第五节
滋养层细胞合体化

妊娠过程中，合体滋养层（syncytiotrophoblast，STB）起着重要的作用，其在母体与胎儿间传递离子，交换营养物质，合成胎儿生长发育所需的激素、类固醇和多肽等。STB由细胞合体化（细胞融合）形成，合体化分为初级合体化和次级合体化。早期胚胎发育时，滋养外胚层细胞是最早表现出高分化潜能的细胞，可以通过两条路径发生分化：浸润型分化与合体化。合体化即单核的细胞滋养层细胞融合形成多核的STB；之后的胎盘STB则是由单核的细胞滋养层细胞融合到已有的STB而形成。目前，人们在体外构建了多种针对STB形成机制的研究模型：①分别在早期、中期、晚期及唐氏综合征的胎盘绒毛中分离原代细胞滋养细胞（cytotrophoblast，CTB）模型；②体外诱导BeWo等细胞合体化模型；③体外培养早期胎盘绒毛STB重生模型。

一、滋养层细胞合体化

（一）初级合体化

人类生命起源于受精卵。排卵后24~48小时，精子和卵子在输卵管壶腹部结合成受精卵，受精卵经历多次卵裂后发育至囊胚。囊胚由两类细胞组成：内细胞团和滋养外胚层。内细胞团继续发育形成胎儿，滋养外胚层细胞将继续分化为胚外组织，最终形成胎盘（Cockburn et al.，2010）。受精后第6~7日，囊胚从透明带中孵化出来并黏附到子宫内膜，即胚胎植入。人类胚胎植入是成功妊娠的关键，胚胎植入异常将引起妊娠失败。在植入过程中，胚胎主要通过胚胎外侧的一层多核细胞与母体建立联系（图2-5-1），这种多核细胞是由胚胎的滋养外胚层细胞通过合体化途径形成的STB。STB是胎儿与母体首次接触的细胞，在胚胎植入时发挥重要作用。

初级STB在胚胎植入时形成，尽管是最早与母体接触并建立母胎联系的胎儿组织，但基于伦理问题和实验方法的限制，对人类初级合体化的形态发生和功能研究十分有限，基本上停留于形态学观察阶段。对初级合体化最初的观察是受精后第7日胚胎植入到子宫内膜的组织学切片（图2-5-2）（Hertig et al.，1956），所以，在今后的工作中对初级合体化发生机制的研究尤为重要。

日趋成熟的人类胚胎体外培养技术已经使离体培养突破了10日以上，培养皿中胚胎经历的变化与在母体内发育的胚胎并无显著差异（Deglincerti et al.，2016；Shahbazi et al.，2016）。同时，胚胎子宫内膜三维共培养模型已用于对胚胎植入机制的研究，应用这个模型能够在体外条件下观察到合胞体的形成，是研究初级合体化的理想模型。

（二）次级合体化

STB的形成最早是在胚胎植入时发生，约在受精后第11日胚泡完全植入，胚胎完全被合体滋养层细胞覆盖，这时细胞融合（即初级合体化）停止。次级合体化发生在细胞滋养层细胞的顶端区和STB的基底膜间。一直到足月分娩，胎盘绒毛细胞滋养层细胞中都有一类具有增殖分化能力的细胞，这类细胞可分裂为两个细胞，其中一个与外围的STB发生融合，而另一个细胞继续保持有丝分裂特性。滋养层细胞的这种特性使STB的表面积增大，同时新融合的细胞可以取代老化的STB，并将这部分老化细胞代谢到母体血液循环中（Redman et al.，2007）（图2-5-3）。STB 的代谢过程对其结构维持、功能建立及通过脱落产物对母体的信号传递都十分重要。

初级STB与胎盘绒毛的合胞体功能也不尽相同。在围植入期，STB不仅是母胎屏障，而且具有浸润特性。妊娠3周后，主要具有浸润特性的绒毛外滋养层细胞突破STB的包围，逐渐侵入到母体血管。人类滋养层细胞的次级合体化可持续整个妊娠过程，形成的STB覆盖在胎盘绒毛表面，主要负责妊娠相关激素（hCG和孕酮等）的分泌，以及母胎间营养物质和代谢废物的交换。

二、融合分子

（一）内源性逆转录病毒膜糖蛋白

滋养层细胞的融合是一个受到精细调控的过程，多种转录因子、膜蛋白、细胞因子、生长因子及细胞骨架等均参与调节。其中，Syncytin是迄今发现的促进胎盘滋养层合体化的融合分子（fusogen），其表达直接介导细胞融合。

Syncytin是人类内源性逆转录病毒家族（human endogenous retroviruses，HERVs）基因编码的膜糖蛋白，目前在人类基因组中发现 syncytin-1 和 syncytin-2 ，分别由 HERV-W 和 HERVFRD 编码（Mi et al.，2000）。据报道，在 2 500 万~4 000 万年前，不同种系的逆转录病毒侵入灵长类动物的生殖细胞并整合到宿主基因组。在漫长的进化过程中，HERVs经历反复扩增、转座等事件后，在基因组产生多拷贝和单拷贝的原病毒。

另外，HERVs与目前的外源性逆转录病毒具有相似的基因结构，如人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、人T细胞白血病病毒（human T cell leukemia virus，HTLV），均由两个长末端重复序列（long terminal repeats，LTRs）间的 gag、pol和 env 区域组成（Renard et al.，2005）。已知HERVs构成了人类基因组的8%，并且已经鉴定了超过20个HERVs成员，尽管在编码序列中有突变、缺失和提前出现编码终止信号等缺陷，小部分HERVs还是有生产病毒产物和病毒类颗粒的能力。

逆转录病毒包膜蛋白锚定于宿主病毒膜中，这些蛋白由两个亚基组成，一个是跨膜（transmembrane，TM）亚基，另一个是细胞表面（surface，SU）亚基。TM亚基主要负责膜融合，包含一个疏水肽段，在介导病毒与细胞膜融合时，能穿透靶细胞的细胞膜，而SU亚基主要对靶细胞的细胞膜受体识别和黏附发挥作用。

在已检测的23种人体组织中， syncytin-1 在胎盘组织特异性高表达。妊娠早期的绒毛及绒毛外组织中均发现 syncytin-1 的转录产物，且妊娠早、中期的绒毛滋养层细胞也检测到Syncytin-1蛋白，在原代培养的细胞滋养层细胞自发融合过程中，Syncytin-1表达上升，同时用腺苷酸环化酶（cyclicadenosine monophosphate，cAMP）类似物forskolin处理细胞也可使其表达升高（Mi et al.，2000）。通过RNA干扰降低原代培养滋养层细胞中 syncytin-1 的表达可显著抑制细胞自发融合，说明 syncytin-1 在滋养层细胞融合中发挥重要作用（Frendo et al.，2003b）。因此， syncytin-1 可视作人类滋养层细胞融合的标志分子。

Syncytin-2蛋白仅表达于部分绒毛滋养层细胞（Vargas et al.，2009）。在早期绒毛中，Syncytin-2定位于细胞滋养层细胞。与Syncytin-1不同的是，Syncytin-2在合体滋养层（STB）和绒毛外滋养层细胞中并不表达，说明两种蛋白的调控机制可能不同。Syncytin-2的受体是MFSD2，属于跨膜碳水化合物转运蛋白超家族，原位杂交结果显示该受体表达仅限于STB。体外实验表明，Syncytin-1、Syncytin-2都能够诱导多种细胞发生融合形成巨大的合胞体。目前，Syncytin-1、Syncytin-2在胎盘发育过程中，特别是细胞滋养层细胞融合形成STB的过程中起重要作用。膜融合的起始需要由Syncytin-1与两个氨基酸转运蛋白结合来启动（Kudo et al.，2002；Jansson，2001）。在滋养层细胞中过表达Syncytin，可以观察到大量发生融合的细胞，然而这些融合细胞的功能与特征是否与其他滋养层融合模型中的多核细胞一致，尚无报道。

（二）参与细胞融合的蛋白

重要的组织特异性融合蛋白家族还有去整合素和金属蛋白酶结构域（a disintegrin and a metalloproteinase domain，ADAM）蛋白（Stone et al.，1999；Huovila et al.，1996）。该蛋白家族中有30多个成员，含有去整合素和金属蛋白酶结构域。同时，该蛋白家族多含疏水性融合多肽，在细胞融合中发挥关键作用。

ADAM蛋白家族中Fertilin α和 Fertilin β（ADAM-1和ADAM-2）在小鼠精子-卵子融合中发挥重要作用，但不参与人类的精子和卵子融合。Meltrin（ADAM-12）也是 ADAM蛋白的家族成员，参与合胞体融合，促使肌原细胞融合形成骨骼肌纤维和破骨细胞。ADAM蛋白促使细胞膜脂质重组来完成磷脂酰丝氨酸外翻，Fertilin融合肽与脂质膜的结合力，最终导致细胞间相互融合。静电吸引在这个融合过程中起至关重要的作用，磷脂酰丝氨酸带负电荷，它的外翻为细胞表面融合蛋白发挥功能，提供负电荷环境。

研究结果表明，ADAM蛋白可能是多种细胞发生融合的候选分子。人类胎盘中发现ADAM-12的mRNA证实了这一假设。

（三）其他相关分子

丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）胞外信号调节激酶1/2（extracellular regulated kinase 1/2，ERK1/2）和p38在细胞分化和融合过程中发挥重要作用。特异的ERK1/2和p38抑制剂可以抑制原代滋养层细胞自发融合（Daoud et al.，2005）。

另一个可能参与滋养层细胞融合的调控因子是蛋白激酶 A（protein kinase A，PKA）。瞬时表达PKA的催化亚基可以促进BeWo细胞（绒毛膜癌滋养层细胞系）融合。经PKA的激活剂forskolin处理的BeWo细胞可以使胶质细胞缺失同 源基因 1（glial cells missing homolog 1， GCM1 ）的表达上升（Knerr et al.，2005）。 GCM1 是第一个被发现参与滋养层细胞融合的转录因子，在人胎盘中 GCM 1 可以激活 syncytin-1 和 syncytin-2 的转录（Lin et al.，2005）。

氨基酸转运蛋白CD98对滋养层细胞融合也有重要作用（Kudo et al.，2003）。在 BeWo细胞中干扰CD98的表达，可显著抑制细胞融合（Kudo et al.，2004）。当 CD98 与其配体 galectin 3 结合受抑制后，BeWo细胞融合程度也会下降（Dalton et al.，2007）。

除上述分子外，connexin家族成员也在滋养层细胞融合 过程中发挥重要作用，connexin 43被干扰后，BeWo细胞融合被抑制（Frendo et al.，2003a）。细胞融合时，细胞骨架发生改变，细胞间黏附分子被降解。Caspases家族成员能特异地参与细胞骨架和细胞间黏附分子的降解，该家族成员在细胞凋亡中发挥重要作用。这些蛋白参与细胞融合的过程如图2-5-4所示。此外，一些细胞间的连接分子，如connexin 43、ZO-1等也参与了滋养层细胞融合。

三、滋养层细胞合体化与细胞周期

胎盘绒毛中只有细胞滋养层细胞具有DNA合成能力，例如，在妊娠第6~9周绒毛中，1.5%~2.9%的细胞具有有丝分裂活性，而合体滋养层（STB）中未检测到有丝分裂活性，因此细胞周期调控对于滋养层细胞的功能意义重大（Kar et al.，2007）。细胞滋养层细胞具有增殖能力，在保证自我更新的基础上提供分化所需的细胞库，而STB不能增殖，在其中也未观察到具有分裂象的细胞核。基于此，一般认为细胞滋养层细胞需要退出细胞周期才能发生融合，在这一过程中需合成更多细胞器增加代谢活动。

四、细胞融合中的早期凋亡事件及磷脂酰丝氨酸外翻

近年来，人们通过对细胞凋亡级联反应的研究，对STB的产生有了新的认识。合胞体在母胎界面经历一个动态平衡的过程，即细胞融合形成合胞体，老化的合胞体脱落形成合胞体结节，这样维持了合胞体的稳态。在此过程中发生一系列早期凋亡事件，在部分分化的细胞滋养层中能够检测到活性形式的Caspase 8和Caspase 10。人早期胎盘绒毛外植体培养实验发现，Caspase 8的抑制剂或干扰片段能够显著抑制细胞融合（Black et al.，2004）。同时，最近研究发现，forskolin可诱导滋养层细胞中Caspase 14表达升高，提示该分子也可能参与滋养层细胞融合（White et al.，2007）。Caspase可介导磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻，导致细胞膜外侧积累大量负电荷。

合胞体中的细胞凋亡不会立刻介导细胞死亡，相反，即将融合的滋养层细胞会高表达凋亡抑制因子（Mcl1、Bcl-2），阻碍其细胞凋亡的生物学进程，增强绒毛合胞体的代谢能力和运输能力。在此之后，细胞凋亡级联反应重新开始直至最后完成，凋亡的合胞体（即合胞体结节）脱落，进入母体血液循环。

PS外翻是细胞融合的先决条件，在细胞滋养层细胞原代培养和绒毛外植体中都得到了证实。采用forskolin使绒毛膜癌细胞发生融合时，加入与细胞外膜的磷脂酰丝氨酸蛋白辅酶因子结合的单克隆抗体，可阻滞细胞融合的发生。

五、滋养层细胞合体化异常与相关疾病

目前，研究表明，胎盘滋养层合体化异常与子痫前期的发生相关（Huppertz et al.，2013）。胎盘合体化异常可能引起如子痫前期、习惯性流产等妊娠相关疾病（Roberts et al.，2005）。

子痫前期是一种严重的妊娠疾病，影响着5%~8%妊娠女性的健康并危及孕妇和围产期婴儿的生命。子痫是我国引起孕产妇死亡的主要原因之一，其死亡率高达2%~5%，在初产妇、有高血压及血管疾病的孕妇中更为常见，约每200例子痫前期患者中就有1例发生子痫。目前认为子痫前期是一种由多因素和多基因突变导致的复杂疾病。已知凝血、胎盘发生、血管发生、免疫调节、氧化应激调节、脂代谢调节等相关基因的表达变化和单核苷酸多态性与子痫前期发病密切相关，其中，胎盘因素尤为重要，患者症状在移除胎盘后可快速得到改善。子痫前期患者胎盘中 syncytin-1 、 syncytin-2 和 GCM1 的mRNA和蛋白表达都降低，说明子痫前期胎盘细胞融合能力可能变弱（Chen et al.，2008；Chen et al.，2006；Chen et al.，2004）。

习惯性流产（habitual abortion）又称反复自然流产（recurrent pregnancy loss，RPL）或复发性流产（recurrent miscarriage），指妊娠20周之前连续3次及3次以上发生自然流产，每次流产往往发生在同一妊娠月份。约5%的育龄期女性有两次以上习惯性流产，约1%的育龄期女性受到3次以上习惯性流产的困扰，并且这一比例近年来仍有上升的趋势。如前所述，STB分泌妊娠建立和维持及胎盘发育所必需的最关键激素hCG和孕酮。胚胎植入后，胎盘绒毛合体滋养层分泌的hCG刺激黄体分泌孕酮，之后孕酮由STB合成。由此可见，胎盘合体化的异常将导致hCG和孕酮分泌异常，极可能是引发习惯性流产的原因。目前尚无 syncytin-2 在习惯性流产绒毛中表达水平的报道。

若 HERV-W 和 HERV-FRD 基因发生突变，则会导致Syncytin-1、Syncytin-2功能异常，从而影响滋养层细胞的融合及胎盘绒毛的发育并引发多种妊娠疾病，如子痫前期、胎儿生长受限、习惯性流产等。

（王红梅　中国科学院动物研究所） GUNFq+164neuwT7EfViMK5v37IVHxYqNCSSmERtBmFq4uaguZjtgiN4E+/zDB0c7