第五节
磷酸戊糖途径与药物靶标

脑微血管内皮细胞参与的血液和中枢神经系统之间血脑屏障（BBB）的形成对于大脑正常功能行使至关重要。BBB的完整性主要是通过脑微血管内皮细胞间的紧密、黏附连接以及包围脑微血管内皮细胞的星形胶质细胞终足实现的，进而维持中枢神经系统稳态。脑组织自身不能产生也无法储存葡萄糖，而葡萄糖作为脑部最重要的养分必须依赖血液中葡萄糖的不断供应。人体每天产生的葡萄糖至少有一半供给脑部使用以维持大脑的正常运转。低血糖症是糖尿病患者因过度治疗而发生的一种医疗急症，血糖过低可导致患者失去意识，并可能发展为脑水肿甚至不可逆脑损伤。低血糖还可破坏脑毛细血管紧密连接的完整性进而使脑血管病恶化。低血糖症在糖尿病患者中发生频率高，造成的影响不容忽视，但是低血糖所致内皮细胞紧密连接完整性破坏的机制尚不清楚，有待进一步的探索。

缺氧、低糖、氧化应激或硝化应激可导致脑微血管内皮细胞功能障碍或损伤。过氧亚硝基阴离子（ONOO ^- ）属于活性氮物种之一，由机体内一氧化氮（NO）和超氧阴离子（ ）反应产生，ONOO ^- 可使蛋白质发生酪氨酸硝基化和过氧化物酶泛素化以抑制前列环素合酶活性。前期研究发现在缺血性脑损伤进程中，硝化应激调控自噬过程。大量证据表明脑微血管内皮细胞是硝化应激在神经退行性疾病及其并发症发生发展过程中的主要作用靶细胞。总之，在神经血管损伤和BBB破坏的病理过程中，硝化应激引发的自噬激活和蛋白质功能破坏是重要参与环节，但是其相关机制尚未阐明。

一、TIGAR与神经血管保护作用

TP53诱导糖酵解和细胞凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator，TIGAR）存在磷酸激酶2活性，通过促进磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway，PPP）水解细胞水平的果糖 -2，6-二磷酸（fructose-2，6-bisphosphate）和果糖-1，6-二磷酸（fructose-1，6-bisphosphate），达到抑制糖酵解作用的目的。同时，TIGAR可以激活线粒体呼吸链反应，调节细胞在缺氧条件下的氧化还原代谢反应，促进细胞生存。近期研究表明TIGAR在脑缺血损伤过程中显示出一定的保护作用，主要通过增加细胞NADPH水平，促进抗氧化活性以限制氧化应激介导的细胞凋亡和线粒体自噬。

TIGAR过表达以对抗低糖应激的效果可以用正电子发射断层扫描（positron emi ssion tomography，PET）分析观察。在低糖条件下，野生型小鼠对氟代脱氧葡萄糖（fludeoxyglucose，FDG）的摄取增强，而TIGAR转基因小鼠对FDG的摄取则极为微量，这一现象表明了在低糖应激条件下TIGAR过表达可以经由磷酸戊糖途径代偿性改善脑内葡萄糖水平，以保护内皮紧密连接免受损伤。进一步研究表明，与低糖诱导损伤的对照组动物相比，TIGAR转基因小鼠展现出的血管保护作用主要是通过抑制紧密连接蛋白Claudin-5的降解，维护脑微血管内皮细胞紧密连接完整性而实现的。通过使用电子显微镜对小鼠脑皮层血管结构进行检测也可以得到相似的结果，胰岛素诱导的低糖应激模型小鼠体内的脑微血管损伤可以被TIGAR基因过表达逆转。综上所述，低血糖发生时脑微血管的完整性取决于TIGAR对内皮细胞紧密连接蛋白的保护，过表达TIGAR可以保护血管免受损伤。

二、TIGAR与低糖应激

当低血糖发生时，TIGAR扮演的是敏感生物传感器的角色。在无糖培养基另加葡萄糖的培养条件下，通过蛋白免疫印迹实验对培养24小时的人脑微血管内皮细胞（HBMEC）进行分析，观察到TIGAR表达量随葡萄糖浓度增高而增高。此外，在低糖应激条件下，TIGAR表达量短时间内（1～12小时）随时间延长而增强，但在24小时后与对照组相比表达显著下降。

脑微血管内皮细胞的紧密连接蛋白如密封蛋白-5（Claudin-5）、闭锁蛋白（Occludin）的表达量是反映BBB通透性的关键指标。HBMEC转染携带Claudin-5和GFP基因的慢病毒载体（GFP-Claudin-5），表达72小时后，使用抗体对TIGAR进行荧光标记，免疫荧光图像分析结果显示，内皮细胞中TIGAR和Claudin-5存在共定位。同时，在低糖应激条件下，观察到Occludin和JAM-A呈现出时间和浓度依赖性的降低，并伴有c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）蛋白磷酸化水平升高及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达上调。在对照条件下，TIGAR与脑微血管内皮细胞紧密连接存在亚细胞定位，然而在低糖损伤24小时后，TIGAR表达量显著减少且紧密连接失去完整性。HBMEC给予24小时低糖刺激后，分别转染空载体，重组人类TAT-TIGAR和LV-GFP-TIGAR，结果显示TIGAR过表达可以抑制Occludin和JAM-A的降解。此外，在低血糖条件下给予TIGAR抑制剂3-PO处理，观察到JNK（Thr183/Tyr185）磷酸化蛋白表达出现浓度依赖性增高而脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白表达出现浓度依赖性下降。由此提示，TIGAR在低糖应激条件下对脑微血管内皮细胞起保护作用。

通过形态学技术进一步评估TIGAR对低血糖引发的紧密连接损伤的保护作用。细胞免疫荧光分析显示Occludin在脑微血管内皮细胞中的亚细胞定位，在低糖刺激下，Occludin在细胞膜表面呈现弥散性分布，而TIGAR的过表达抑制Occludin降解并保护内皮细胞紧密连接的连续性及完整性。使用电镜观察内皮细胞紧密连接的超微结构，结果显示，正常条件下内皮细胞紧密连接出现在细胞与细胞相接触的区域，给予低糖处理后这种紧密连接结构会随着低糖应激增强而破坏，通过过表达LV-TIGAR可抑制低糖诱导的细胞间紧密连接结构的异常破坏。以上结果表明，TIGAR对脑微血管内皮细胞紧密连接完整性具有保护作用。

三、硝化应激与TIGAR的酪氨酸硝基化

内皮细胞紧密连接蛋白的表达对于维持BBB功能至关重要。越来越多的证据表明褪黑素在脑损伤中发挥血管保护作用。免疫组化显示，在低糖条件下，脑微血管内皮细胞Claudin-5表达显著降低，相比之下，褪黑素处理可抑制内皮细胞在低糖应激期间Claudin-5的降解。同样的，在低浓度葡萄糖暴露条件下观察到另一种紧密连接蛋白Occludin出现类似下调，但在褪黑素（400nmol/L）作用下蛋白表达显著恢复。这些结果有助于进一步解析褪黑素在低糖应激时保护紧密连接免受损伤的潜在机制。

过氧亚硝基阴离子（ONOO ^- ）由一氧化氮（NO）与超氧化物（ ）反应生成，是一种能引起细胞应激和炎症的活性氮物质。那么，低糖应激时脑微血管内皮细胞TIGAR功能障碍是否与硝化应激有关？通过蛋白免疫印迹实验证实，低葡萄糖培养条件可诱导酪氨酸硝基化水平增加；NP3荧光探针用于表征低糖刺激下人脑微血管内皮细胞（HBMEC）中ONOO ^- 的形成，结果发现低糖应激导致ONOO ^- 的形成显著增加，而褪黑素可减少ONOO ^- 的形成。因此假设，在低糖损伤内皮细胞的过程中，TIGAR功能障碍和紧密连接损伤需要硝化应激信号转导的参与。质谱联用免疫共沉淀法可用于分离蛋白的鉴定，将TIGAR免疫沉淀后，用MALDI/TOF质谱法鉴定候选结合蛋白，具有较高的置信度的29种不同蛋白质被鉴定并划分为功能组。其中，由于钙调蛋白参与了亚硝基氧化还原平衡的调节，被认为是一种TIGAR诱导自噬的潜在抑制剂。为了实时监测钙调素与TIGAR结合的动力学变化，利用青色荧光蛋白（cyan fluorescent protein，CFP）标记的钙调素（CaM-pECFPC1）和黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）标记的 TIGAR（TIGAR-pECFPC1）开发了一种基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的荧光定量分析方法。YFP光漂白前后的CFP图像表明，两组受体的荧光相似，HEK-293细胞中CaM-pECFPC1与TIGAR-pEYFPC1共表达48小时的图像显示，YFP（受体）漂白导致荧光增加18%。TIGAR的活性部位含有3个氨基酸（2个组氨酸和1个谷氨酸），被称为“催化三联体”，这与它的磷酸酶反应活性有关。为了研究硝化应激在低糖条件下是否导致TIGAR功能障碍，使用ONOO ^- 体外孵育重组TIGAR并进行SDS-PAGE电泳，对电泳后的凝胶银染切除凝胶斑点，使用胰蛋白酶和糜蛋白酶消化后，通过LC/MS/MS进行分析。结果表明，硝基化作用导致3-硝基酪氨酸多肽发生质量转移。因此，TIGAR可以在92位的酪氨酸残基（Y92）处被硝基化。

TIGAR的活性位点是开放的、带正电荷的，对6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶具有双功能活性。为了评估TIGAR中构成催化三联体的3个氨基酸是否影响TIGAR活性，于是对92位酪氨酸硝基化位点进行突变构建了一个突变的TIGAR（Y92A）。蛋白免疫印迹实验表明脑微血管内皮细胞在低糖培养条件下，TIGAR（Y92A）的突变取消了对紧密连接蛋白Occludin的保护作用，而且，免疫荧光实验进一步证实了低糖应激的内皮细胞紧密连接完整性遭到破坏。脑微血管内皮细胞表达非活性的突变TIGAR可使Claudin-5的降解加剧，而过表达活性TIGAR可保留Claudin-5的正常表达。同样，在低糖应激条件下，Occludin表达呈现出类似的结果。倘若低糖应激条件下内皮细胞过度自噬是由于TIGAR功能下降所致，那么是否可通过增强TIGAR表达维持磷酸戊糖途径来预防？实验表明，TIGAR过表达可进一步增强NADPH水平，这意味着TIGAR（Y92A）突变可逆转增加的磷酸戊糖途径通量。因此，TIGAR 92位酪氨酸对其正常功能的维持至关重要，TIGAR硝基化位点的突变足以阻断增加的磷酸戊糖途径通量，并废除TIGAR对紧密连接完整性的保护。

四、低糖应激时TIGAR对自噬的调控作用

自噬是细胞经由溶酶体降解胞内物质的自我调控过程，为细胞以及生命活动提供能量和物质。在正常生理状态下自噬主要发挥清除代谢产物，改善细胞存活环境的功能，但是当细胞处于持续应激状态（包括脑缺血、葡萄糖剥夺、缺氧和活性氮成分等）时，自噬可能被过度诱发而对细胞产生消极影响。大量证据表明自噬和细胞凋亡也许在时间先后上存在一定的关联性，自噬的异常可能导致细胞功能失调，甚至促进细胞死亡。LC3是细胞内重要的自噬标志物，细胞质内LC3-Ⅰ可进行脂化反应转化为活性形式LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ被认为是细胞启动自噬反应的指示器。已有研究表明神经退行性疾病发生过程中自噬作用增强。但是，在低糖应激条件下，脑微血管内皮细胞自噬作用增强或抑制的变化规律尚未明确。

TIGAR是经由何种机制保护脑微血管内皮细胞的？在这期间自噬环节是否参与其中？通过以下实验对以上问题进行阐述。在无糖培养基外加葡萄糖的培养条件下，LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的转化随着给予葡萄糖浓度的降低而增高。并且，在低糖应激处理24小时条件下，同样观察到LC3-Ⅱ的表达随着时间增长而增高的现象，表明了自噬过程的活化。这些结果表明低糖应激扰乱了脑内皮细胞的自噬调节。为了标记及追踪LC3以及自噬流的变化，使用稳定表达红色荧光和绿色荧光蛋白双重标记LC3的质粒mRFP-GFP-LC3对脑微血管内皮细胞进行转染，确证了在低糖应激条件下脑微血管内皮细胞自噬过程被诱发，相关结果表明在24小时低糖应激处理过程中，自噬随着时间依赖性增强，主要表现为LC3-Ⅱ水平的升高。自噬体与溶酶体融合抑制剂氯喹能够促进细胞内mRFP-GFP-LC3斑点的形成，提示自噬流阻断可进一步加重自噬体的累积。在低糖外加氯喹条件下自噬体的累积导致LC3荧光斑点数目增加，提示仅低糖条件下可能存在自噬体的生成增加，与溶酶体的融合也增加。以上结果表明自噬参与低糖应激导致的脑微血管内皮细胞损伤病理过程中。

使用巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1）进一步验证在低糖应激下自噬抑制剂对脑微血管内皮细胞的作用，以此来探讨自噬和脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白降解之间的关系。药物bafilomycin A1是溶酶体膜上H ⁺ -ATP酶阻断剂，可有效升高溶酶体腔内pH，扰乱自噬体与溶酶体的融合。在缺乏bafilomycin A1的情况下，对照组细胞LC3-Ⅱ的表达量随着时间没有出现变化；但是当使用了bafilomycin A1后，LC3-Ⅱ的水平在6～24小时内明显增加，表明自噬流的确存在。在没有bafilomycin A1的情况下，低糖应激处理12小时和24小时间LC3-Ⅱ出现增加，在6小时、12小时、24小时的节点我们记录到了bafilomycin A1存在条件下LC3-Ⅱ随着时间进一步增加。同时，在bafilomycin A1处理后，Occludin表达与单独低糖处理相比出现上调。有趣的是，在低糖条件下给予TIGAR抑制剂3-PO处理，诱发LC3-Ⅱ的进一步积累，伴随紧密连接蛋白Occludin和ZO-1降解增加。而在bafilomycin A1和3-PO共同处理时，在6小时、12小时、24小时节点观察到在3-PO导致的LC3-Ⅱ水平增加的基础上，LC3-Ⅱ累积进一步增加，同时，Occludin和ZO-1蛋白的表达量出现回升。

转染siRNA敲低Atg5可显著减少LC3-Ⅱ的表达量，在低糖应激处理24小时条件下，脑内皮细胞Occludin蛋白降解减少以及JNK蛋白磷酸化水平也随之降低，说明自噬在低糖应激条件下介导了脑微血管内皮细胞的损伤。进一步发现重组人类蛋白TAT-TIGAR可以抑制低糖应激下脑微血管内皮细胞内LC3-Ⅱ的积累。为了进一步验证以上结果，GFP标记的TIGAR质粒转染HBMEC后给予24小时低糖应激刺激，可观察到JNK蛋白磷酸化水平和LC3-Ⅱ的表达显著减少。在低糖应激条件下，LC3-Ⅱ的表达量增加，且增加程度经3-PO处理后显著放大。细胞免疫荧光分析发现，在低糖应激下内皮细胞中RFP-GFP-LC3所标记的囊泡积累量增加，且在低糖应激后再给予3-PO处理可观察到RFP-GFP-LC3斑点形成增加。利用透射电子显微镜观察由低糖诱发的自噬体的形成，成功观察到低糖应激下内皮细胞中的自噬体和自噬溶酶体的鲜明特征，而TIGAR过表达则可明显抑制自噬体的形成。综上所述，以上实验结果证明了低糖应激引发的自噬损伤脑微血管内皮细胞紧密连接，而TIGAR可通过抑制过度自噬/自噬流紊乱减弱低糖应激对脑微血管内皮细胞紧密连接的损伤。

五、小结

综上所述，低糖应激条件下，TIGAR转基因小鼠可保护脑部微血管免受损伤。TIGAR通过增强磷酸戊糖途径，增加NADPH含量，保护脑微血管内皮细胞紧密连接。通过抑制TIGAR的钙调蛋白依赖性硝基化作用，可限制过度自噬，消除低糖诱导的紧密连接蛋白Occludin和Claudin-5的降解。基于对脑微血管病变机制的解析和药物靶标的发现，对重症低糖诱导的神经血管损伤有保护作用的候选药物具有临床转化潜力。

（王成坤 韩 峰）

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