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炎症参与急慢性脑血管病发生发展与转归病理过程。脑内炎症病理过程目前认为与白细胞、脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经元有关。因此，在掌握脑血管病病理机制的基础上，早期控制炎症危险因素是脑血管病防治的重要手段。基于临床资料，细胞因子释放和脑微血管功能障碍可能是脑血管病的两个重要早期环节。
炎症在缺血后脑的病理事件中起关键作用，因为它加剧了缺血核心区的早期损伤并延迟了半影中的神经元死亡。炎症的影响不仅限于脑部病变，因为全身性免疫抑制是通过自主神经系统继发于脑缺血之后，使脑卒中患者容易遭受继发性感染。嗜中性粒细胞是在缺血性脑部受损区域周围积累的首批血液来源细胞，从而导致BBB破坏和脑水肿并加重组织损伤。小胶质细胞是脑内的主要免疫效应细胞，在受到外界危险性因素损害后，小胶质细胞从静息状态快速向活化状态转变，其活化具有特有的免疫反应模式，即分化、增殖，免疫分子表达上调，巡游至受损害部位，发生形态、免疫显型和功能改变。神经元在发生致死性损害病理条件下，小胶质细胞转变为阿米巴样细胞，释放细胞毒素和炎症介质，分泌细胞因子，不断放大炎症反应，构成脑部疾病发生发展的重要分子基础之一。
虽然已证实白细胞与活化内皮细胞的黏附是脓毒症相关的中枢神经系统功能障碍的早期事件，但是这一事件的触发因素和白细胞黏附导致脑病发展的机制仍不确定。脓毒症脑病（septic encephalopathy，SE）是脓毒症的严重并发症，可导致脑萎缩、认知障碍，甚至死亡。为了更加确切地深入研究血管腔内的炎症与脑实质内的小胶质细胞的炎性反应之间的关系，有学者巧妙地采用SE的病理模型来开展了相应的研究。小胶质细胞作为大脑中独特的初级免疫细胞，主要功能是预防脑损伤，但是小胶质细胞激活也会增加活性氧的产生并导致缺血性脑损伤。因此，研究找到脓毒症期间白细胞黏附和小胶质细胞过度活化的潜在联系是十分必要的。
此外，白细胞向脑内的迁移过程中，小胶质细胞激活的确切作用除了清除、防御功能外，其过度激活是否恶化SE预后，这些关联问题的答案均未知。综上所述，鉴于脑微血管白细胞黏附—小胶质细胞—神经元的网络系统参与SE临床病理过程的复杂性，其确切分子机制亟待阐明。
通过在体双光子激光扫描显微镜（two-photon laser scanning microscopy，TPLSM），结合基因敲除和药物阻断的方法，研究首次证明内皮细胞中P2RX 7 激活是启动SE期间白细胞黏附和小胶质细胞募集的关键步骤，证明了P2RX 7 通路在体内将神经血管炎症与脑损伤连接起来的作用，并提供了SE期间靶向内皮细胞P2RX 7 可用于神经血管保护的理论依据，同时表明P2RX 7 信号通路可能是治疗SE的一个新靶标。
脓毒症患者的脑损伤主要存在于皮质和皮质下区域。在研究中，通过盲肠结扎和穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）制备的脓毒症小鼠模型，采集在体小鼠脑微血管的视频图像，进而研究在体单个脑微血管中白细胞与内皮细胞之间的黏附作用。研究发现，CLP后4小时，利用延时成像对滚动的、松散黏附/阻滞或牢固黏附的白细胞进行定量，其中沿血管壁内表面保持静止至少1分钟的罗丹明6G阳性单细胞被定义为牢固黏附的细胞。相比之下，假手术组小鼠的白细胞多是滚动的或较少黏附在皮质微血管系统。然而，CLP后4小时手术组小鼠的黏附白细胞（包括松散黏附/阻滞或牢固黏附）数量较假手术组小鼠增加，并且至少持续16小时。同时，在CLP小鼠中，白细胞黏附伴随着脑微血管内白细胞滚动速度的显著降低。因此，内皮细胞活化和白细胞黏附可能是SE进展的早期阶段之一，这些结果也为小鼠CLP后白细胞黏附提供了第一个在体证据。
研究还通过用TPLSM成像捕捉了脓毒症后的早期先天性免疫反应，以确定 Cx3crl GFP/+ 小鼠白细胞与内皮细胞黏附的动态变化。实验结果显示，与对照组相比，CLP小鼠的脑微血管周围变形的小胶质细胞数量增加。分析体内小胶质细胞激活的定量指标表明，CLP后4小时在炎症血管周围，小胶质细胞数、细胞体积大小和偏心率均增加，并在至少16小时内保持升高状态。这些分析结果表明了CLP后小胶质细胞的形态学变化和白细胞与内皮细胞黏附存在一定的关联性。
在CLP后4小时，在手术组小鼠中激活的小胶质细胞的形态和运动的变化是明显的，但在假手术小鼠中没有变化。此外，小胶质细胞的活化和再分布取决于与CLP小鼠发炎血管的距离。线性相关分析表明，CLP期间白细胞与内皮细胞黏附和小胶质细胞面积的变化密切相关。为了进一步确认白细胞与内皮细胞黏附和小胶质细胞活化之间的关系，研究通过使用抗粒细胞受体-1（granulocyte receptor-1，Gr-1）单克隆抗体中和清除白细胞，发现治疗后可显著抑制小胶质细胞活化。
通过使用在体TPLSM来研究脓毒症小鼠大脑中白细胞黏附的动态发病机制，可提供重要的在体证据，证明脓毒症增加了白细胞与脑微血管系统之间的黏附，并且这种效应与小胶质细胞的激活以及它们向炎症部位的迁移有关。白细胞-内皮细胞相互作用是控制脓毒症炎症进展的限速步骤，而白细胞-内皮细胞黏附的体外生化分析无法反映脓毒症小鼠大脑中病理进展的时间和空间变化，而应用在体TPLSM可在大大提高脑组织深处的空间分辨率的同时允许在活体动物上长时间动态测量不同类型细胞的运动，因此在体TPLSM在基础研究中的应用是极其重要的。
探讨脑微血管功能障碍和小胶质细胞过度激活在SE不同病理时期的关系，发现细胞水平、分子水平和基因水平所存在的复杂信号网络至关重要。CXCL1家族能够促进粒细胞黏附到脑毛细血管。在CLP后4小时，对脑微血管提取液中CXCL1、CXCL5、CXCL10、CX3CL1、CCL2和CCL3的mRNA分析显示，CXCL1和CX3CL1显著增加，同时也观察到CXCL1和CX3CL1在脑微血管中内皮细胞上的定位。研究还检测到CLP后4小时内CXCL1的血浓度升高，而CX3CL1没有变化。SE血中CXCL1水平的增加可能是由于来自内皮细胞的趋化因子蛋白水解切割引起的。
β 2 整合素和ICAM-1的结合对于循环的白细胞与内皮细胞的黏附是至关重要的。研究数据表明，在脓毒血症期间，是Mac-1/CR3（CD11b/CD18）而不是淋巴细胞功能相关分子-1（lymphocytefunction-associated antigen-1，LFA-1）（CD11a/CD18）在白细胞黏附到血管内皮的过程中起到关键作用。此外CLP后4小时，ICAM-1在内皮细胞上的表达处于持续激活状态。
为了进一步了解β 2 整合素/ICAM-1通路在脓毒症中的作用，在CLP小鼠中使用CXCL1中和抗体。研究发现使用CXCL1中和抗体治疗后4小时显著降低了罗丹明6G标记的白细胞与脑微血管的黏附。此外，CXCL1中和抗体治疗后，在CLP小鼠中观察到ICAM-1水平降低。有趣的是，CXCL1的中和也降低了由CLP诱导的CXCL1和CX3CL1的mRNA水平。相反，使用CCL2或CXCL7中和抗体治疗不能降低CLP小鼠白细胞的黏附或ICAM-1的表达。
CXCL1通过β 2 整合素/ICAM-1信号促进白细胞黏附。研究利用CD18低形态突变小鼠（β 2 整合素蛋白表达极低）检测β 2 整合素/ICAM-1通路是否也参与CLP诱导的CX3CL1表达。与野生型小鼠相比，突变型小鼠CLP后白细胞黏附力显著降低。突变型小鼠CLP后白细胞上β 2 整合素（CD18）的表达不再增加，而且CLP诱导的CXCL1的mRNA不再增加。这些结果均表明β 2 整合素及其内皮细胞的配体不仅与白细胞黏附于内皮细胞有关，而且与CLP诱导的CX3CL1依赖性小胶质细胞活化有关。
研究证实，CX3CL1-CX3CR1信号转导是以小胶质细胞趋化和活化为基础的细胞间通讯。CLP后大脑微血管提取物中CX3CL1的mRNA水平升高；外源性重组CX3CL1能够促进培养的BV-2小胶质细胞的迁移，但是CXCL1不能。更重要的是，CX3CL1中和抗体处理能够显著降低CLP小鼠中的小胶质细胞的活化。此外，为了确定CXCL1的升高是否需要CX3CL1，在CLP后对内皮细胞CXCL1 的mRNA进行了定量，发现CX3CL1处理对内皮细胞CXCL1 的mRNA或ICAM-1水平没有影响。综上所述，血管内皮细胞来源的趋化因子CX3CL1可以和小胶质细胞上的对应受体CX3CR1进行结合，最后触发了小胶质细胞的激活，这是一种非常重要的内皮细胞和小胶质细胞之间的通讯模式。
在CLP后利用一组标志物来鉴定引发白细胞黏附和小胶质细胞活化的脓毒性炎性刺激物，P2RX 7 和ICAM-1的双重标记结果显示它们在脑内皮细胞中同时激活。CLP后4小时脑微血管溶解物中P2RX 7 的免疫反应性增加，而P2RX 4 并未增加，这与内皮细胞NLRP3表达的升高是一致的。因此，P2RX 7 可能在脓毒性休克期间被大量释放的ATP激活。接下来，研究不同组织中内皮细胞P2RX 7 表达的生物学变化。RT-PCR分析显示，在CLP后至少4小时，P2RX 7 在主动脉和肾血管中的表达与假手术组小鼠相比没有显著差异，而小鼠脑微血管中P2RX 7 的mRNA表达水平高于主动脉和肾脏内皮细胞。
研究发现，P2RX 7 是通过激活NLRP3炎症小体和分泌促炎细胞因子IL-1β来调节免疫反应和疾病发生发展的。CLP后早期皮质中pro-IL-1β的处理和Caspase-1的激活增加，并在至少16小时内保持升高状态，同时MMP-9表达增加，这表明了神经血管的损伤。
P2RX 7 的活化可以通过P2RX 7 阳离子电流敏感方式增加IL-1β的释放，脑微血管中P2RX 7 受体的活化可诱导IL-1β的分泌。为了测试P2RX 7 的作用是否部分通过IL-1β介导，实验用IL-1β抗体处理小鼠后发现该处理显著抑制了白细胞与脑微血管的黏附，并在CLP后4小时增加了白细胞的滚动速度。而且，CLP后4小时ICAM-1和VCAM-1表达增加。IL-1β抗体处理还抑制了CLP诱导的ICAM-1的表达，但不抑制VCAM-1的表达。此外，IL-1β抗体处理还消除了CLP诱导的CXCL1和CX3CL1的mRNA水平的增加现象。
P2RX 7 是一种模式识别受体，是小胶质细胞行使免疫功能的信号转导受体之一，与小胶质细胞的增殖、激活密切相关。P2RX 7 信号被认为是一个激活小胶质细胞和调节其功能的重要控制开关，在与神经细胞的相互交联反应中扮演着重要作用。我们研究组成员前期已经发现在中枢神经系统炎性损伤病理过程中，P2RX 7 信号通路参与介导激活小胶质细胞，通过释放FasL等发挥神经细胞毒性作用。P2RX 7 抑制剂可以有效缓解炎症信号关联的中枢神经系统疾病。此外，最新研究发现神经系统中转录因子Sp1激活P2RX 7 ，直接导致P2RX 7 的表达水平上调，与中枢神经系统疾病密切相关。
王欢等研究了P2RX 7 信号转导对脓毒症小鼠白细胞与内皮细胞黏附的重要性。通过向脑室注射编码P2RX 7 特异性短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）的慢病毒载体，可以显著抑制罗丹明6G标记的白细胞与内皮细胞的黏附作用，而P2RX 7 shRNA对假手术组小鼠没有影响。通过脑微血管免疫染色和流式细胞术分析，发现P2RX 7 shRNA对ICAM-1的表达有抑制作用。通过慢病毒shRNA转染阻断P2RX 7 信号，可增加CLP小鼠的白细胞滚动速度，并降低CX3CL1小鼠的小胶质细胞的活化水平。此外，包载P2RX 7 shRNA的慢病毒转染显著降低了脑微血管提取物中CXCL1和CX3CL1的mRNA水平。这些结果均表明P2RX 7 参与了白细胞黏附和小胶质细胞活化的启动。
为了证实P2RX 7 激活是Mac-1/ICAM-1依赖性白细胞黏附所必需的，研究使用了P2RX 7 拮抗剂A438079。实验发现通过A438079阻断P2RX 7 可减少黏附白细胞的数量并增加其滚动速度。流式细胞术显示A438079降低了ICAM-1的表达，但对VCAM-1的表达没有影响。与此相一致，ICAM-1通过与白细胞上的特异性受体β 2 整合素（LFA-1和Mac-1）相互作用来启动白细胞的黏附，而VCAM-1则与单核细胞上的对应抗原结合，直到黏附位点成熟时才会聚集。此外，A438079的药理调控也抑制了由CLP诱导的CXCL1和CX3CL1在内皮细胞中的表达。由此，P2RX 7 的活化可增加ICAM-1的表达，从而导致白细胞与内皮细胞发生黏附。
P2RX 7 是一种非选择性阳离子通道，参与许多病理生理过程。为了研究其在内皮细胞上的功能性表达，并证实A438079阻断P2RX 7 介导的作用，在人脑微血管内皮细胞（HBMEC）中进行了全细胞膜片钳记录，在-70mV的电位下，短暂应用（10秒）ATP可诱发平均密度为2.46pa/pf的剂量依赖性内向电流。并且，使用A438079（10μmol/L）可以可逆地抑制由5mmol/L ATP诱导的电流。ATP（5mmol/L）增加了整个血管内皮细胞的斜率电导，并增加了向内和向外的电流。向外整流电流从11.86pa/pf增加到17.91pa/pf（与对照组相比 P <0.05），向内整流电流从4.38pa/pf增加到7.31pa/pf。而ATP引起的上述效应可被A438079阻断。P2RX 7 的异常激活会引起大分子量阳离子的流入，如荧光染料ethidium（et+），但可被A438079抑制。这些结果证实了P2RX 7 在脑内皮细胞的表达，主要参与调节阳离子通道的转导。
总体而言，炎症暴露条件下，白细胞与内皮细胞黏附、小胶质细胞活化和神经血管损伤之间存在级联效应。临床研究显示P2RX 7 的单核苷酸多态性增加了严重脓毒症患者的死亡风险。内皮细胞P2RX 7 信号是脓毒症重要触发点，阻断P2RX 7 通路可能有助于预防神经血管单元损伤，可能为危重症疾病提供合理的靶向治疗策略。更深入地了解P2RX 7 及其配体、相关蛋白的相互作用及对下游分子信号的调控，将有助于开发靶向P2RX 7 信号通路的激动剂或拮抗剂，为研发防治脑血管病的新药提供实验依据。
（孟伶通 韩 峰）
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