即可开展。后者为仪器全自动操作，大幅提高了灵敏度和特异性，减少了手工加样造成的误差。抗-HAV IgM是HAV感染后患者血清最早出现的衣壳抗体，能在血中维持3～6个月，是甲型肝炎诊断的重要指标，也是临床最常用的特异性指标。抗-HAV IgM阳性可确诊甲肝急性感染。抗-HAV IgG为保护性抗体。感染甲肝病毒后6～10天迅速上升，6个月后达高峰，抗体可长期维持。监测抗-HAV IgG滴度变化，有助于了解既往感染及疫苗接种效果。单份血清抗-HAV IgG阳性，说明机体对HAV有免疫力，适用于流行病学调查。双份血清（采集时间间隔2～3个月）抗-HAV IgG滴度增高4倍以上有诊断意义。感染HAV后粪便中可出现特异性IgA抗体，持续4～6个月。因此检测患者粪便中抗-HAV IgA可作为血清学检测的补充试验。

二、乙型肝炎病毒血清学诊断

HBV血清标志物是临床最常用的HBV感染病原学诊断方法。完整的HBV颗粒（Dane particle）如图5-20-5所示，其外膜主要由乙型肝炎表面抗原（HBsAg）组成，还含有前S蛋白。核壳内含乙型肝炎核心抗原（HBcAg），乙型肝炎e抗原（HBeAg）为核壳的可溶性成分。HBV基因组位于核壳内。

（一）外膜抗原及其抗体

1.乙型肝炎表面抗原（HBsAg）

HBsAg为HBV感染后首先出现的血清标志物，HBsAg阳性一般可诊断为乙型肝炎病毒感染。急性患者体内HBsAg常于4～6个月后消失，若HBsAg持续阳性超过6个月，则转为慢性感染。

以往HBsAg的检测主要用于诊断HBV感染。近年来随着HBsAg的定量检测技术的成熟，不同检测方法其相关性良好（ r ＞ 0.96），检测结果不依赖特定的诊断平台。更重要的是，由于HBsAg能准确反映cccDNA的转录过程，因此可将其作为可靠的参考指标用于乙肝感染的用药指导、预测病情进展和预后转归（表5-20-13、表5-20-14）。

上述提及，HBsAg定量可间接反映肝细胞内共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）水平。HBsAg 定量还可预测 e 抗原血清学转换，HbsAg ＜ 1000IU/mL提示发生HBeAg阴转的概率高。在HBV DNA低水平的患者中，HBsAg水平可显著预测肝癌的发生。在干扰素（interferon，IFN）治疗患者中，基线及治疗过程中的HBsAg可以预测HBsAg的清除及治疗初期的疗效，从而指导临床合理选择抗病毒药物。HBeAg阳性患者应用IFN治疗第24周时HBsAg定量仍大于20000IU/mL，意味对IFN应答不佳，需改用其他抗病毒药物。此外，HBsAg基线水平还可预测核苷（酸）类似物的病毒学应答。因此，监测HBsAg的动态变化可帮助优化治疗方案，是慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者个体化治疗的有效管理工具。表5-20-15列举了HBsAg几种常见的cut-off值及相应的临床意义。

目前，HBsAg的检测方法主要有胶体金免疫层析法（GICA）、电化学发光免疫测定（ECLIA）、微粒子化学发光免疫测定（CMIA）及酶联免疫吸附试验（ELISA）。笔者实验室通过对116455份血清评价上述四种方法的一致性发现，GICA适合用于HBsAg的阳性初筛，ELISA可用于HBsAg的定性筛查，CMIA与ECLIA则可用来定量检测，各实验室可根据自身情况和患者的实际需要选择合理、经济的检测方法。

HBsAg的自动化定量检测是目前各实验室较常规的检测方法。Architect HBsAg-QT最早应用于临床HBsAg定量检测，主要采用微粒子化学发光免疫测定，将每一HBsAg单位转换成发光单位，并通过校准曲线对其进行定量。Elecsys HBsAg Ⅱ Quant在2011年逐渐应用于临床，采用电化学发光免疫测定。而LIAISON XL murex HBsAg Quant主要采用化学发光免疫测定对HBsAg定量。

2.乙型肝炎表面抗体（抗-HBs）

抗-HBs是机体对HBV感染的保护性抗体，含量越高，机体抵抗HBV入侵的能力越强。抗-HBs小于10mIU/mL，无保护作用；浓度在10～100mIU/mL，对HBV免疫力弱，不能预防HBV的感染。WHO推荐抗体浓度小于100mIU/mL时应注射HBV加强剂量疫苗。

抗-HBs阳性见于既往HBV感染及HBV疫苗接种成功者。临床上有患者出现HBsAg与抗-HBs同时阳性的情况，其发生率介于2.43%～32%。可能原因为：①由于HBV Pre S/S区的基因突变导致HBsAg抗原性质改变或破坏了B细胞与T细胞的识别位点，从而发生免疫逃逸，最终造成HBsAg/抗-HBs双阳性。有学者对48例HBsAg与抗-HBs同时阳性的病例研究发现，其原因与乙肝基因组前S区缺失相关。②不同血清型（见下文）的HBV感染：有研究证实无论是体内还是体外相同血清型的HBsAg和抗-HBs无法共存，而异质性的HBsAg和抗-HBs能够共存，因此认为不同血清型的HBV感染可能是导致HBV感染者HBsAg/抗-HBs双阳性的原因。③检测体系的差异：不同检测体系间由于灵敏度、特异性、检测方法等方面存在差异，因此在HBsAg和抗-HBs的定量检测上存在一定差异。有学者对三种常见的自动化检测仪器（Architect HBsAg-QT、LIAISON XL murex HBsAg Quant和Elecsys HBsAg Ⅱ Quant）的性能比对中发现，三种仪器对HBsAg和抗-HBs双阳性标本的一致性仅为65%。因此对于HBsAg和抗-HBs双阳性标本的检测结果应谨慎对待。

3.前S蛋白和抗前S蛋白

Dane颗粒的外膜由大蛋白、中蛋白和主蛋白构成（图5-20-5）。其中大蛋白除了HBsAg，还含有前S蛋白（包括前S1蛋白和前S2蛋白）。前S1蛋白位于病毒最表面，其末端第21～47位氨基酸片段能被肝细胞受体特异性识别。该序列高度保守，突变病毒只要该段序列完整就具有传染性。前S2蛋白由55个氨基酸组成，突变常发生在起始密码子。与HBeAg类似，前S蛋白亦能反映HBV复制情况。

前S蛋白在急性HBV感染时最早出现，长期存在提示病情转为慢性。其浓度与HBsAg正相关，转阴较HBsAg发生早，预示病情好转。慢性乙型肝炎患者在肝炎急性发作时，常在ALT升高前前S蛋白就明显升高，提示常规检测前S蛋白对预测乙肝急性发作有临床价值。前S蛋白可对HBV复制做出定量判断，动态观察有助于急、慢性乙型肝炎预后的判断。

抗前S蛋白在前S蛋白出现后产生，是感染阶段最早出现的抗体，也是观察肝炎病情发展、预后、乙肝疫苗免疫效果的又一可靠观察指标。过去认为抗前S蛋白在体内只是短时存在，迅速被抗-HBs所代替而外周血不易检测到；现认为抗前S蛋白也可长期存在。短期存在的往往是IgM型，IgG型抗体可作为中和抗体在外周血中长期存在，甚至可与IgM型抗前S蛋白同时存在，在急性或慢性肝炎中均有类似情况。抗前S蛋白反映HBV的清除，预示病情康复。

4.血清乙型肝炎表面大蛋白（LHBs）

如上所述，HBV外膜蛋白由大蛋白、中蛋白和主蛋白构成。与中蛋白和主蛋白不同，大蛋白含有的前S蛋白可作为病毒反式作用因子，可导致患者病情反复，因而检测LHBs在预测抗病毒治疗效果中具有一定作用。不仅如此，LHBs与HBsAg和HBV DNA等指标的相关性好（有研究表明LHBs与HBsAg相关性系数 r = 0.979，与 HBV DNA 相关性系数 r = 0.923）。LHBs结合 HBV DNA、HBsAg 等临床指标，可用于低水平的HBV DNA载量的CHB患者体内病毒复制的监测及判断抗病毒疗效和预后。

5.HBsAg亚型

HBsAg的组抗原决定簇“a”是共同的；亚型决定簇根据编码氨基酸残基的不同，分为四个主要亚型：adw、adr、ayw、ayr（如表5-20-16所示）。临床上可用于：①判断疾病预后：患者血清中若检出两种亚型或是混合亚型，对患者的病程和预后不利。②流行病学意义：亚型的分布有明显的地区性，并与种族有关。我国感染HBV B基因型主要以adw为主，C基因型主要以adr为主。③各亚型间有交叉保护作用，乙型肝炎疫苗可通用。若能根据本国、本民族亚型制备疫苗，无疑将提高疫苗的有效果性。

（二）乙型肝炎核心抗原（HBcAg）、核心相关抗原（HBcrAg）及核心抗体（抗-HBc）

HBcAg是HBV核壳的组成成分，通常包裹在病毒中。由于HBcAg易与抗-HBc结合形成免疫复合物，难以从血清中检出。乙型肝炎病毒核心相关抗原（HBcrAg）由HBcAg、HBeAg及p22cr三种蛋白质组成，可通过化学发光酶免疫技术检测其在血清中的含量。研究发现HBcrAg与乙肝cccDNA、血清HBV DNA显著相关，因此可将血清HBcrAg联合HBsAg定量作为肝内cccDNA的替代产物。

抗-HBc不是保护性抗体，是HBV感染的标志。感染HBV的个体均会产生抗-HBc，因此抗-HBc是临床HBV诊断及流行病学调查最有价值的血清标志物之一。抗-HBc检测多采用竞争法进行检测，假阳性是临床实践过程遇到的主要问题，有文献提示我国有10%的正常人群可检出单一抗-HBc，其中20%的结果无法重复。抗-HBc阳性的临床意义：①高滴度的抗-HBc提示现行感染，常伴有HBsAg阳性及血清ALT升高；②低滴度抗-HBc提示既往感染，常伴有抗-HBs阳性；③在HBV急性感染恢复早期，血清HBsAg消失而抗-HBs尚未出现，抗-HBc是唯一能检出的HBV特异性指标；④抗-HBc IgM是HBV感染早期出现的抗体，有助于急性乙型肝炎的诊断；⑤抗-HBc IgA与肝细胞炎症病变相关，故能反映肝脏的功能。

抗-HBc定量亦具有重要的临床价值。《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》指出基线抗-HBc水平对HBeAg阳性CHB患者，采用聚乙二醇干扰素（PEG-IFN）或核苷（酸）类似物（NAs）治疗时，有一定的疗效预测价值。最新的研究表明，抗-HBc水平与ALT水平相关，而且基线抗-HBc水平可预测HBeAg血清学转换。动态监测抗-HBc水平可以预测HBeAg阳性CHB患者IFN治疗的应答情况。不仅如此，抗-HBc定量检测联合其他临床检验指标还可以预测CHB患者的病情发展及预后。因此，重视抗-HBc定量的临床意义，有望为今后CHB个体化诊疗提供新的思路。遗憾的是，当前临床实验室缺少抗-HBc标准化的定量检测体系，应加强这方面的研究和产业化。

（三）乙型肝炎e抗原（HBeAg）及e抗体（抗-HBe）

乙型肝炎e抗原（HBeAg）是核心抗原的分泌蛋白，一般见于HBsAg阳性的患者。HBeAg和HBcAg有近75%的共同氨基酸序列。因此，与肝细胞内检出HBcAg一样，在血清中检出HBeAg表明病毒复制活跃，传染性强。急性乙肝患者，若血清HBeAg持续阳性超过3个月，病情有慢性化倾向。

HBeAg阳性持续时间长对病情的发展转归不利。研究表明，年龄大于40岁HBeAg仍持续阳性，其发生肝硬化及肝细胞癌的风险均较HBeAg阴性患者高。

抗-HBe一般在机体HBeAg转阴后出现，是HBeAg的特异性抗体。血清e抗原转换定义为HBeAg消失，同时检出抗-HBe，且HBV DNA载量降至2×10 ³ IU/mL。抗-HBe出现多为病情稳定、预后好的标志。HBeAg与抗-HBe同时阳性说明正处于血清转换期，两者阴性可能为HBV的前核心区发生变异或机体缺乏产生e抗体的B淋巴细胞。

抗-HBe的临床意义：①出现抗-HBe大多提示病毒复制停止，病变活动静息；②抗-HBe不是保护抗体，抗-HBe阳性患者可检出HBV DNA，表明病毒复制，且具有传染性；③与甲胎蛋白阳性相关，应警惕原发性肝癌的存在；④由于HBV基因突变造成的HBeAg阴性，抗-HBe阳性，病毒仍可复制，且病情仍有发展的可能。少数患者可发生血清逆转，重新出现HBeAg。其原因可能HBV前C区及基本核心启动子区（basic core promoter，BCP）突变造成。

（四）急性乙型肝炎感染时血清标志物的变化

急性乙型肝炎感染时血清标志物的变化如图5-20-6所示，HBV血清标志物组合模式及临床意义如表5-20-17所示。

三、丙型肝炎病毒血清学诊断

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染呈世界性分布。全球HCV感染率平均为2.8%，约1.85亿人感染HCV。而我国普通人群丙型肝炎抗体的阳性率0.43%。北方（0.53%）高于南方（0.29%）。各型HCV感染的患者中，急性肝炎占8.24%，慢性活动性肝炎占17.78%，慢性迁延性肝炎占8.87%，慢性重型肝炎（慢加急性肝衰竭）占15.63%，肝硬化占23.78%，肝细胞癌占20%。结果表明，随着肝脏疾病的加重，HCV检出率也逐渐增高。

丙型肝炎病毒检测主要包括检测HCV核酸、HCV抗原及HCV抗体。HCV检测一般分为筛查试验和补充试验。筛查试验常用酶联免疫吸附试验（ELISA）和化学发光免疫测定（CIA）。ELISA重复性强，成本低，适合用于基层医院开展检测。HCV筛查试验存有一定比例的假阳性，有报道指出，HCV感染率＜10%的人群（如自愿献血者、卫生服务工作者等），抗-HCV ELISA检测假阳性率约为35%，免疫抑制人群，其检测假阳性率约15%。抗-HCV ELISA假阳性主要原因包括：血液中存在高浓度非特异性IgG或类风湿因子吸附于固相载体或包被的抗原；受检样本中超氧化物歧化酶的干扰；用于制备试剂的HCV抗原不纯。CIA技术实现了仪器自动化，避免手工操作引起的误差，精密度好。相比ELISA法，CIA技术假阳性率有所降低，目前已广泛用于临床。然而仍不能依靠单一的抗-HCV筛查阳性结果作为诊断依据，应采用补充试验作为报告依据。

补充试验常用的是条带免疫法（SIA）如重组免疫印迹法（RIBA）以及HCV RNA检测。RIBA检测特异性较ELISA高，但灵敏度不足，且RIBA在操作上较ELISA复杂、耗时、成本高，不利于其在临床上的应用。美国HCV检测实验室指南建议，根据筛查试验的S/CO比值（signal-to-cut-off），确定是否需要做补充试验的替代方案。英国和澳大利亚的检测策略则没有将RIBA作为补充检测，只是作为推荐试验。HCV RNA是HCV感染的直接证据，主要采用实时荧光定量PCR和分支链DNA信号技术检测，在感染窗口期检测HCV RNA具有重要意义。目前对检出HCV抗体阳性的患者一般按图5-20-7的流程做进一步检验。

（一）抗-HCVIgG

HCV为单股正链RNA，全长约9600bp。可分为5'末端非编码区（341bp）、开放阅读框（9050bp）、3'末端非编码区（200bp）。如图5-20-8所示，HCV 编码10种结构蛋白（核心蛋白 C、包膜糖蛋白 E1和 E2）和非结构蛋白（P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。NS3/4A、NS5A 及 NS5B 是直接抗病毒药物（direct-acting antiviral agent，DAA）作用的主要靶点。HCV诊断试剂抗原基本有两类，其中一类为基因工程重组抗原，即表达抗原，其抗原覆盖位点少，但易纯化。第一代酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA）试剂于1990年经美国FDA批准上市，应用酵母表达的C100-3抗原作为主要原料，假阳性率高，灵敏度较低。美国随后推出了第二代EIA试剂，该试剂的抗原包括核心蛋白C22、非结构蛋白NS3、NS4（C200）等，我国的丙型肝炎诊断试剂为主要为第三代，以核心区（C区）及非结构区（NS3、NS4、NS5区）的蛋白作为抗原，通过间接法检测HCV抗体。灵敏度和特异性均有所提高，大大提高了HCV的检出率，且抗体出现提早到16～60天，明显减少了输血后丙型肝炎的发生。但仍有不足之处，主要是由于通过抗人IgG检测血清HCV抗体，检测过程中仍有许多假阳性及不确定的结果，也无法区分是急性还是慢性感染、新近感染还是既往感染。有报道表明，急性HCV感染患者中约72%的病例抗-HCV阳性，13%的患者6～9个月才可检测到抗体，仍有2%的病例始终无法检测出抗体。近来国内外一些公司开发了第四代丙型肝炎诊断试剂盒，主要通过双抗原夹心法直接检测HCV抗体，相比第三代检测试剂盒提高了灵敏度的同时，改进了检测方法（由间接法改为直接法）使得假阳性率有所下降。感染后至抗体出现，第二代试剂间隔为9～10周，第三代和第四代为6～8周。抗-HCV的早期检测价值仍不及HCV核心抗原及HCV RNA。

重组免疫印迹试验（RIBA）亦称验证试验，是蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定相结合的新方法，用来确认标本ELISA阳性的特异性，特别是那些未暴露危险因素的HCV抗体阳性感染者（自愿献血者、ALT正常者、自身免疫病患者及长期冻存的血清标本）。用HCV 5-1-1、C-100抗原、C-22与C-33抗原检测相应抗体，出现针对上述四种抗原的任意两种抗原反应的即为阳性。但其灵敏度不足、操作烦琐、价格昂贵，不适合常规检测，目前已逐渐被HCV RNA检测所替代作为HCV检测的补充试验。HCV RNA是HCV感染的直接证据，主要方法为实时荧光定量PCR和分支链DNA信号放大检测技术，在感染窗口期检测HCV RNA具有重要价值。值得注意的是，PCR法为较敏感的检测方法，易出现假阳性或假阴性结果。引物设计、标本处理、实验室内污染、操作方法等环节均可影响实验结果，因此，亟需建立HCV 核酸检测的标准化程序（详见第十篇第五十八章相关内容）。

（二）抗-HCVIgM

理论上抗-HCV IgM的检测有重要意义，特别是对指导抗病毒治疗有一定价值。随着抗-HCV IgG检测的发展，许多学者也探讨了抗-HCV IgM抗体的检测。但直到目前，仍无质量可靠、稳定的试剂盒。

主要用于早期诊断，急性期IgM抗体阳性率略高于IgG抗体。抗-HCV IgM抗体一般在发病2～4天出现，最早于发病的第一天即可检测到，7～15天达到高峰。其持续时间一般在1～3个月。持续阳性常可作为转为慢性肝炎的指标，或是提示病毒持续存在并有复制。慢性丙型肝炎检出抗-HCV IgM常与ALT异常及肝病活动有关，可作为抗病毒疗效指标。输血引起的急性丙肝患者，抗-HCV IgM检出率达95%以上，常于输血后3～40天出现。自限性肝炎，持续时间为4～21周，若大于6个月，常表示转为慢性。

（三）HCV核心抗原

抗-HCV抗体出现晚，HCV感染治愈或康复后仍可检出阳性，因而难以区分现行感染和既往感染，也无法根据抗-HCV抗体进行早期诊断，对抗病毒疗效的监测效果也不足。HCV核心抗原是近年发展的HCV感染检测指标。其在血清中出现早，与HCV病毒载量相关性好，病情康复后消失等特点，可应用于HCV感染的临床诊疗、献血者筛查及高危人群监测。

HCV核心抗原检测试剂目前已发展至第三代，以化学微粒发光法为基础，实现了检测的自动化。HCV核心抗原检测过程仅需36min，较HCV RNA检测时间大幅缩短，而结果与HCV RNA高度一致（相关系数为0.614～0.984）。化学微粒发光法的检测下限为0.0038～0.055pg/mL，灵敏度与特异性高，且不受HCV基因型的影响。

HCV核心抗原检测的临床应用主要为：①HCV感染的早期诊断及献血员筛查：感染HCV后至血清中出现HCV抗体的时间约为60天，而HCV核心抗原在感染HCV后12～15天即可在血清中被检测出。因此，HCV核心抗原检测在HCV早期诊断及保障输血安全方面具有重要作用。②慢性HCV感染诊断：若HCV抗体阳性持续6个月以上且HCV核心抗原阳性，即为慢性HCV感染。当宿主免疫功能障碍导致HCV抗体无法合成而检测HCV核心抗原阳性，病情持续6个月以上仍可诊断为慢性HCV感染。③抗病毒疗效的预测和监测：有研究表明，应用干扰素联合利巴韦林治疗的丙肝患者中，第12周时HCV核心抗原水平下降大于2 log ₁₀ fmol/L可预测持续病毒学应答（sustained virological response，SVR）。更有甚者，治疗前HCV核心抗原浓度越低，出现SVR的概率越高。④其他应用如高危人群的监测、鉴别既往感染或现症感染及对免疫功能障碍人群HCV的感染诊断等。

HCV病毒载量联合HCV核心抗原定量检测可作为重要的临床参考指标用于丙肝抗病毒治疗的监测。例如聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗过程中，这些指标可早在治疗第3天、第1周或第2周时预测抗病毒疗效。更重要的是，当治疗过程中HCV病毒株发生突变时，HCV核心抗原的定量检测相比HCV RNA更能代表体内HCV的实际水平。表5-20-18归纳了各文献报道的HCV核心抗原对抗病毒疗效的预测价值。

除了在血清中能检出HCV核心抗原，外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PMBC）、肝脏组织内也可检出HCV核心抗原。研究表明，HCV核心抗原主要定位在肝细胞质内，免疫组化分析表现为胞质均质型分布，呈现包涵体样或环绕核周分布。肝内HCV核心抗原阳性的细胞可出现不同程度的变性，然而HCV核心抗原表达与肝脏损伤及病变程度并无相关联系。在外周血单个核细胞内可检出病毒核心抗原及HCV核酸正、负链，表明HCV可存在于外周血细胞胞质内，并能在其中复制。尚不明确HCV感染PMBC是否会影响其功能，不利于病毒清除。值得注意的是，在抗病毒治疗后，血清中HCV RNA已无法检出时，仍可在PBMC检出HCV RNA及核心抗原，表明外周血细胞已成为HCV逃逸场所，这也是抗病毒药物治疗后复发的因素之一。

除PBMC、唾液腺、精液外，有研究表明在其他肝外组织中，如外周淋巴结、脾细胞、胰腺、骨髓细胞、肾脏、肾上腺和甲状腺内均可检出HCV RNA和HCV核心抗原，并证实存在HCV RNA负链。然而这些组织内抗原分布少，感染细胞病变不明显。HCV的肝外感染及肝外复制场所的意义尚待进一步研究。

四、丁型肝炎病毒血清学诊断

丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）为一大小约36nm的球形颗粒。病毒颗粒由外壳和核衣壳结构组成。外壳主要是由HBV提供的表面蛋白（HBsAg），核衣壳为球形结构，内含HDV抗原（HDAg）和长约1750bp的HDV RNA。HDV是一种缺陷RNA病毒，必须在HBV感染存在时才能感染宿主。乙型肝炎合并丁型肝炎感染常使病情加重，甚至发展为急性重型肝炎。

丁型肝炎病毒（HDV）感染的血清学检测对于确定HDV感染为现症感染还是既往感染，区别HBV与HDV同时感染还是重叠感染，估计预后等具有重要意义。急性丁型肝炎的早期诊断不易，丁型肝炎病毒抗原（HDAg）的免疫原性很弱，抗-HDV抗体产生迟，出现短暂，需连续采取2～3份标本检测整套血清标志：HDAg、抗-HDV IgM、抗-HDV IgG和HDV DNA。

（一）丁型肝炎病毒抗原（HDAg）

HDAg是HDV颗粒的内部组分。血清中若检出HDAg，是诊断HDV感染的最好而又直接的证据。在病程早期几乎都有抗原血症，抗原持续时间一般为3～83天，平均21天。相当部分患者，HDAg是其血清中唯一的感染HDV标志。慢性HDV感染，由于有持续而高滴度的抗-HDV，HDAg多以免疫复合物的形式存在，常规方法很难检出。

（二）HDV总抗体、抗-HDVIgM和抗-HDVIgG

血清HDV总抗体是宿主对HDV感染后的体液免疫反应。急性HDV感染时，血清HDV总抗体出现较晚，多在发病后3～8周间，滴度较低（小于1：100），重复测定有助于诊断。慢性HDV感染时，血清HDV总抗体多呈持续高滴度（大于1：10 ⁴ ）。HDV总抗体不是保护性抗体，高滴度抗-HDV 阳性，提示HDV感染持存在，一旦HDV感染终止，HDV总抗体滴度将下降甚至转阴。

抗-HDV IgM是宿主对HDV的特异性免疫反应。抗-HDV IgM在急性自限性丁型肝炎为暂时性升高，出现较迟；持续高滴度则提示慢性感染，其滴度与HDV复制和疾病严重程度相关。在急性HDV感染时，其出现时间早于抗-HDV，甚至可与血清HDAg同时被检出，部分患者抗-HDV IgM可能是HDAg和抗-HDV 间唯一的“窗口”指标，一般持续2～20周，其滴度高于抗-HDV，在急性 HDV 感染时多小于1：5000（1：1000为阳性）：在慢性HDV感染时，抗-HDV IgM常呈高滴度（高达1：10 ⁷ ），且常与高滴度抗-HDV 同时存在。抗-HDV IgM存在是肝炎处于进展阶段，抗-HDV IgM持续存在，滴度在10 ⁴ ～10 ⁷ ，一旦HDV感染终止，抗-HDV IgM滴度可迅速下降，甚至检测不出。连续观察血清抗-HDV IgM，若其滴度下降或消失，预示临床改善。抗-HDV IgM也是区别现症感染和既往感染的唯一指标。

抗-HDV IgG一般出现在抗-HDV IgM下降时，在慢性HDV感染过程中常保持高滴度。在病情康复后仍可持续数年。常采用竞争抑制法检测抗-HDV IgG。

HDV常与乙型肝炎病毒同时存在，通常HDV感染都可检出HBsAg，但既然有HBsAg阴性的HBV感染，HDV感染亦可呈HBsAg阴性，而HDV抑制HBV复制和表达可能与HBsAg阴性有关。

五、戊型肝炎病毒血清学诊断

戊型肝炎病毒（HEV）属于杯状病毒科，为单股、正链RNA分子，由7200个核苷酸组成，含有三个开放阅读框——ORF1、ORF2及ORF3。由于HEV的体外培养技术尚不成熟，基因重组或化学合成是目前ELISA诊断试剂的主要抗原来源。戊型肝炎病毒抗体诊断试剂选用重组抗原和合成抗原肽抗原，主要是HEV的线性表位，因而缺少机体抗HEV体液免疫应答的优势表位，所检测的IgM抗体灵敏度较低，特异性较差，尤其是检测其他急性病毒性感染，如甲型肝炎、肾综合征出血热等标本时，容易出现假阳性，可能与这些感染者血液中同样存在大量IgM抗体有关。

目前国内外报道的HEV构象性表位抗原主要有昆虫杆状病毒系统表达的55kD抗原、大肠埃希菌表达的ORF21抗原和大肠埃希菌表达的NE ₂ 抗原三种。NE ₂ 抗原位于HEV ORF2aa394～606区域，分子量23kD，NE ₂ 抗原能够在溶液中形成从二聚体到至少六聚体的多种蛋白聚合形式，具有良好的免疫原性。与普通线性抗原相比，利用NE ₂ 抗原建立的捕获法IgM试剂和间接法IgG试剂具有良好的敏感性和特异性。捕获法和NE ₂ 抗原的使用极大提高了临床HEV-IgM的检测灵敏度，使得IgM试剂适用于临床急性戊型肝炎的诊断。NE ₂ 构象抗原制备的HEV-IgG试剂盒，可在HEV感染10年后，在绝大多数患者体内检测出特异性IgG抗体。

（一）HEV抗原

人感染HEV后，可随粪便排出HEV。一般于潜伏期末和急性期初粪便排出HEV率最高，然后随病程延长而下降，于发病后2周不再排出HEV。病毒血症一般于感染后7～20天阳转，持续1～2周，少数患者可持续阳性4周或更长。HEV抗原（HEV-Ag）在ALT升高和HEV抗体出现之前就能检测到并可持续数周。血清中的HEV抗原和粪便中的HEV RNA几乎同时出现，单前者出现时间短。HEV抗原检测主要通过免疫电镜及免疫荧光法检测。

（二）HEV抗体

ELISA是检测HEV抗体（抗-HEV）常用的方法。用于检测HEV的抗原有三种：组织培养全病毒抗原、合成肽抗原和表达抗原。目前备受重视的表达抗原有：ORF2、ORF3及ORF2、ORF3编码产物的重组表达抗原，后者用于检测抗-HEV抗体敏感性和特异性最好。

1.抗-HEV IgM

抗-HEV IgM抗体出现早、消失快，一般在发病后3个月内消失，很少持续至6个月以上。可作为早期诊断和近期感染的指标。对诊断急性戊型肝炎特异性较好，但灵敏度较低，可能与检测试剂不敏感有关。抗-HEV IgM阳性可诊断为急性HEV感染，但抗-HEV IgM阴性不能排除HEV感染，应加测抗-HEV IgG，若抗-HEV滴度较高（大于1：40），或双份血清动态变化（由低滴度升至高滴度），也应诊断为急性HEV感染。

2.抗-HEV IgG

人感染HEV后血清抗-HEV IgG持续时间，尚存争议。有研究认为于发病后6～12个月阴转，也有认为抗-HEV IgG持续时间常，于发病4～5年，甚至14年仍为阳性。

抗-HEV IgG出现较早，持续时间相对长，特异性差。仅抗-HEV IgG阳性，而无肝功能异常及肝炎的临床表现，很可能只是既往感染的标志，仅根据一次抗-HEV IgG阳性就诊断戊型肝炎是不可靠的，应该动态观察其消长情况，如由阴性转为阳性，则可诊断为急性戊型肝炎。由于抗-HEV IgG并非终身存在，不能完全反映人群的HEV既往感染水平。

3.抗-HEV IgA

戊型肝炎患者抗-HEV IgA阳性较抗-HEV IgM阳性持续时间长，同时检测这两种抗体可提高急性戊型肝炎诊断的特异性，且比HEV RNA检测特异性更强，持续时间更长。

对戊型肝炎的诊断应慎重，最好应首先排除其他肝炎病毒急性感染。诊断急性戊型肝炎不能仅凭抗-HEV IgM或IgG，必须根据其流行病学史、临床表现及实验室检测结果综合评价。

（欧启水）

第三节　基因诊断

基因诊断（gene diagnosis）是指利用分子生物学的理论和技术，检测人体内基因及其表达产物的存在状态，从而对疾病作出诊断的方法，通常又称为分子诊断（molecular diagnosis）。与传统医学诊断技术相比，基因诊断可以直接对个体基因状态进行检测，具有高特异性、高灵敏度、早期预警、应用广泛等特点。目前，病毒性肝炎常用的基因诊断技术主要有核酸分子杂交、聚合酶链反应核酸扩增、单链构象多态性检测、限制性片段长度多态性分析、基因序列测定、单核苷酸多态性分析、基因芯片技术等。利用上述技术可以实现肝炎病毒的准确定量、基因分型及耐药性分析，这对于患者的早期诊断、动态监测病毒负荷量、耐药性变化以及抗病毒疗效观察等尤为重要。本节主要介绍各型肝炎病毒的基因诊断，旨在帮助临床医生在病毒性肝炎的诊断、预防和治疗中做出合理决策，为病毒性肝炎的个体化诊疗提供理论和技术依据。

一、乙型肝炎病毒的基因诊断

HBV的基因诊断已在临床上广泛开展，主要包括HBV DNA定量检测、HBV基因分型、HBV耐药突变检测、乙型肝炎预后相关人类基因多态性检测等。

（一）HBV DNA定量检测

HBV DNA 定量检测是慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者诊断、治疗和预后的重要指标。三大主要肝病学会——美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Diseases，AASLD）、欧洲肝病学会（European Association for the Study of the Liver，EASL）、亚太肝病学会（Asian Pacific Association for the Study of the Liver，APASL）以及中国的《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》（以下简称：2015乙肝指南）均推荐将HBV DNA定量检测用于临床抗病毒治疗的监测中。

1.HBV DNA定量检测的方法

HBV DNA定量检测的方法主要有两类：一类以聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）为基础，如聚合酶链反应 -酶联免疫吸附试验（PCR-enzyme linked immunosorbent assay，PCR-ELISA）和实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）；另一类以核酸杂交为基础，如斑点杂交和分支DNA（branched DNA，bDNA）技术等。近年来，高灵敏HBV定量检测和HBV cccDNA检测也开始应用于临床。

（1）聚合酶链反应-酶联免疫吸附试验（PCR-ELISA）：

RT-qPCR法还未广泛应用之前，国际上具有参比价值的Cobas Amplicor等检测方法是美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）唯一批准的、国际公认的HBV DNA 定量检测的“金标准”，该系统利用荧光标记的特异性单克隆抗体定量检测HBV DNA的PCR产物，并将标本处理、PCR扩增、ELISA 检测三个过程实现一体化。该方法具有灵敏度高、特异性强、稳定性好的优点，但由于其试剂价格昂贵，且必须采用封闭式检测系统，故在我国难以推广使用。

（2）实时荧光定量PCR：

为目前普遍应用于HBV DNA定量检测的方法，该方法的原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号的积累实时监测PCR 扩增过程，最后通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。通常RT-qPCR中的引物是依据S、C、P和X基因中的高度保守序列进行设计的，因而大大地提高了HBV DNA检测的灵敏度和特异性。RT-qPCR的标记方法有两种：非特异性荧光标记，如SYBR Green I，利用荧光染料或特殊设计的引物来指示扩增产物的增加；特异性荧光标记，如TaqMan 探针、分子信标等，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的含量。前者简便易行、检测成本较低，后者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但成本相对较高，其中又以TaqMan 探针为基础的实时荧光定量PCR应用最为广泛。

为确保所测数值具有可比性，HBV DNA定量检测的结果一般采用国际单位IU/mL表示，但也有些实验室仍然使用“拷贝/mL”表示（1IU/mL≈5拷贝/mL）。原国家食品药品监督管理总局（China Food and Drug Administration，CFDA）已批准多个实时荧光定量 PCR 的HBV DNA定量检测试剂盒，非高灵敏度试剂盒定量范围为10 ³ ～10 ⁹ IU/mL。

（3）分支DNA（bDNA）：

bDNA是近年兴起的一种连续放大DNA杂交信号的定量检测技术，该技术不需要实时荧光定量PCR仪，不易受实验条件及环境制约，操作简便，假阳性率低，已被用于人类免疫缺陷病毒1型、丙型肝炎病毒、流感病毒、前列腺癌特异基因检测。笔者所在实验室以微孔形式对HBV DNA杂交信号级联放大，产生的化学发光信号与HBV DNA载量成正比，最后计算机将样本信号值与标准品产生的信号曲线进行比对，从而计算出实际标本的HBV DNA载量，这一技术的灵敏度为3×10 ³ ～3×10 ⁶ IU/mL。与其他PCR原理的检测手段相比，信号放大定量分析虽然具有许多优点，但该分析方法是将特定核苷酸序列信号增强，而不是直接扩增目标片段，从而其灵敏度要低于靶基因扩增定量分析方法。

（4）高灵敏度核酸检测技术：

原CFDA《乙型肝炎病毒基因分型检测试剂技术审查指导原则》中建议HBV DNA的最低检测限应≤30IU/mL。而AASLD 及EASL指南中则要求HBV DNA的最低检测限应≤10IU/mL，因此，使用更高灵敏度的HBV DNA检测技术已成为必然趋势。大量的研究结果证实，采用磁珠法提取核酸可显著提高核酸的检测灵敏度。磁珠法的技术原理是通过超顺磁性颗粒与核酸分子特异性识别并高效结合，在外加磁场作用下，把血液等样本中的核酸分离出来。基于磁珠法提取血清样品中HBV DNA的PCR-荧光探针法检测下限可达10～12IU/mL，定量范围为2.0×10 ¹ ～2.0×10 ⁹ IU/mL，被誉为“高敏HBV DNA检测技术”。目前，国内外均有高敏HBV DNA的诊断试剂盒，各试剂盒检测性能有一定差别。

（5）HBV cccDNA 检测：

共价闭合环状 DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）是HBV基因组复制中间体mRNA和前基因组RNA的转录模板，在HBV持续感染中起着关键的作用。cccDNA被认为是判断有无病毒复制的“金标准”，只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态，是抗病毒治疗的目标。因此，cccDNA水平监测有助于了解HBV慢性感染机制、评价抗病毒治疗疗效、判断停药时机以及在肝移植术后移植肝脏是否出现再感染。近年来关于HBV cccDNA的研究逐渐增多，已建立了不少灵敏度及特异性较高、重复性较好的检测方法，如实时荧光定量PCR法、套式PCR（nested PCR）法等。

2.HBV DNA定量检测的意义

HBV DNA是病毒复制及具有传染性的标志，是病毒感染最直接、特异和灵敏的指标。HBV DNA定量检测的临床意义主要有：

（1）HBV感染窗口期的检测：

在HBV急性感染早期，血清HBV DNA检测可直接反映患者病毒血症水平，且较HBsAg出现更早，有助于HBV感染的早期诊断。HBV DNA定量检测能够将窗口期从60天缩短至20天左右，大大降低了经输血和血制品传播HBV的风险。因此，HBV DNA定量检测是HBV早期筛查及控制感染传播的重要手段。

（2）妊娠及喂养指导：

对于HBV感染的育龄女性，怀孕前进行HBV DNA定量检测，有助于选择有利的怀孕时机。2015乙肝指南中指出妊娠患者血清HBV DNA高载量是母婴传播的高危因素之一，母亲有效的抗病毒治疗及高危新生儿标准主、被动联合免疫预防可显著降低HBV母婴传播的发生率。在妊娠中后期，如果HBV DNA载量＞2×10 ⁶ IU/mL，在与患者充分沟通并权衡利弊后，可于妊娠24～28周开始给予替诺福韦、替比夫定或拉米夫定进行抗病毒治疗，建议于产后1～3个月停药，停药后可以进行母乳喂养。

（3）病毒活动程度及传染性的评估：

HBV DNA是直接反映HBV活动程度及传染性的最佳指标。HBV DNA载量升高（＞10 ⁵ IU/mL）说明病毒复制活跃，此时病毒传染性强，且传染性与含量的大小成正比；相反地，HBV DNA载量较低（≤10 ⁵ IU/mL）或低于检测下限则说明病毒复制得到抑制或复制缓慢甚至停止复制，此时病毒传染性弱。但HBV DNA定量数值只能说明游离在血液中的病毒含量，与病情严重程度没有直接关系，肝脏是否有损伤或损伤的程度应结合临床症状、影像学检查、肝功系列指标和/或肝活检等结果进行综合判断。

需要特别指出的是，无论HBV DNA载量高低，即使低于高灵敏核酸检测技术的检测下限，也会引起输血后感染，因为血液中只要有3～169个病毒体即可发生感染。

（4）抗病毒治疗起点与终点的判断：

2015乙肝指南中明确提出：HBeAg阳性患者，HBV DNA ≥ 20000IU/mL（相当于10 ⁵ 拷贝 /mL）；HBeAg 阴性患者，HBV DNA ≥ 2000IU/mL（相当于10 ⁴ 拷贝/mL）且ALT 水平持续高于正常值上限2倍超过3个月则应开始接受抗病毒治疗。对于肝硬化患者，该指南与EASL指南均强烈推荐通过监测HBV DNA的水平来判断抗病毒治疗的起点。对于持续HBV DNA 阳性患者，当存在肝硬化的客观依据时，无论ALT和HBeAg 情况，均建议积极抗病毒治疗。

除HBV DNA在基线治疗中的作用外，对于抗病毒药物治疗终点的指示作用也不容忽视。2015乙肝指南对于是否可以停药具有明确规定，无论是HBeAg阳性患者还是HBeAg阴性患者，HBV DNA水平低于检测下限都可作为重要的评估指标。2015乙肝指南中更是将抗病毒治疗期间长期维持病毒学应答（即HBV DNA 低于检测下限）作为抗病毒治疗基本的终点。

（5）抗病毒药物疗效的监测：

HBV DNA定量结果是评价HBV抗病毒药物疗效的直接监测指标，抗病毒治疗过程中应多次动态地观察患者HBV DNA水平。目前HBV抗病毒药物疗效的评估指标主要包括病毒学应答、部分病毒学应答、原发性无应答、病毒学突破和病毒学复发等几种类型（表5-20-19）。

此外，HBV DNA结合HBsAg定量检测还可预测CHB患者对PEG-IFN-α治疗的应答效果。2015乙肝指南指出，如果HBeAg阴性CHB患者经过12周治疗后HBsAg未下降且 HBV DNA 水平下降＜2 log ₁₀ IU/mL，应考虑停止 PEG-IFN-α治疗。因此，HBsAg 滴度和HBV DNA水平是治疗过程中、停药后应答效果的预测因素，将其二者联合使用，可以更好地明确患者对治疗的应答，从而制订个体化治疗方案，优化慢性乙肝的治疗。同时，各大指南均指出，延长抗病毒治疗疗程可减少病毒学复发。

（6）隐匿性慢性乙型肝炎的诊断：

近几年，隐匿性慢性乙型肝炎逐渐引起关注。隐匿性慢性乙型肝炎是指血清HBsAg阴性，但血清和/或肝组织中HBV DNA阳性，并具有慢性乙型肝炎的临床表现。除HBV DNA阳性外，患者可有血清抗-HBs、抗-HBe和/或抗-HBc阳性，但约20%的隐匿性慢性乙型肝炎患者的血清学标志物均为阴性。其诊断主要通过HBV DNA检测，但因常规荧光定量PCR检测灵敏度受限且受引物序列变异的影响，可能会存在一定程度的漏检。因此，在排除其他病毒及非病毒因素引起的肝损伤后，尤其对抗-HBc持续阳性患者，建议使用高灵敏度的HBV DNA定量技术进行隐匿性慢性乙型肝炎的诊断。

（二）HBV基因分型

HBV具有很高的复制率，高达10 ¹² ～10 ¹³ 拷贝/24h。在复制过程中HBV必须经过RNA中间体的逆转录，即DNA-RNA-DNA 的复制过程。逆转录过程需利用病毒本身的DNA聚合酶，但此酶缺乏校对活性，会造成复制过程中逆转录失真，导致HBV变异率比其他DNA病毒高，约为1/10 ⁵ ，这使得HBV在长期复制过程中容易产生自发点突变，造成子代病毒基因序列之间存在微小差别。上述特点决定了每一HBV感染者体内的HBV基因序列并非完全一致，即每一HBV感染者体内的HBV都是由有微小基因序列差别，但序列十分相近的HBV组成的病毒群。随着HBV的不断复制，这一病毒群时刻处于动态变化之中，人们将HBV的这种存在状态称为“准种（quasispecies）”。准种概念强调的是同一患者血清中不同拷贝病毒之间的微小差别、遗传相似性、动态变化、病毒群四个要素，使人们对HBV存在状态的认识产生了从“单一病毒”到“病毒群”、从“静态”到“动态”变化的两个飞跃。

基因型（genotype）是指根据不同个体之间基因序列的规律性而分成的不同类型，它可以用来描述基因本身的特征，也可以用于鉴定个体或病毒株之间的差异。根据HBV全基因组核苷酸序列差异≥8%或者S基因序列差异≥4%的标准，HBV至少可以分为9种基因型，分别命名为A～I。HBV各基因型存在着明显的地域、种族差异，我国的HBV基因型主要是B型和C型，其中南方以B型为主，北方则以C型为主，另有少量的 A 型、D 型和混合型。这些基因型的分布会随着世界人口流动量的增加而发生变化。依据HBV全基因组核苷酸序列异质性≥4%且＜8%的原则，HBV同一基因型病毒株又可进一步分为不同的基因亚型（表5-20-20）。

近年来，在抗病毒治疗的HBV感染者中发现了“基因型漂移”的现象，表明HBV基因型是会变化的，也正符合上述HBV时刻变化的“准种”特点，这提示我们有必要实时动态监测HBV基因型。

1.HBV基因分型的方法

目前常用的HBV 基因分型方法主要有：①基因序列测定法（sequence-based typing，SBT）；②PCR-RFLP分析法；③基因型特异性引物PCR法（PCR-sequence specific primer，PCR-SSP）；④线性探针反向杂交法（line probe assay，INNO-LiPA）；⑤基因芯片法（gene chip）等。

（1）基因序列测定法（SBT）：

根据所测序列的不同，SBT检测HBV基因分型可分为HBV全基因组序列分型和S区基因序列分型两种。它是目前为止最可靠、最直接及最准确的HBV分型方法，为HBV基因分型检测技术的“金标准”。由于HBV 全基因组序列差异分析过程烦琐、成本高，因此临床上根据S区基因序列差异≥4%的标准代替全基因组序列进行基因分型。其HBV基因分型的原理是设计与HBV基因组保守区特异的引物扩增S基因区（s101～s237）和重叠的P基因区（rt99～rt280），然后用两个荧光标记的DNA引物对PCR扩增产物进行双向测序，将测得的序列与A～I基因型的参考序列进行比对而确定HBV的基因型。但是对于HBV混合基因型，SBT只能检测出主要的基因型，因此不适于流行病学调查。

（2）聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析法：

该方法的原理是根据不同HBV基因型序列而选择专一的限制性内切酶，此酶可酶切HBV基因组S基因区，不同基因型序列所产生的限制性片段数目和长度不同，然后进行PCR 扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切后扩增的片段就可实现HBV基因分型。该方法解决了传统RFLP所需样本DNA量大和检测周期较长的问题，大大地提高了工作效率和检测精度，但由于HBV基因组的高度变异常导致分型错误甚至无法确定其型别，影响因素较多。

（3）线性探针反向杂交法（INNO-LiPA）：

该方法的原理是利用生物素标记的引物PCR扩增HBV基因组中S/pre-S基因区的保守序列，将得到的PCR产物与固相上的特异性探针杂交而确定HBV基因型。该方法不仅可以检测单一的基因型，也可以检测混合的基因型，是一种灵敏度较高的快速检测HBV基因型的反向杂交方法。

（4）基因型特异性引物PCR法（PCR-SSP）：

该方法利用各HBV基因型的差异序列设计一系列的特异性引物进行巢式PCR，首先用共用引物扩增S基因区，再加入型特异性引物的混合物进行第二轮扩增，最后根据扩增片段的长度不同分型。该方法操作较简单、结果准确，提高了HBV分型的灵敏度和特异性，适用于检测HBV DNA载量较低的标本。

（5）基因芯片法：

基因芯片技术具有快速、高效、高通量分析生物信息等特点，可平行、快速进行多位点和多态性分析检测。其原理是将HBV型特异性探针有序且高密度地排列固定于固相载体上，然后与荧光标记的PCR扩增产物按碱基互补配对的原则进行杂交，然后通过激光共聚焦系统检测杂交信号强度，最后经计算机分析处理得到检测结果。

除上述方法外，还有型特异性线性探针检测法、微板核酸分子杂交-ELISA、单克隆抗体酶联免疫测定法等方法可用于HBV基因分型。笔者所在实验室也积极地探索更为简便、快速、准确的HBV基因分型方法。

（1）PCR熔解曲线法：针对我国HBV基因型以B型和C型最为常见的特点，笔者所在实验室自行设计了B、C型的型特异性引物，建立了基于SYBR Green I的PCR熔解曲线法，可检测HBV B、C及B/C混合基因型。该方法根据T _m 值判断HBV基因型，其灵敏度、特异性、重复性等检测效能指标均与市售试剂盒相一致，已获国家发明专利：一种HBV基因分型的PCR检测方法（专利号：201110024107.6）。

（2）双重分子信标实时PCR法：笔者所在实验室将型特异性引物整合到实时荧光PCR平台上，选择型特异性碱基聚集区而设计针对B基因型和非B基因型的Taqman探针，建立了双重分子信标实时PCR法。该方法是一种能在1个反应体系中同时对HBV DNA进行定量检测并且能区分B基因型和非B基因型的新方法，灵敏度为10 ³ IU/mL，线性范围为10 ³ ～10 ¹¹ IU/mL，具有灵敏度高、准确性好、线性范围宽和简便快捷等特点。该方法已获国家发明专利：可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法（专利号：ZL201310332853.0）。

2.HBV基因分型的意义

监测HBV基因型，可动态指导抗病毒治疗，及时调整治疗方案，实现个性化地预测疗效、预后及转归。

（1）预测疾病的进展及转归：

HBV感染人体后的临床表现有显著的个体差异，可分别表现为一过性的病毒血症、自愈性急性肝炎、无症状的慢性病毒携带状态、慢性乙型肝炎、进行性肝损害甚至肝硬化或肝癌，这与HBV本身基因组的多态性（即基因型）有一定的关系。不同基因型HBV DNA及其抗原在肝脏细胞内积累的程度不同，其所诱导的细胞损伤也不同。相对于C型而言，B型HBV感染者有较低的HBeAg阳性率和更快的HBeAg转换率。而C型感染者炎症活动频繁，易于发生肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），可作为HCC高危指标之一（表5-20-21）。A型与肝脏的慢性炎症相关，D型则与急性自限性肝炎相关。

（2）指导治疗药物的选择：

各大指南均指出不同基因型对抗病毒治疗的应答效果可能不同。在干扰素（interferon，IFN）治疗过程中，A 型的应答率最高，其次是D 型，B型较C型有更好的应答，而C型感染者基本核心启动子突变率比其他型高，对IFN的应答率最低。HBV基因型与核苷（酸）类似物的耐药突变之间存在一定关联，使用拉米夫定治疗时，A 型耐药发生率较高，其次是C和D基因型，B型的发生率最低，其中B型以YVDD变异为主，C型以YIDD变异为主。D型感染者更易发生阿德福韦酯耐药突变。因此，在抗病毒治疗前监测HBV基因型，可指导临床制订治疗方案，实现个体化诊疗。

（3）流行病学调查：

HBV基因型的分布在不同地区和人群中有所不同。目前已发现的9种HBV基因型中，A型主要存在于白种人中；B型和C型主要存在于亚洲人群中；D型主要分布在中东、北非和南欧；E型主要分布在西非；F型主要见于中南美洲的土著人中；G型主要分布在美国、法国；H型由F型转化而来，主要分布于美国中部印第安人居住地区；I型则于近期发现于老挝等地。我国流行的主要是B型和C型，长江以北C型为主，长江以南B型为主，D型主要见于少数民族较多的地区。混合感染的类型主要以B和C型混合为主（表5-20-22）。通过调查不同国家、不同地区和人群中流行的HBV基因型的分布情况，可指导临床选择有效的抗病毒药物及进行病程预测。

（三）HBV耐药突变检测

抗病毒治疗是慢性乙型肝炎最核心的治疗措施，积极有效的抗病毒治疗不仅可以抑制肝内外病毒的复制，而且可以调节患者机体抗病毒的免疫能力，阻止肝脏疾病的进一步发展，改善肝组织学的各项指标，降低肝纤维化、肝硬化和肝癌的发生率。目前，抗病毒治疗的药物主要分为两类：一是调节宿主免疫应答的干扰素（interferon，IFN）类，我国已批准普通干扰素（IFN）和聚乙二醇干扰素α（PEG-IFN-α）用于治疗CHB；二是直接作用于HBV DNA逆转录酶区（RT 区）而阻止HBV复制的核苷（酸）类似物（nucleotide analogues，NAs）。NAs主要包括拉米夫定（lamivudine，LAM）、阿德福韦酯（adefovir dipivoxil，ADV）、恩替卡韦（entecavir，ETV）、替比夫定（telbivudine，LdT）和替诺福韦（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）等。

但是，随着NAs的广泛应用以及应用时间的不断延长，应答不佳和耐药已经成为一个十分严峻的问题。耐药发生的主要机制是：NAs抗病毒的作用靶点为缺乏校正活性的HBV逆转录酶（reverse transcriptase，RT）区，在药物选择性压力下，CHB患者RT区的氨基酸序列发生改变并影响其空间构象，最终导致NAs与该区结合能力明显下降，产生耐药性突变。RT区由344个氨基酸残基组成，其中与HBV耐药有关的常见突变位点多位于RT区的B、C、D结构域内。HBV 耐药变异以国际通行的氨基酸单字母加变异位点并加前缀rt来标记，书写格式为“rt-野生型氨基酸缩写-相对于RT区起点的氨基酸变异位点-变异后的氨基酸缩写”，如rtM204V 表示RT区的第204位由甲硫氨酸（M）变异为缬氨酸（V）。

1.核苷（酸）类似物常见的耐药突变位点及耐药发生率（图5-20-9、表5-20-23）

（1）与拉米夫定耐药相关的变异：

LAM常见耐药相关变异与rtM204I/V突变和补偿性突变 rtL80V/I、rtI169T、rtV173L、rtT184S/G、rtS202I以及 rt215S有关；其中 rtM204V 多与rtL180M变异联合出现，rtM204I变异可单独出现。根据已公布的LAM治疗核苷（酸）类似物初治患者的关键性临床试验（pivotal trials）数据计算的1～5年累计耐药发生率分别为24%、38%、49%、67%与70%。

（2）与阿德福韦酯耐药相关的变异：

ADV 常见耐药相关变异与B区rtA181T/V或D区rtN236T有关，两个位点变异可单独或联合出现；此外，位于 C、D 间区的rtV214A 或rtQ215S 及两点的联合变异也与耐药相关；根据已公布ADV 治疗核苷（酸）类似物初治患者的关键性临床试验数据计算的1～5年累计耐药发生率分别为0、3%、11%、18%与29%。

（3）与恩替卡韦耐药相关的变异：

ETV具有高耐药基因屏障，其耐药机制通过“二次打击”发生，即在rtM204V + rtL180M变异基础上，增加以下一个或多个位点：B区rtI169T或rtT184A/G/I/S、C区rtS202g/I以及E区rtM250V的氨基酸替代变异。根据已公布ETV 治疗核苷（酸）类似物初治患者的关键性临床试验数据计算的1～5年累计耐药发生率分别为0.2%、0.5%、1.2%、1.2%与1.2%。

（4）与替比夫定耐药相关的变异：

LdT的耐药基因屏障低，病毒耐药发生率高，其耐药的最主要突变类型是rtM204I伴随或不伴随二次突变rtL80I/V或rtL180M，另有报道rt181T/V、rtL229W/V亦可引起其耐药。根据已公布LdT 治疗核苷（酸）类似物初治患者的关键性临床试验数据计算的第1与第2年累计耐药发生率分别为4%与22%。需要说明的是，以上各种药物所涉及的慢性乙型肝炎的人群和设计均有所不同。

最近几年，陆续发现了一些新的突变位点。这些位点当中，有些被证实属于HBV DNA本身的多态性，如rtV173M、rtQ215h、rtN238h；有些尚不能确定与耐药有确切的关系，如rtV84M、rtI133V等；有些为耐药发生的独立危险因素，如rtE218g、rtL217P等；有些则需建立在经典耐药突变位点的基础上，如rtA181S、rtL229M等。

2.HBV耐药突变检测的方法

HBV RT区基因序列发生一些明确的突变而形成新的病毒基因序列，即当病毒变异株成为优势株时产生的耐药现象，称为基因型耐药（genotypic resistance），通常基因型耐药比表型耐药（phenotypic resistance）要早1～3个月出现。因此在临床上对HBV进行耐药基因型的检测有助于医生及时给出或调整治疗方案，延缓或阻止表型耐药的发生，使CHB的治疗更加规范、合理、科学。

近年来，准种现象在HBV疾病进展和抗病毒耐药中的作用逐渐被认识。这些病毒群在遗传学上高度相关，但个体之间又存在着微小差别，它是由常见的代表性序列即主序列（野生株）和一组不同的但又密切相关的序列（变异株）所组成。HBV突变株与野生株的动态变化会影响抗病毒疗效，因此在抗病毒药物治疗过程中动态监测二者比例，分析二者演变规律，寻找发生临床耐药时突变株所占比例阈值，对于指导临床合理用药至关重要。

由此可见，选择特异性好、敏感性高的HBV耐药基因检测技术，将成为研究HBV基因突变和准种特性的重要手段。目前，临床上用于检测HBV 耐药基因检测的常用方法有基因序列测定法（SBT）、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析法、实时荧光PCR法、基因芯片技术及质谱技术等，不同的方法在灵敏度和特异性等方面各有优缺点。

（1）SBT：

DNA序列分析是检测基因突变最直接、最可靠的方法，不仅可以确定突变的部位，还可确定突变的性质，是所有其他检测变异技术的基础。目前临床上广泛使用的Sanger测序法作为HBV耐药突变检测的“金标准”，其可检测HBV逆转录酶A～E区全部可能的耐药突变位点，但只有当突变株占HBV准种池比例＞20%时才能被检出，且其测序通量小、费时费力、操作烦琐、无法对突变型DNA的比例进行定量。

（2）PCR-RFLP分析法：

该方法的原理是利用特定的限制性内切酶特异性识别并切割经PCR 扩增后的HBV基因组DNA，将酶切后的产物进行电泳，根据DNA 片段的数目和长度大小来判断目的基因是否具有与突变位点相同的特异性序列。该方法的优点是：简便、快速、廉价，无需特殊仪器，具有较高的灵敏度，可检测出占HBV准种池比例＞5%的突变株，能有效地鉴别野生株和变异株，曾是国内实验室检测YMDD变异、rtA181V等阿德福韦酯耐药、基本核心启动子（basal core promoter，BCP）变异位点等最常用的方法。该方法的缺点是：只能检测单位点突变，但随着多种NAs的相继问世、新的HBV 耐药变异位点及联合耐药变异位点的不断出现，这种方法不能满足临床需要。

（3）实时荧光PCR法：

实时荧光PCR法是近期国内应用较多的HBV耐药突变检测方法，该方法能计算突变株比例，与测序法符合率非常高，可作为检测CHB长期服用拉米夫定耐药的有效手段。笔者所在实验室在国内首次将RT-qPCR技术和扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）技术结合起来，建立了一种可同时、一步、快速地对rtM204准确定量的RT-ARMS-qPCR技术。利用该方法可对野生型YMDD和突变型YVDD（rt M204V）模板进行准确定量，在患者发生病毒学突破前的12～48周就能检出最低比例为1%的rt M204V突变，具有灵敏度高、线性范围宽、快速便捷等优点，有望确定引发拉米夫定耐药的突变型rtM204V/I的阈值。该技术已获国家发明专利：一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法（专利号：201110135296.4）。

（4）基因芯片技术：

又称为DNA微探针阵列（microarray），其原理是在芯片表面集成大量不同的探针分子，将有荧光标记的待测样品分子与这些探针进行特异性杂交，通过检测杂交信号的强度而获取样品分子的数量和序列信息。基因芯片技术由于其具有高通量、快速、高效、灵敏、平行化和自动化的优点，已在生物学的各个领域中得到广泛的应用。但其成本昂贵，具有一定的假阳性和假阴性率，且实验结果不容易解释，检测不出新的突变位点。

（5）质谱技术：

质谱（mass spectrometry，MS）技术的基本原理是分析样品在特定的条件下转变为高速运动的离子，这些离子根据质量/电荷比的不同在静电场和磁场的作用下得到分离，用特定的检测器可以记录各种离子的相对强度并形成质谱，与标准质谱图对比，从而确定检测物质的结构。基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS）技术可同时检测目前我国临床应用的4种NAs的多个耐药位点，具有高灵敏度、准确度、分辨率，能够发现占HBV准种池比例＜1%的突变株，但设备昂贵。

HBV耐药突变检测技术不断向高灵敏度、高特异性、高通量、一次检测多位点、低成本等方向发展。近年来人们相继研发了许多高灵敏度的检测方法，如焦磷酸测序（pyrosequencing）技术、拉链核酸（zip nucleic acids，ZNA）检测技术、AllGlo探针实时荧光 PCR 技术、量子点 DNA 荧光共振能量转移（quantum dots DNA fluorescence resonance energy transfer，QDs-DNA-FRET）传感器技术、PCR 侵入（PCR invader）技术、PCR 夹（PCR clamping）技术、焦磷酸解激活的聚合反应（pyrophosphorolysis-activated polymerization，PAP）技术等。笔者所在实验室也尝试建立“基于少量突变的检测技术”用于HBV耐药突变位点检测，并取得了一些成果。

（1）等位基因特异性锁核酸实时荧光定量PCR技术（RT-AS-LNA-qPCR）：依据等位基因特异性PCR原理结合实时荧光定量PCR平台及锁核酸修饰的特异性引物建立一种新型的实时荧光定量PCR技术，将该技术用于CHB患者阿德福韦酯耐药的典型位点rtA181V和rtN236T 的突变检测，检测灵敏度均为10 ^-5 。锁核酸（locked nucleic acid，LNA）是一种新型的寡核苷酸衍生物，与普通核苷酸相比，部分或完全修饰的LNA寡核酸链与模板DNA杂交亲和力强，可使引物T _m 值提高1～8℃，显著增加了引物的特异性。引物的3'端经LNA修饰后，可显著提高错配识别能力，因此扩增效率和扩增特异性均能得到良好的保证。

（2）低变性温度下的复合 PCR（co-amplification at lower denaturation temperature-PCR，COLD-PCR）：COLD-PCR就是利用关键性变性温度（T _c ）优先扩增含有突变的扩增子的一种新形式的PCR技术，它将突变富集之后再进行下游检测，从而能使突变DNA实现最大程度的扩增，可以弥补常规PCR检测低水平突变时灵敏度不足的缺陷。笔者所在实验室率先建立了COLD-PCR法联合Sanger测序的HBV耐药突变检测技术，该技术对突变株HBV DNA的最低检出限为5.0×10 ¹ IU/mL，最低检出突变株的比例为0.5%，而常规的Sanger测序法只有当突变株超过HBV准种池20%时才能被检出，容易出现假阴性结果。该技术已获国家发明专利：一种可同时检测多个HBV耐药突变位点的新方法（专利号或申请号：201310249437.4）。

耐药突变的早期检测对于临床医生及时、准确地调整治疗方案具有十分重要的意义。上述这些高灵敏度和特异性的少量突变检测技术将是检测HBV耐药突变检测的临床应用新方向。

3.HBV耐药检测的意义

发生耐药是CHB患者长期服用NAs过程中难以避免的现象，耐药可引发病毒学突破、生化学突破、病毒学反弹及肝炎发作，少数患者可出现肝脏失代偿、急性肝衰竭，甚至死亡。2015乙肝指南中明确指出，NAs治疗过程中一旦发生病毒学突破，应进行基因型耐药检测，并尽早改变治疗方案，启动挽救疗法。因此，对乙型肝炎病毒的耐药性分析对于指导临床合理选择抗病毒药物、监测抗病毒药物的药效并及时调整治疗方案具有重要意义。

近几年的研究结果表明，准种群中突变株的比例改变是与耐药相关的一个重要因素，例如在产生LMV表型耐药的患者体内，rtL180M与rtM204V突变株的比例均大于60%。此外，体外试验表明，各种突变的耐药性强弱顺序依次为：rtM204I＞rtL180M+M204V＞rtM204V＞rtL180M。因此，借助一些高灵敏耐药突变检测方法，在NAs治疗期间定期检测HBV突变，便可能于治疗早期预测病毒学突破和生物化学突破，对调整治疗方案、降低耐药发生率、提高疗效及实施个体化治疗具有显著意义。

过去，对HBV的耐药认识忽略了其准种特点，只注意到“耐药”或“耐药变异”这一结局，没有意识到耐药发生是体内“野生株”和“耐药株”动态消长的结果。准种概念的提出使我们明确，正是在NAs的选择压力和个体的免疫压力的双重作用下，处于“准种”状态的HBV群逐步由“野生株”占优势向“耐药株”占优势方向转变，逐步出现了“耐药株”占优势的结果，并最后导致表型耐药、临床耐药的发生。以上提示我们，基于HBV的准种特点，在临床耐药发生之前动态监测基因型耐药的演变过程，探清基因型耐药-表型耐药-临床耐药之间的关系，并确定导致表型耐药的突变株的比例或阈值，是有效避免表型耐药的重要手段。

（四）乙型肝炎预后相关人类基因多态性检测

临床上治疗CHB主要应用NAs和IFN。NAs能抑制HBV的复制，控制病情的发生发展，但无法防止HBV cccDNA的合成，更严重的是，应用NAs过程中，普遍出现的耐药现象可导致治疗失败。相反，IFN相对于NAs来说，其优势在于不仅可以直接发挥抗病毒作用，而且能通过免疫调节来清除病毒，且在清除病毒过程中不会发生耐药。IFN治疗结束后可出现持久的病毒学应答、HBeAg的血清学转换，甚至是HBsAg的清除和/或血清学转换。然而，IFN并非对所有的CHB患者治疗都有效。临床发现，一些患者对IFN无应答或部分应答，即发生干扰素抵抗（interferon resistance）现象，可见，IFN治疗效果存在很大的个体差异。

HBV易感与转归的因素较多，主要包括环境因素（饮食、黄曲霉素等）、病毒因素（HBV的基因型、HBV基因突变等）和宿主因素。众多的研究均表明，宿主基因多态性是影响IFN治疗CHB患者疗效的主要因素。因此，如能在治疗前确定CHB患者是否适合选用IFN进行治疗，必将减少患者经济支出并避免不良反应的发生。目前各个指南中均未提及具体的宿主基因多态性与HBV易感性、治疗及转归的关系，但国内外已有许多关于HBV 基因多态性的研究报道，备受关注的主要有：①人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）；②钠离子 -牛磺胆酸协同转运蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）基因；③CYP27B1基因；④黏病毒抗性蛋白A（myxovirus resistance A，MxA）基因；⑤细胞因子基因：如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素 -10（interleukin-10，IL-10）、干扰素γ（interferon-gamma，IFN-γ）、白介素 -28B（interleukin-28B，IL-28B）基因等；⑥ 2'，5'-寡腺苷酸合成酶（2'，5'-oligoadenylate synthetase）基因；⑦干扰素α 受体（IFNAR）基因；⑧真核细胞起始因子2α（eIF-2α）基因。除此之外，还有趋化因子受体5（CC chemokine receptor 5，CCR5）、甘露糖结合蛋白（mannose-binding protein，MBP）等基因。

（1）HLA 基因多态性：

人类的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）被称为HLA复合体或HLA基因，编码产物为HLA抗原或HLA分子，定位于人类第6号染色体短臂6p21.31区域。HLA复合体是迄今已知的人体最复杂的基因体系，表现为多基因性和多态性，在免疫应答过程中起重要作用。现已发现，HLA基因多态性与干扰素的疗效相关，在HLA-DR基因中，等位基因HLA-DRB1*14与CHB 患者对IFN治疗高应答率呈正相关，HLA-DRB1*04、HLA-DRB1*08与IFN治疗低应答率甚至不应答相关；在HLA-DQ 基因中，HLA-DQA1*0303、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*07可能与 IFN 治疗低应答率相关；在HLA-DP 基因中，与IFN治疗高应答率呈正相关的等位基因有HLA-DPA1（rs3077）GG 基因型及 HLA-DPB1（rs9277535、rs9277378）GG 基因型。此外，HLA 基因多态性也与HBV感染存在相关性，如中国的山东、陕西、哈尔滨人群和韩国、印度人群的HLADRB1*07均与HBV的持续性感染呈正相关性，然而另一些等位基因的一致性较差，如中国南方人群的HLA-DRB1*12为HBV感染负相关基因，但在北方人群中为感染正相关基因。

笔者所在实验室在福建人群中亦证实HLP-DP基因多态性与HBV感染慢性化存在相关性。研究结果表明，HLP-DPA1基因rs3077A等位基因、HLP-DPB1基因rs9277535A等位基因是慢性HBV感染的保护因素，有助于HBV感染的清除。这提示宿主基因多态性对HBV感染的结局具有重要影响，并为揭示中国汉族人群的HBV易感性提供了遗传依据。

（2）NTCP基因多态性：

NTCP由我国学者李文辉发现，其表达于人肝细胞表面，为HBV感染肝细胞的特异性受体，有种属特异性，是HBV感染机制研究中的重大突破。近年来的研究表明，NTCP多态性位点S267F的多态性与乙肝慢性化相关、NTCP基因rs7154439的AA基因型与HBV清除相关、NTCP基因rs4646287的AA基因与肝癌的发生相关。笔者实验室亦发现NTCP基因rs2296651、rs12882299多态性与HBV易感性相关。这些结果提示NTCP基因多态性与HBV易感、转归有关，如能在临床实验室中开展多中心的研究，明确NTCP与我国不同民族人群、不同基因型HBV感染的关系，将进一步揭示HBV感染及其转归的分子生物学机制，有助于找到HBV及其感染控制的新方法，为发展新的抗病毒药物提供基础。

（3）CYP27B1基因多态性：

CYP27B1基因位于人类第12号染色体长臂12q13.1-q13.3区域，全长7587bp，编码产物为25（OH）VD ₃ -1α羟化酶（1α-hydroxylase，1α-OHase），该酶在肾脏近曲小管催化维生素 D ₃ （vitamin D ₃ ，vitD ₃ ）的前体25（OH）VD ₃ 转化为1，25（OH） ₂ VD ₃ 。1，25（OH） ₂ VD ₃ 通过激活IFN 信号传导通路以及上调β-IFN和IFN 刺激基因（如MxA）的表达而发挥抗病毒作用。当CYP27B1基因发生突变时，不同的CYP27B1基因型会影响1α-OHase的活性，从而影响1，25（OH） ₂ VD ₃ 的活性，引起相关疾病。有报道指出CYP27B1基因rs4646536基因多态性与聚乙二醇干扰素（PEG-IFN）治疗HBeAg阴性CHB患者的疗效存在相关性。

（4）MxA基因多态性：

MxA蛋白是一种由 IFN诱导产生、MxA基因编码的抗病毒蛋白，被认为是特异性最强的IFN作用指标，它可以直接抑制HBV的复制。MxA启动子-88G/T位点存在TT型、GT型和GG型3种基因型。研究显示，与HBV慢性感染者相比，自限性感染者MxA启动子-88位点携带的GG基因型或G等位基因频率较低，但携带的TT基因型或T等位基因频率较高，表明MxA启动子-88 G/T位点多态性与HBV感染后的结局有关，其中TT基因型或T等位基因的存在可能有利于感染后HBV的清除。此外，MxA启动子-88 G/T等位基因与IFN应答相关，MxA-88 G/T多态性有望成为HBV感染预防和药物治疗应答的预测指标。

（5）TNF-α基因多态性：

TNF-α基因位于人类第6号染色体HLA-Ⅲ类基因区，介于HLA-B和HLA-DR之间。TNF-α是HLA-Ⅲ类基因编码的重要前炎症细胞因子，具有多功能免疫调节作用。研究表明，TNF-α-308位点A等位基因的存在或-863位点A等位基因的缺失与HBV的长期感染密切相关；TNF-α基因位点A等位基因与HBV宫内感染的易感性相关，宫内感染HBV的患者其TNF-α-238A等位基因的频率显著高于未感染者。

（6）IL-10基因多态性：

IL-10基因位于人类第1号染色体，其编码的IL-10是一种很强的抗炎症细胞因子，是细胞免疫的潜在抑制因子。研究表明，IL-10基因启动子多态性与HBV感染后的疾病严重程度及干扰素治疗疗效相关，启动子-1082、-819和-592位点ATA单倍型在无症状HBV携带者中的频率显著高于慢性乙型肝炎和肝硬化患者；启动子-592位点等位基因A对干扰素治疗的应答率明显增高，所以IL-10基因多态性也可能用于预测CHB患者IFN疗效。

（7）IL-28B基因多态性：

IL-28B基因位于人类第19号染色体长臂19q13.13区域，全长1.34kb，编码Ⅲ型 IFN（即 interferon-λs，IFN-λs）家族成员 IFN-λ3，主要通过 JAK-STAT 信号传导通路，诱导下游基因磷酸化，激活干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）的表达，上调抗病毒蛋白OAS1和MxA的表达，从而发挥抗病毒效应。最近研究发现，IL-28B基因型与CHB患者对PEG-IFN治疗的应答相关。IL-28B基因rs12979860 CC基因型在高加索人中与IFN 治疗应答负相关，而在意大利人中为正相关基因，并且更有机会发生HBsAg的血清学转换；rs12980275 AA基因型和rs8099917 TT基因型与高加索人PEG-IFN治疗的低应答率相关，却是亚洲人获得高应答率的正相关基因。因此，IL-28B基因多态性也具有预测抗HBV治疗的价值。

（8）OAS基因多态性：

2'，5'-寡腺苷酸合成酶（OAS）是由位于人类第12号染色体上的OAS基因编码的抗病毒蛋白，能够促进病毒mRNA的降解和受感染细胞的凋亡。OAS基因家族包括OAS1、OAS2、OAS3与OASL 4个基因，具有相类似的结构和功能。研究发现OAS3（rs2072136）TC基因型与IFN应答呈正相关，TT基因型与IFN 应答呈负相关；还有人报道G-T-G-A（OAS1、OAS2、OAS3、OASL）单倍型在IFN 治疗CHB的完全应答组中的频率显著高于无应答组和部分应答组，故认为G-T-G-A单倍型与IFN 疗效呈正相关。

（9）IFNAR基因多态性：

Ⅰ型IFNAR由IFNAR1与IFNAR2组成。IFN与IFNAR结合后激活JAK-STAT信号转导通路，进一步激活下游相应基因的转录和表达。研究发现，高表达IFNAR2基因的CHB 患者接受PEG-IFN治疗有更高的持续病毒学应答率，其中IFNAR2-F8S 多态性位点FF基因型有更高的MxA基因表达和IFN 持续病毒学应答率，FS/SS基因型则与IFN应答呈负相关。

（10）eIF-2α：

eIF-2α调节区2（eIF-2α-reg2）基因A/G位点存在AA型、GG型和AG型3种基因型。研究表明，eIF-2α基因AG杂合子患者对IFN治疗无应答。

综上所述，把握IFN 疗效差异的关键因素，在治疗前检测宿主基因多态性，可为预测CHB 患者使用IFN 的疗效与转归提供依据，有利于及时选择合适的抗病毒药物，减少无应答CHB 患者使用IFN 带来的副作用和经济负担，真正实现个体化治疗。

二、丙型肝炎病毒的基因诊断

按照2014年12月正式实施的《丙型病毒性肝炎筛查及管理》标准中对于提高HCV感染筛查率的要求，临床基因扩增实验室已广泛开展HCV相关的基因诊断，主要包括HCV RNA定量检测和HCV基因分型。一些有条件的实验室还开展了HCV耐药相关基因检测和宿主IL-28B基因多态性等检测。

（一）HCV RNA定量检测

HCV RNA 定量检测是慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC）患者诊断、治疗和预后的重要指标。欧洲肝病学会（EASL）《丙型肝炎治疗指南（2014版）》（以下简称：EASL指南）、美国肝病研究协会（AASLD）《丙型肝炎治疗指南（2015版）》（以下简称：AASLD指南）、中国《丙型肝炎防治指南（2015年版）》（以下简称：2015丙肝指南）均推荐将HCV RNA定量检测用于临床抗病毒治疗监测中。

1.HCV RNA定量检测的方法

HCV基因组中的5'端非翻译区（untranslated region，UTR）是整个基因组中最保守的区域，所以常选择该区域的基因序列作为基因扩增的靶序列，可检出目前已知的所有基因型HCV。临床上最常使用的HCV RNA定量检测技术是RT-PCR（reverse transcription polymerase chain reaction）即逆转录 PCR，它是将 RNA 的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。此外，套式PCR、核酸杂交、bDNA、基因芯片法等方法也应用在HCV RNA定量检测中，肝组织内HCV RNA检测还可应用原位斑点杂交技术。但由于这些方法具有操作烦琐、灵敏度及特异性不高，难以标准化、特别是线性范围窄等局限性，WHO推荐采用实时荧光定量PCR技术用于检测HCV RNA定量检测。HCV RNA定量检测结果采用IU/mL表示，非高灵敏度试剂盒检测下限为500～1000IU/mL，线性范围为10 ³ ～10 ⁷ IU/mL。

与HBV相比，HCV感染者血液循环中的病毒含量通常很低，采用高灵敏度的HCV RNA检测有助于提高检测灵敏度，以更准确地鉴定HCV感染。非高灵敏检测易将“延迟病毒学应答”误判为“早期病毒学应答”，这可能是导致 HCV感染“复发率”升高的原因之一。因此，EASL及AASLD指南均明确指出急性、慢性丙型肝炎的诊断应基于敏感的HCV RNA检测结果（＜15IU/mL），从而为确定抗病毒疗程提供更可靠的依据。2015丙肝指南亦指出在CHC治疗前及治疗中应采用高灵敏度实时定量PCR方法监测HCV RNA以评估病毒学应答指导治疗。原CFDA已批准多个高灵敏度HCV RNA 定量检测试剂盒上市，检测下限为20～25IU/mL，定量范围为5.0×10 ¹ ～1.0×10 ⁸ IU/mL。

HCV RNA可直观反映病毒的存在，但由于HCV包膜容易受到破坏，一旦HCV RNA释放出来，即可被外界的RNA酶降解，造成HCV RNA定量结果偏低甚至出现假阴性。因此，标本的采集、运送及保存过程中都应避免RNA降解，如果被检标本处理不当（例如反复冻融或在核酸提取过程中未使用无 DNA酶、无RNA酶的耗材）都将影响检测结果的准确性。《医学实验室质量和能力认可准则——在基因扩增检验领域的应用说明》中规定HCV RNA扩增检测的血样品应尽快（3h内）分离血浆（清），以避免RNA的降解。

2.HCV RNA定量检测的意义

HCV RNA定量检测有助于HCV现症感染的确认、抗病毒治疗前基线病毒载量分析，以及抗病毒治疗过程中及治疗结束后的应答评估。

（1）HCV感染的早期诊断：

HCV的感染较隐匿，大多数的HCV感染者无明显临床症状。这些隐匿的、未被诊断的人群，也形成了一个极具危险性的传染源，在HCV的传播中起着十分重要的作用。为了能够及时发现HCV感染者，原国家卫生和计划生育委员会发布《丙型病毒性肝炎筛查及管理》标准，明确规定了HCV感染高危人群、准备进行特殊或侵入性医疗操作的人群、肝脏生化检测不明原因异常者应进行HCV筛查。

目前，临床实验室检查中用于HCV感染的病原学诊断指标主要包括：抗丙型肝炎抗体（anti-hepatitis C virus，抗-HCV）和HCV RNA检测。其中，抗-HCV是人体免疫细胞对HCV感染所做出的反应而产生的，可在外周血液循环中长期存在。抗-HCV检测因操作简便、价格便宜，应用最为广泛，但其无法严格区分HCV现症感染和既往感染。而HCV RNA检测作为病毒感染、传染性及病毒复制的标志，可直接反映患者病毒血症水平，且较抗-HCV出现更早，能够将窗口期从6～8周缩短至10天左右，是HCV早期筛查及控制感染传播的重要手段。此外，在一些自身免疫病患者中可出现抗-HCV假阳性；血液透析、免疫功能缺陷或合并HIV感染的患者中则可能出现抗-HCV假阴性。而HCV RNA检测采用的RT-PCR技术具有灵敏度高、特异性好、线性范围宽的优势，能够为临床提供可信任的精准定量检测结果，以明确HCV感染诊断，改变我国HCV“高隐匿、高漏诊”的防治现状。

（2）HCV感染的防控：

HCV感染尚无有效疫苗，也没有有效的治愈方法。因此，控制丙型肝炎只能从传染源和传播途径入手。HCV主要通过血液途径传播，常见的方式有输血或血制品（如血浆、白蛋白、凝血因子、球蛋白、成分血制品等）、手术操作（包括各种外科手术、内镜检查、牙科治疗、文身、美容等）、血液透析、医务人员职业暴露、性行为传播、母婴传播、器官移植（供者为HCV感染者）等。目前我国筛查献血员HCV感染的主要指标是抗-HCV，但由于试剂灵敏度的原因或感染者本身的缘故，一些HCV感染的献血员不能测出抗-HCV，输入这部分献血员的血液或血液制品仍然可能感染HCV。我国于2015年开始对抗-HCV阴性献血员筛查HCV RNA，大大降低了经输血和血制品传播HCV的风险。育龄妇女也应进行HCV筛查，HCV RNA阳性的母亲在分娩时将HCV传播给新生儿的危险性高达4%～7%，病毒载量越高，传播的危险性可能越大。因此，HCV检测技术离不开快速、准确和有效这些原则。HCV RNA检测相比抗-HCV而言具有灵敏度高、精密度高和准确性好等优势，是防控HCV传染源、阻断传播途径的有效手段。

（3）治疗决策的重要依据：

准确判断应答指导治疗（response guide therapy，RGT）关键时间点的HCV RNA载量，是慢性丙肝RGT治疗决策的重要依据。聚乙二醇干扰素α（PEG-IFN-α）联合利巴韦林（ribavirin，RBV）（简称PR方案）是我国现阶段HCV感染者接受抗病毒治疗的主要方案，可应用于所有基因型HCV现症感染。2015丙肝指南提出在接受PR方案治疗过程中应根据治疗中病毒学应答情况进行个体化治疗；治疗前（基线）及治疗4、12、24周应采用高灵敏度技术监测HCV RNA水平，作为治疗方案进行调整的重要依据（图5-20-10、图5-20-11）。因此HCV RNA检测作为RGT策略的保障，可帮助医生确定停药终点。

（4）疗效的监测：

HCV抗病毒治疗的目的是清除或持续抑制体内的HCV，以改善或减轻肝损害，阻止进展为肝硬化、肝衰竭或肝癌，并提高患者生活质量。EASL和2015丙肝指南均提出PR治疗的疗程应根据治疗4周和12周时的病毒学应答情况决定。获得持续病毒学应答的可能性与HCV RNA的消失速度直接相关，并且治疗早期HCV RNA水平降低程度是持续病毒学应答的预测因素。同时指南还指出治疗的终点应为治疗结束后第12周和24周采用最敏感的方法也无法检测到血液中的HCV RNA，因为非高灵敏试剂可能影响病毒学应答的判断，也会影响对患者疗效的预测和疗程的确定。

HCV RNA水平与疗程和疾病转归有关，是观察治疗应答情况的核心指标。疗效的主要评估指标主要包括：快速病毒学应答（rapid virological response，RVR）、早期病毒学应答（early virological response，EVR）、延迟病毒学应答（delayed virological response，DVR）、持续病毒学应答（sustained virological response，SVR）、部分应答（partial response，PR）、无应答（null response，NR）等（表5-20-24）。

（二）HCV基因分型

HCV是RNA 病毒，因其复制所依赖的RNA聚合酶缺乏校对功能，易发生碱基错配，从而导致HCV基因组序列变异性大，基因型也很多。目前HCV至少可分为6个基因型及80多个亚型。按照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示HCV基因型，以小写的英文字母表示基因亚型（如1a、2b、3c等）。其中NS5B在不同型HCV中同源性较低，可作为HCV分型依据。HCV 基因分型的原则是：各分离株HCV全基因组核苷酸序列差异＞30%为不同的基因型；核苷酸序列差异15%～30%为不同的基因亚型；核苷酸序列差异＜15%为同一亚型。在我国，HCV基因型主要为1b型（56.8%），其次为2a型（24.1%），还有其他较少见的型别，如3型（9.1%）、6型（6.3%）等，未见4型和5型的报道。

1.HCV基因分型的方法

HCV基因分型选择的检测区域主要有NS5B区、核心蛋白编码区（C区）、E1区和5'-非翻译区（5'-UTR）。5'-UTR区域高度保守，且具有良好的限制性片段长度多态性特征，但5'-UTR不适合用于亚型的检测及1型与6型的区分。NS5B区和C/E1区变异较大，包含可区分HCV基因型及亚型的序列信息。但是，这些区域较高的异质性常导致引物结合失败，从而增加PCR扩增失败的概率。因此，联合两个以上的区域如5'-UTR与C区或E1与NS5B区进行HCV基因分型，可提高分型准确率。

常用的HCV 基因分型方法主要包括分子生物学分型和血清学分型方法。分子生物学分型法主要有基因序列测定法（SBT）、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析法、基因型特异性引物 PCR 法（PCR-SSP）、线性探针反向杂交法（INNO-LiPA）、PCR-荧光探针法（PCR-fluorescence probing）等。血清学分型方法则是通过合成HCV特异性多肽来检测相应抗体，以区分基因型。

（1）SBT：

该方法是检测HCV基因型最准确的方法，通常被认为是HCV基因分型的“金标准”，其采用特异性PCR引物扩增HCV基因组区域，最大程度地获得序列信息后联合GenBank中已上传的HCV基因序列进行序列比对后，确定HCV的基因型。主要缺点是技术要求较高、耗时长，而且对HCV混合感染不易确定。

（2）PCR-RFLP分析法：

不同HCV基因型在某一区段（主要是5'-UTR或NS5B区）存在个别碱基变异，这将直接导致某些酶切位点的改变。采用PCR扩增目的DNA片段后，用3～5种限制性内切酶识别并切割特异的序列，不同的基因型或亚型可以得到大小不同的酶切片段。然后，根据酶切后电泳所表现的片段大小及多态性进行HCV基因分型。该方法具有快速、经济等优点，但仅用少数几个内切酶，检测基因型别有限，且不能发现新的基因型。

（3）PCR-SSP：

根据HCV不同基因型在某一区段（主要是C区和NS5B区）关键的几处碱基的差异，设计一系列型特异性引物，不同HCV基因型可通过PCR扩增出长度大小不同的片段，并以此分型。因为该方法相对简便、易操作，但对PCR引物的设计要求较高，且灵敏度及准确性都较低，不适合大样本量检测。

（4）PCR-荧光探针法：

该方法分型区域为5'-UTR和NS5B区，其原理为选取HCV各基因型的保守区域，设计相应的特异性引物和探针，运用一步法RT-PCR技术和Taqman荧光探针技术，进行多重PCR反应。反应在扩增HCV各基因型保守基因部分片段的同时，实时检测各基因型特异性探针的荧光信号，根据探针信号的检测结果进行HCV基因分型。

2.HCV基因型检测的意义

各大指南明确指出：在抗病毒治疗之前应当进行HCV基因分型，从而为HCV的诊断、治疗、预防等提供理论依据。目前，PR方案和直接抗病毒药物（DAA）是现阶段CHC主要的抗病毒治疗方案。不同HCV基因型患者，采用的抗病毒治疗方案和疗程均不相同。因此，患者抗病毒治疗前应监测HCV基因型，以动态地指导抗病毒治疗，及时调整治疗方案，实现个性化的预测疗效、预后及转归，这也是个体化诊疗的重要举措。

（1）疗效预测：

大量临床研究表明，相同的治疗方法对不同基因型HCV感染的治疗效果确实存在差异，特别是在IFN治疗过程中尤为明显。HCV 1b及1a基因型持续病毒学应答（SVR）比2型或3型差。1型CHC患者接受PR治疗48周后，其SVR率为40%～54%；2型或3型接受PR治疗24周后，其SVR率为76%～82%，且3型SVR率略低于2型。因此，各大指南指出，在HCV慢性感染者治疗前，应检测HCV基因型以预测PR方案的治疗效果，为调整用药剂量及治疗时间，制定个体化抗病毒治疗方案提供指导。

（2）治疗方案选择：

指南指出，结合HCV基因型和患者治疗前和治疗过程中的HCV RNA载量可用于治疗方案的选择和用药的调整，实现个体化治疗。2型或3型的患者首选PR疗法，在治疗过程中根据不同应答给予调整，或在医师指导下选择DAA治疗；在PR方案治疗1型、2/3型患者中，不同基因型患者的RBV用量不同，应答指导治疗（RGT）的调整策略也不一样；在DAA治疗方案中，HCV基因型及亚型是确定不同DAA方案的基础，但随着泛基因型DAA及DAA组合的应用，基因型对治疗方案选择的作用有可能逐渐减弱。

（3）流行病学调查：

HCV感染呈全球性分布，各种基因型和亚型在全球分布和流行性存在明显的地域差异，6种主要基因型分布广泛。在我国西部和南部地区，1型比例低于全国平均水平；西部地区2型和3型比例高于全国平均水平；南部（包括我国香港、澳门地区）和西部地区3型和6型比例高于全国平均水平，混合基因型较少见（约2.1%），多为1型与2型混合。通过调查不同国家、不同地区和人群中流行的HCV基因型的分布情况（表5-20-25），可指导临床选择有效的抗病毒药物及进行病程预测。

（三）HCV耐药相关基因检测

由于HCV复制所依赖的RNA聚合酶缺乏校对活性，病毒复制可发生随机突变，最终导致HCV的高度变异，HCV RNA的突变率是原核和真核DNA复制突变率的10 ⁶ 倍。HCV基因组内各区域的突变率是不同的，其中E2区的突变率最高，E1、E2和NS2的突变率其次，C区和NS3区最低。与HBV相似，HCV也存在准种现象，即一组自身复制的RNA分子，它们是彼此不同，但又密切相关的变异株。这些变异株有多种生物功能，如逃避免疫应答、耐抗病毒药物、增强病毒的适应性、引起持续性感染等。

以DAA为基础的抗病毒治疗方案包括DAA联合PR、DAA联合RBV以及不同DAA联合或复合制剂，这三种治疗方案几乎涵盖了所有类型的HCV感染者，DAA单药治疗更容易导致耐药的发生，因此不推荐。DAA主要包括NS3/4A蛋白酶抑制剂、NS5A抑制剂、NS5B聚合酶核苷（酸）类似物抑制剂、NS5B聚合酶非核苷（酸）类似物抑制剂等，其作用的主要靶点为NS3/4A蛋白酶、NS5A和NS5B聚合酶。与NAs相同，DAA今后应用的最大问题是耐药突变问题，已有研究发现，DAA存在天然耐药现象，因为在未使用DAA的患者中发现1个或多个DAA耐药突变位点。目前已确认的耐药相关突变位点主要有：①NS3/4A靶点相关：V36M、T54A、Q80K、R155K、A156T和D168V；②NS5A靶点相关：M28T、Q30E/H/R、L31M、H58D和Y93 H/N；③NS5B靶点相关：S282T、C316N/H/F、M414T、A421V、P495L/S和 S556G 等。

1.HCV耐药相关基因检测的方法

HCV耐药相关基因的检测主要采用基因序列测定法，包括PCR产物直接测序法、新一代深度测序法和体外表型分析法。体外表型分析法即测定抑制病毒复制所需的药物浓度，如EC ₅₀ 或EC ₉₀ 。目前DAA引起的耐药突变尚处于临床实验研究阶段，未进入临床实验室的常规检测，商品化检测的试剂也未完全建立。

2.HCV耐药相关基因检测的意义

研究表明，耐药突变的检测可用于DAA疗效预测：在基线时存在Q80K耐药突变株的1a型HCV感染者对新一代NS3/4A蛋白酶抑制剂西咪匹韦（simeprevir）联合PR治疗的应答不佳。因此2015丙肝指南建议，1a型HCV感染者采用上述联合治疗时应在治疗前检测是否存在耐药突变以预测疗效；但对于未采用西咪匹韦联合PR治疗的1a型HCV感染者及其他基因型感染者，由于基线时的耐药株不会影响DAA疗效，因此认为没有必要在抗病毒治疗前进行耐药突变检测。

（四）丙型肝炎疗效相关人类基因多态性检测

HCV的易感性与感染后转归的相关因素较多，其慢性化的预测指标包括：男性、年龄＞25岁、感染后无明显症状、种族（非洲裔美国人）、HIV感染者、免疫抑制患者。除此之外，宿主基因的多态性也与疾病易感、疗效及转归相关，主要包括：①人类白细胞抗原（HLA）：如Ⅰ类分子HLA B57、Ⅱ类分子HLA DRB1和DQB1的等位基因多态性；②CYP27B1基因多态性：CYP27B1基因多态性与丙型肝炎的IFN疗效相关，该基因编码25（OH）VD ₃ -1α羟化酶（1α-OHase），该酶可将前体25（OH）VD ₃ 转化为1，25（OH） ₂ VD ₃ 。1，25（OH） ₂ VD ₃ 能明显提高IFN-α刺激STAT磷酸化的能力，最终导致表达的抗病毒蛋白水平升高；③IL-28B基因多态性：全基因组关联分析（genome wide association study，GWAS）已经证实位于 IL-28B基因附近的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与HCV的清除和持续感染密切相关。因此，2015丙肝指南推荐：在实施PR治疗方案前可进行IL-28B基因多态性检测，以预测抗病毒疗效。

1.IL-28B的基因多态性

国内外学者发现 IL-28B基因的单核苷酸多态性（SNP）与1型和4型HCV感染者的自发病毒清除、慢性肝炎发病率和PEG-IFN联合RBV疗效密切关联。迄今为止，已明确的与抗HCV治疗相关的IL-28B SNPs 主要有3种：SNP rs12979860（CC型、CT 型和 TT型）、SNP rs8099917（GG型、GT 型和TT 型）、SNP rs12980275（AA 型、AG型和GG型）。我国HCV感染者的IL-28B基因型以SNP rs12979860 CC型为主，占84.1%。

2.IL-28B基因多态性的检测

目前检测宿主IL-28B基因多态性的方法有SBT、高分辨率熔解曲线法（high-resolution melting analysis，HRM）、扩增受阻突变体系 -PCR 法（ARMS-PCR）、基因芯片法、杂交探针法（hybridization probe，HP）和 PCR Invader 法等。

（1）SBT：

该方法是IL-28B基因多态性检测的“金标准”，其优点是可以检测所有突变位点，缺点是费时费力且灵敏度不高。

（2）HRM：

利用实时监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，从荧光强度与时间曲线上找出SNP 的位置，通过熔解曲线的峰形判定不同的SNP 位点、纯合子与杂合子。该方法的优点是可以检测所有突变位点，缺点是需要用SBT法对结果进行确认。

（3）ARMS-PCR：

其基本的原理遵循3'端错配原则，即在进行扩增反应时若引物的3'端碱基与模板碱基形成错配，链延伸反应就会因3'，5'-磷酸二酯键形成的障碍而受阻。只用当模板链是特定的等位基因时，才会检测出特异的扩增产物。ARMS-PCR法特异性高，操作简便，是一种快速、简便、经济、准确的基因分型方法。

（4）基因芯片法：

利用PCR技术扩增特定的基因片段，再与芯片上的特异性核酸探针进行杂交以检测特定的基因位点序列，然后结合基因芯片阅读仪使杂交信号放大到肉眼判读水平，便于结果判读。

3.IL-28B基因多态性检测的意义

IL-28B基因多态性的发现为临床医生预测疾病转归及个体化治疗提供了一定的参考。目前IL-28B与HCV感染后自愈、抗病毒疗效预测以及肝硬化、肝癌发生发展的相关性已趋明确。

（1）病毒自发清除相关：

研究发现，携带SNP rs12979860 CC型可明显加强宿主对HCV的清除能力。SNP rs12979860 CC型发生病毒自发清除的可能性是SNP rs12979860 TT型感染者的2倍以上，说明IL-28B基因在SNP rs12979860位点CC型有利于病毒清除，而TT型病毒清除率低。

（2）疗效预测：

许多研究显示IL-28B基因上游的SNP位点与丙型肝炎患者标准化治疗方案（PR方案）的抗病毒疗效密切相关。IL-28B基因型是 HCV 1型患者接受PR方案疗效以及结合蛋白酶抑制剂三联治疗获得 SVR 率的预测因素。

SNP rs12979860是目前已知的与HCV感染者的SVR情况最相关的指标，预测价值优于治疗前检测 HCV RNA载量水平、肝纤维化分级、年龄和性别等。该位点的CC型与SVR相关联，CT和TT型与病毒学无应答关系密切，对于HCV基因1型的预测效果优于2型和3型。并且，SNP rs12979860 CC型基因携带者血清中IL-28B的表达水平显著高于T等位基因型携带者，提示携带 SNP rs12979860 CC 型预后依次好于 SNP rs12979860 CT 型、SNP rs12979860TT型。甚至有学者提出，凭借一个SNP rs12979860基因多态性的测定便足以预测慢性HCV感染的治疗结局。

SNP rs8099917是与病毒学无应答最相关的指标。SNP rs8099917 TT型为保护性基因型，GT型与GG型为非保护性基因型，其中SNP rs8099917 GG型基本无效或者无显著效果。有研究表明，SNP rs8099917 GT等位基因也可用于预测SVR，而且还可以单独作为判定 HCV 免疫应答情况的指标。此外，SNP rs8099917能提高 SNP rs12979860 CT 型的病毒学无应答的预测价值。但是，SNP rs8099917与SNP rs12979860合用并不能提高SNP rs12979860CC基因型对1型HCV应用PR治疗的预测价值。

SNP rs12980275也可用于预测1型HCV感染者应用PR方案治疗的效果，其AA 型为保护性基因型，AG型与GG型为非保护性基因型，但对于2/3混合型HCV感染者来说，该SNP并无预测价值。

三、其他肝炎病毒的基因诊断

甲型、丁型和戊型肝炎病毒的诊断主要依赖于血清学检测，基因诊断技术多用于其科研、流行病学调查等方面，因此在本节简略介绍。

（一）甲型肝炎病毒

HAV的实验室诊断以血清学检测为主，其基因诊断主要包括HAV RNA检测和HAV基因分型。

1.HAV RNA检测

（1）HAV RNA检测的方法：

主要包括核酸分子杂交、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、基因芯片法。

1）核酸分子杂交法：

其原理为利用非放射性核素（如地高辛、生物素、荧光物质等）或放射性核素（如 ³² P、 ¹⁴ C等）标记的HAV基因片段作为探针进行杂交反应，通过检测杂交信号判断标本中是否存在HAV RNA。

2）RT-PCR法：

RT-PCR法将RNA的逆转录和cDNA（complementary DNA）的聚合酶链反应相结合，其原理为将HAV RNA逆转录成cDNA，然后依据5'-NCR中的保守序列设计引物对HAV特异性cDNA进行PCR扩增，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后进行溴化乙锭染色或经Southern杂交或斑点杂交鉴定。

3）基因芯片法：

基因芯片技术因其信息量大、高效、快速、准确、可平行化等优点，在多种疾病的诊断和传染病病原体的筛查和诊断方面发挥着越来越重要的作用。其原理是根据人类致病病毒科和属的基因组序列中保守性基因序列，设计针对致病微生物的特异性基因探针，制备基因芯片。快速筛查到病毒核酸水平的基因芯片技术对于突发疫情的病原体筛查、确诊十分重要。

（2）HAV RNA定量检测的意义：

①检测粪便排毒情况；②早期检测污染的水源与食物，有利于及时监测和预防甲型肝炎的暴发；③检测甲型肝炎减毒活疫苗的病毒载量：实时荧光定量RT-PCR法具有快速、灵敏、特异、重复性好等优点，可应用于甲型肝炎减毒活疫苗生产过程中病毒载量测定及指导疫苗成品的配制。

2.HAV基因分型

根据HAV VP1/2A基因区核苷酸序列的差异，目前可将HAV分为7个基因型（Ⅰ～Ⅶ），其中Ⅰ～Ⅲ、Ⅶ型为感染人HAV，我国主要为基因Ⅰ型，Ⅳ～Ⅵ型为感染猿猴HAV。针对不同基因型设计不同的引物，利用RT-PCR法可扩增出相应的病毒基因组序列。

HAV基因分型的意义在于：由于HAV只有一个血清型，因此基因分型可为HAV流行病学调查，病毒变异和制定病毒防控策略提供理论和技术依据。

（二）丁型肝炎病毒

HDV的实验室诊断以血清学检测为主，其基因诊断主要包括HDV RNA检测和HDV基因分型。

1.HDV RNA检测

（1）HDV RNA检测的方法：

常用RT-PCR和核酸分子杂交法检测，敏感性和特异性均较高。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）选择HDV基因组保守区序列设计引物，具有快速、简便、特异和敏感等优点，且操作易于自动化。实时荧光定量PCR的出现，逐步取代了斑点杂交、原位杂交等技术。

（2）HDV RNA检测的意义：

HDV RNA是病毒存在的直接证据，其阳性提示存在HDV感染及病毒复制，是丁型肝炎确诊和疗效观察最直接的指标。

1）通过检测HDV感染的血清学标志物以及HBV RNA，结合HBV感染的检测，可作出HDV感染的实验室诊断。

2）在急性患者血清中检测到HDV RNA，是判断HDV在体内复制和具有传染性的指标。

3）在抗病毒治疗期间，HDV RNA可用于监视病情变化和判断预后。

2.HDV基因分型

许多丁型肝炎肝病毒株已被分离并测序，根据基因组核苷酸序列之间的差异，可将HDV分为3个基因型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型又分为ⅠA、ⅠB和ⅠC三个亚型，包含了大部分的病毒分离株，呈全球分布，病程多样化；Ⅱ型主要分布在亚洲，如日本、我国台湾地区等地，病程相对较轻；Ⅲ型主要分布在南非，可引起暴发性肝炎。我国HDV基因分型是在克隆我国不同省市HDV抗原编码区基因的基础上，与国外不同基因型的代表株进行核苷酸序列同源性比较，证明我国HDV病毒株属于基因Ⅰ型，其中河南、台湾地区以ⅠA亚型病毒株为代表，四川、广西以ⅠB亚型病毒株为代表，上海以介于ⅠA和ⅠB亚型间的中间过渡亚型病毒株为代表。在非洲，主要流行的为ⅠC亚型。

HDV基因分型的意义：①不同基因型的HDV感染者的临床预后和治疗效果不同。Ⅱ型比Ⅰ型、Ⅲ型致病性低，Ⅲ型与暴发性肝炎密切相关。②不同国家和地域的人群感染HDV的基因型不同，有利于流行病学的调查。

（三）戊型肝炎病毒

戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）属于嗜肝病毒科戊型肝炎病毒属，是一类直径为30～32nm的RNA病毒，其基因组为单股正链RNA（+ssRNA），结构为5'-NCR-NS-S-NCRPoly（A）-3'，全长约7.5kb。全基因组含有3个在部分区域有互相重叠的ORF，其中ORF1的核苷酸序列相对比较保守，主要编码与病毒RNA复制有关的非结构蛋白；ORF2的核苷酸序列最保守，其中与ORF3重叠的部分又是ORF2中最保守的部分，主要编码病毒的衣壳蛋白；ORF3包含在ORF2中，主要编码结构蛋白，编码产物为一种与细胞骨架相结合的磷酸化蛋白，参与病毒的复制、组装及免疫逃逸等多个过程。不同地区来源的HEV基因组结构基本相似，但基因组序列有一定的差异，同一地区的基因序列相对保持稳定。

HEV的实验室诊断以血清学检测为主，其基因诊断主要包括HEV RNA检测和HEV基因分型。

1.HEV RNA检测

（1）HEV RNA检测的方法：

核酸检测是戊型肝炎诊断的“金标准”，近年来HEV RNA检测的方法主要包括：逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、实时荧光RT-PCR和环介导等温扩增PCR等。这些PCR方法的优点是可检测患者血清及粪便中是否存在HEV RNA，对潜伏末期和急性早期的戊型肝炎患者进行早期诊断；但缺点是成本较高，标本前处理烦琐，且容易引起假阳性。其中荧光定量RT-PCR法快速、便捷、灵敏度且重复性好、特异性较高。

（2）HEV RNA定量检测的意义：

①早期诊断HEV感染；②对血清学检测结果进行确证：个别戊型肝炎患者血清抗-HEV IgM和IgG阴性，但粪便或血清HEV RNA阳性；③判断患者排毒期限；④分子流行病学研究；⑤检测戊型肝炎减毒活疫苗的病毒载量；⑥隐匿性HEV感染（无症状HEV RNA阳性）的诊断：在低流行国家和地区，器官移植供体以及血制品供体并不一定需要检测HEV，但在HEV 流行地区或供体是可疑HEV暴露者，应当检测HEV RNA；⑦评价和监测慢性戊型肝炎患者的抗病毒疗效。

2.HEV基因分型

根据HEV全基因组或ORF2的核苷酸序列的差异，可将感染人的HEV分为4个基因型：Ⅰ～Ⅳ型。Ⅰ型和Ⅱ型是在人体中发现的，目前尚未发现动物宿主，仅感染人，可造成人群间戊型肝炎大流行；Ⅲ型和Ⅳ型为人畜共患病原体，其自然宿主包括猪等多种野生哺乳动物，可引起急性散发性戊型肝炎。HEV基因型又可进一步可分为若干亚型（表5-20-26）。

最近，在HEV基因Ⅳ型中又发现了4h、4i、4l、4m、4n亚型，但是目前为止HEV仅有1个血清型。

HEV基因分型的意义：因为HEV仅有1个血清型，所以对其进行基因分型研究是十分必要的，可以深入了解HEV起源及其进化进程，有助于发现新的HEV基因型及开展流行病学调查，了解HEV各基因型之间毒力的强弱可为临床决策提供判断依据。

（1）流行病学调查：

由于同一地区的HEV基因序列相对保守，而不同地区的HEV基因变异较大，因此其分布具有一定的区域性。HEV基因分型的研究，有助于更好地了解HEV变异性和流行病学特征。HEV感染具有明显的地理分布特征。从世界范围来看，基因Ⅰ型主要分布于亚洲和非洲；基因Ⅱ型局限分布在中美洲和非洲；基因Ⅲ型广泛分布于世界各地；基因Ⅳ型主要分布于东亚地区。我国主要流行基因Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型，其中基因Ⅰ型主要分布在新疆和北京地区；基因Ⅲ型分布在上海及江苏；基因Ⅳ型是HEV优势基因型，地理分布尤为广泛，主要分布地区包括东北、华中、西北和华东等。

（2）感染后转归预测：

截至目前，HEV慢性感染的基因型均为Ⅲ型。基因Ⅲ型是原发于动物的人类条件致病病毒，偶然突破物种屏障后感染人体，并可出现慢性化病程，但同属人畜共患的基因Ⅳ型目前仍未发现慢性感染病例。

（3）诊断试剂盒及疫苗等的研发：

HEV基因分型的研究，可以为找HEV的共同抗原和通用性PCR引物，研制更加敏感、特异的HEV诊断试剂盒，研制行之有效的HEV基因工程疫苗及对HEV感染的预防和临床治疗提供重要的背景资料。

（江凌） r75mgjyHpgk+eHeW+FcuBDYjYd/tAdHROVgGzP3GL52sIjAvxc+Q9hKGe3UE2Tmo