第四节
神经系统疾病的细胞免疫学检查及其诊断意义

细胞免疫学检查主要针对免疫活性细胞，如T细胞数量和功能，T淋巴细胞亚群，单核细胞和巨噬细胞功能及NK细胞功能进行检测。本节对这些细胞的功能检测进行概述。

一、T细胞功能检测及其诊断意义

（一）T细胞花环试验

T细胞表面具有能与绵羊红细胞（SRBC）表面糖肽结合的受体，称为E受体（CD2），可与SRBC形成花环样细胞团。通过花环形成检查T细胞的方法，称为E花环形成试验。根据花环形成的多少，可测知T细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态。淋巴细胞悬液加入等量1%绵羊红细胞悬液及0.1ml小牛血清，混匀。37℃水浴5min，500转/min，离心5min，放4℃冰箱20min。弃去适量上清，轻轻摇匀，加0.8%戊二醛1滴，混匀后置4℃冰箱15min。取出后轻轻混匀涂片，自然干燥。随后进行瑞氏染色，将瑞氏染液加于玻片上先染1min，再滴以等量的蒸馏水，轻轻晃动混匀，继续染5min水洗，干后镜检。油镜检查：淋巴细胞呈蓝色，SRBC呈红色围绕淋巴细胞形成花环，凡表面黏附有3个或3个以上SRBC者为花环形成细胞（即E阳性细胞）。计数200个淋巴细胞，算出花环形成百分率，并推测其T淋巴细胞百分率。正常值为一定数量正常人的测量值（X ± SD）。

（二）T淋巴细胞转化试验

T淋巴细胞在体外培养过程中受到有丝分裂原如植物血凝素（PHA）刺激，可转化为体积较大的母细胞，核内生成核仁，部分细胞发生分裂。此种转化能力可反映机体的细胞免疫功能（图2-4，表2-5）。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。 ³ H-TdR掺入法：细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制，这是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。一般来说，一个细胞周期可大致分为四期，即G ₁ 期、S期、G ₂ 期和M期。其中S期为DNA合成期，主要功能活动为DNA合成。 ³ H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷（［3H-methyl］thymidine），是 DNA 合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的 ³ H-TdR就越多，因此，用液体闪烁仪计数每分钟脉冲数（cpm），即所掺入的 ³ H-TdR就可反映细胞增殖的程度。被某种抗原致敏的T淋巴细胞，在体外再次遇到相应抗原时，转化为母细胞，称特异性转化。由于抗原作用较弱，故特异性转化多采用敏感、客观的 ³ H-TdR掺入法。T淋巴细胞转化试验检测方法可以用形态学方法也可用 ³ H-TdR掺入法。形态学方法每份标本计数200个细胞。正常值为一定数量正常人的测量值（X ± SD）。

1.形态学方法学

转化率（%）=转化的淋巴细胞数/（转化+未转化的淋巴细胞数）×100%

2. ³ H-TdR掺入法淋巴细胞转化率（%）

绝对值=（测定值cpm值−本底cpm）×10 ⁴ /淋巴细胞数×mm ³

刺激指数（SI）=实验组cpm均值/对照组cpm均值

（三）T细胞亚群测定

T淋巴细胞表面由于分化抗原的不同，可将其分为若干亚群，如CD3 ⁺ T淋巴细胞，CD4 ⁺ T淋巴细胞，CD8 ⁺ T淋巴细胞，Th1淋巴细胞及Th17淋巴细胞等。目前对于外周血中这些T细胞亚群的测定主要通过流式细胞技术，通过带有荧光标记的抗体对这些细胞亚群中的特异表面抗原进行标记。具体方法为，首先分离外周血单个核细胞，然后进行染色，通过流式细胞仪对这些细胞的比例进行测定。

CD3 ⁺ T淋巴细胞为CD3 ⁺ ，CD4 ⁺ T淋巴细胞为CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD8 ⁻ ，CD8 ⁺ T淋巴细胞为CD3 ⁺ CD4 ⁻ CD8 ⁺ ，Th1淋巴细胞为 CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD8 ⁻ CXCR3 ⁺ CCR6 ⁻ 及 Th17淋巴细胞为 CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD8 ⁻ CXCR3 ⁻ CCR6 ⁺ 。正常值为一定数量正常人的测量值（X ± SD）。

T细胞功能检测的诊断意义在不同的神经系统疾病中略有不同。研究显示85%的多发性患者的外周血淋巴细胞对于多发性患者大脑匀浆的花环试验反应显著增高，具有诊断意义。T淋巴细胞转化试验对于囊虫病（cysticercosis）以及吉兰-巴雷综合征（GBS）具有一定的诊断价值。研究显示，囊虫病患者T淋巴细胞转化试验刺激指数显著高于正常人，其对于囊虫病诊断的敏感性和特异性都在90%以上。此外，GBS患者的淋巴细胞对于空肠弯曲菌抗原的淋巴细胞转化试验刺激指数也显著高于正常人和疾病对照组。此外中枢神经系统性疾病和脊髓炎患者脑脊液中CD3 ⁺ T淋巴细胞、CD3 ⁺ CD4 ⁺ T淋巴细胞和CD3 ⁺ CD8 ⁺ T淋巴细胞最高，脱髓鞘疾病患者脑脊液T淋巴细胞亚群百分率最低，但各类神经系统疾病患者脑脊液中T淋巴细胞百分率无明显差异。各类神经系统疾病患者脑脊液中CD4/CD8比值明显高于外周血，其中细菌性脑膜炎和脊髓炎患者脑脊液中CD4/CD8比值最高，脱髓鞘疾病脑脊液中CD4/CD8比值最低。而在在多发性硬化中，一般Th1淋巴细胞（CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD8 ⁻ CXCR3 ⁺ CCR6 ⁻ ）及 Th17淋巴细胞（CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD8 ⁻ CXCR3 ⁻ CCR6 ⁺ ）较正常人显著升高。

二、单核细胞和巨噬细胞功能检测及其诊断意义

（一）单核细胞和巨噬细胞吞噬功能的检测

单核细胞和巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞（CRBC）、白念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒。首先分离外周血中单核细胞制成悬液，而后与细菌悬液混合，置于振荡器37℃，8转/min往复振荡20～30min。随后250g离心8min，弃上清。加入2倍体积冰预冷的磷酸盐缓冲液（PBS），用吸管轻轻混匀细胞。重复洗涤细胞2次，彻底除去胞外未被巨噬细胞吞噬的细菌。将0.1ml细胞悬液（约10 ⁵ 个细胞）加入甩片机中，室温，650r/min离心5min，将细胞固定至载玻片上。按照说明书进行Diff-Quik染色。油镜下检测200个以上巨噬细胞，记录每个巨噬细胞吞噬的细菌数量，然后计算吞噬指数：吞噬指数=阳性吞噬细胞百分率（> 1个细菌）阳性细胞中平均细菌数。

判断结果：一般与一定数量正常人的测量值（XSD）作为正常参考值。

（二）单核细胞和巨噬细胞杀伤功能的检测

单核细胞和巨噬细胞对病原菌具有很强的杀伤功能。其功能的检测方法如下：将过夜培养的病原菌振荡混匀，稀释为悬液。将分离外周血中的单核细胞制成悬液，而后与病原菌悬液混合。将混合悬液置于振荡器37℃，8转/min往复振荡15～20min，使巨噬细胞充分吞噬细菌。随后充分洗涤去除未被吞噬的胞外细菌，将细胞重悬于1ml含5%小牛血清的PBS中。取4只玻璃试管，每管加入0.9ml无菌水。在第一管中加入0.1ml细胞悬液（水只裂解巨噬细胞），在余下的3只试管中依次进行10倍系列稀释，并将细胞混匀。将各试管中液体充分混匀，各取0.1ml液体分别涂布在预热至37℃的TSA细菌培养板上。将剩余的未稀释胞悬液盖紧。37℃孵育90～120min，使巨噬细胞充分杀伤细菌。然后将试管置冰上，抑制细菌生长。将细胞悬液进行10倍系列稀释并涂板，方法同上。待涂布的液体被琼脂吸收后，将细菌培养板倒置于37℃孵箱，培养24～48h。计数细菌克隆数，比较样品孵育前后细菌克隆数的变化（如37℃孵育后细菌克隆数减少，说明细菌被巨噬细胞杀伤）。

判断结果：一般以一定数量正常人的测量值（X ± SD）作为正常参考值。

研究显示在未经治疗的MS患者中，其单核细胞吞噬功能与正常患者类似，然而经过醋酸格拉替雷治疗的MS患者，其单核细胞吞噬功能显著增高。此外，在阿尔茨海默病患者中，其单核细胞吞噬功能与健康人类似，但是Aβ-淀粉样沉淀高的患者其单核细胞吞噬功能显著升高。

三、NK细胞功能检测及其诊断意义

（一）乳酸脱氢酶（LDH）释放法

NK细胞功能检测常采用乳酸脱氢酶（LDH）释放法。原理为活细胞的胞质内含有LDH。正常情况下，LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK细胞的杀伤后，LDH释放到细胞外。LDH可使乳酸锂脱氢，进而使NAD还原成NADH，后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化四氮唑（INT），INT接受H ⁺ 被还原成紫红色甲臜类化合物。在酶标仪上用490nm比色测定。实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hank’s液洗3次，用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为4 ×10 ⁵ 个/ml。分离外周血中的NK细胞，制成浓度为2 ×10 ⁷ 个/ml悬液。取靶细胞和效应细胞各100μl（效靶比50∶1），加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1% NP40或2.5% Triton各100μl；上述各项均设三个复孔，于37℃、5% CO ₂ 培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl 30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值（OD）。按下式计算NK细胞活性，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项实验结果阳性。

NK细胞活性（%）=（反应孔OD −自然释放孔OD）/（最大释放孔OD −自然释放孔OD）×100%。

（二）放射性核素

NK细胞功能检测还可以通过放射性核素的方法。原理是用放射性核素标记靶细胞，当靶细胞受到破坏时，放射性核素被释放出来，通过测定释放或残留在未被破坏细胞内的放射性核素放射活性，即可计算杀伤细胞的细胞毒活性。常用的放射性核素有 ⁵¹ Cr、 ³ H-Dr、 ¹²⁵ I-UdR等。放射性核素检测方法首先需要进行靶细胞制备。具体方法为取传代培养24～48h对数生长期的K562，用RPMI-1640培养液洗涤2次，用10% FCS-RPMI-1640培养液调细胞浓度4 ×10 ⁶ /ml。0.5ml K562细胞悬液加100～200uCi的 ⁵¹ Cr，5% CO ₂ ，37℃孵育90min，每15min振摇一次。随后用RPMI-1640培养液洗涤3次，洗去未标记的游离 ⁵¹ Cr。随后将细胞浓度调至1 ×10 ⁵ /ml，同时检测细胞的 ⁵¹ Cr标记率，一般要求标记率> 0.1cpm/cell。分离外周血中的单核细胞的NK细胞（1 ×10 ⁷ /ml），取上述效应细胞和靶细胞各0.1ml（效靶比100∶1）加入96孔培养板内，上述各项均设三个复孔。同时设自然释放对照孔（0.1ml靶细胞+ 0.1ml 10% FCS-RPMI-1640培养液）和最大释放孔（0.1ml靶细胞+ 0.1ml 2% SDS）。37℃，5% CO ₂ 孵育4h。随后1000转/min离心培养板5min，用微量移液器吸出各孔上清0.1ml，加于计数管内，用γ计数仪测定放射活性cpm值。根据下式计算 ⁵¹ Cr自然释放率和NK细胞毒活性：

⁵¹ Cr自然释放率（%）=（自然释放孔cpm值）/（最大释放孔cpm值）×100%

NK细胞毒活性（%）=（试验孔cpm值−自然释放对照孔cpm值）/（最大释放对照孔cpm值−自然释放对照孔cpm值）×100%

慢性进展性MS患者的NK细胞对K562细胞的杀伤能力与健康人相比显著降低，而在接受α-干扰素治疗后，NK细胞的杀伤能力在48h到1周之内显著升高，而后又降至正常水平。类似的，在阿尔茨海默症患者中，NK活性无论是在基础条件下，还是被α-干扰素或白介素-2刺激后，也较健康人显著降低。而在帕金森病（PD）患者中，虽然NK细胞对K562细胞的杀伤能力与非PD人群没有显著差异，但是NK细胞对K562细胞的杀伤能力随着疾病的进展而显著升高。

综上所述，许多神经系统疾病伴随着细胞免疫学功能的异常表现，可以单纯出现先天性免疫系统细胞的功能异常或者获得性免疫系统细胞的功能异常，也可以同时出现两个系统细胞的功能异常，同时在疾病的不同时期，治疗的不同阶段，免疫细胞的功能也不尽相同，应结合临床具体分析。

（张蜀澜　刘　磊） lctSRyNs04RpFgYtk50OqioQ4BjyG9uvarRmBsABR2wgxXOU4hWlPvB4bI8SbeW9