下载掌阅APP，畅读海量书库
立即打开
结核病的发生和发展是结核分枝杆菌（ Mycobacterium tuberculosis ， Mtb ）与人体免疫防御之间斗争的结果，其机制十分复杂，取决于很多因素，如感染的菌量、细菌的毒力、人体的易感性、机体的反应性（免疫反应或变态反应）和免疫逃逸。阐明结核发病机制可为其诊断、治疗和预防策略的研究提供新的思路。
白细胞介素1受体拮抗剂（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Ra）介导Ⅰ型干扰素驱动的结核分枝杆菌易感性。
人类感染 Mtb 会导致无症状的肺部肉芽肿，也可以发展为致命性的播散性疾病。目前还没有可靠的疫苗可以预防肺结核。最近的研究表明，增强的Ⅰ型干扰素能在确诊前18个月就预测发展成为活动性结核病。此外，Ⅰ型干扰素受体（typeⅠIFN receptor，IFNAR1）的部分功能丧失与耐药结核病相关。
由于缺乏合适的小鼠模型，对干扰素是否或如何介导对 Mtb 的易感性的研究一直很难开展。2020年10月，加拿大麦吉尔大学的Maziar Divangahi研究团队在 Cell 杂志发表了最新的研究成果。该研究检测了携带易感等位基因sst1位点的B6.Sst1 s 同源基因小鼠，该基因对 Mtb 具有易感性。研究发现B6.Sst1 s 对 Mtb 的易感性与Ⅰ型干扰素的表达增强有关。而且，仅编码IL-1Ra的单个干扰素靶基因 il1rn 的杂合子缺失，就足以逆转B6.Sst1 s 小鼠对 Mtb 干扰素驱动的易感性。此外，抗体介导的ILl-1Ra中和作用对 Mtb 感染的B6.Sst1 s 小鼠具有治疗作用。研究结果表明B6.Sst1 s 小鼠在模拟干扰素驱动的 Mtb 易感性方面的价值，并证明IL-1Ra是体内由Ⅰ型干扰素驱动的 Mtb 易感性的重要调节因子。
本研究检测了携带易感等位基因sst1位点的B6.Sst1 s 同源基因小鼠，该基因对 Mtb 具有易感性。
1）小鼠：
B6.Sst1 s 、Sting gt/gt 等小鼠都无特定病原体。在每个实验中，所有基因型的小鼠在开始感染时都在6～10周龄。小鼠实验不采用随机化或数据盲法。
2） Mtb 感染：
所有感染均使用 Mtb Erdman菌株，在7H9液体培养基中37℃培养。小鼠用吸入暴露系统进行气溶胶感染。感染后测量菌落形成单位（colony forming unit，CFU）和/或细胞因子，同时做病理学检查和提取RNA。
3）细胞因子测量：
分离肺并取一部分匀浆液涂板用于测量CFU，除白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和IL-1Ra外，所有细胞因子均采用细胞珠法进行检测。采用小鼠IL-10 ELISA Ready-Set-Go测定IL-10水平。采用小鼠IL-1Ra/IL-1F3定量ELISA试剂盒测定IL-1Ra水平。
4）IL-1生物活性检测：
用感染低剂量 Mtb 的小鼠来制备无细胞肺匀浆。样品用HEKBlue IL-1R细胞检测。
5）流式细胞术：
分离肺组织，用BD Fortessa X-20型流式细胞仪采集数据，用FlowJo V10软件进行分析。
6）骨髓巨噬细胞（bone marrow macrophages，BMMS）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）治疗：
采集小鼠股骨和胫骨的骨髓，在非组织培养平板上进行细胞分化，培养6天后收集骨髓基质细胞。
7）定量RT-PCR：
肺组织提取RNA，制备互补DNA。使用QuantStudio 5实时PCR系统和Power SYBR Green PCR Master Mix进行定量PCR检测。
8）抗体介导的中和：
所有治疗均通过腹腔注射进行。细胞室培养基采用超低免疫球蛋白血清，以减少纯化过程中牛免疫球蛋白的污染。
9）统计分析：
所有生存资料用双侧log-rank检验进行分析。除非另有说明，所有其他数据均采用双侧Mann-Whitney U 检验进行分析。
本研究采用的小鼠品系是B6.Sstl s ，来自该小鼠的骨髓巨噬细胞表现出增强的Ⅰ型干扰素反应。与B6相比，感染B6.Sst1 s 的肺显示出更高水平的Ifnb转录本。用IFNAR1阻断抗体来抑制Ⅰ型干扰素信号后，细菌负荷显著降低。同时发现，Ifnar缺乏在很大程度上逆转了B6.Sst1 s 小鼠对 Mtb 感染的易感性。有数据表明，干扰素诱导 Mtb 感染需要宿主的STING蛋白。然而，与B6.Sst1 s 小鼠相比，将B6.Sst1 s 小鼠杂交到干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes，STING）缺陷的Sting gt/gt 小鼠，并未显著降低细菌负荷，B6.Sst1 s Sting gt/gt 小鼠的存活率也并未提升。因此，Sst1 s 位点直接或间接地作用于增强体内Ⅰ型干扰素信号，从而加重 Mtb 感染，特别是在感染的早期阶段。
B6和B6.Sst1 s 小鼠在 Mtb 感染期间肺组织中IL-10和γ干扰素水平没有显著差异。此外，B6.Sst1 s 小鼠在感染后25天的肺组织中IL-1α和IL-1β的水平高于B6小鼠。
B6.Sst1 s 小鼠用IL-1R1封闭抗体处理后，与同类型对照抗体处理的小鼠相比，细菌负荷增加，说明IL-1对B6小鼠具有保护作用。但是，B6.Sst1 s 小鼠体内高水平的IL-1蛋白不足以抵抗感染。
为了评估感染小鼠肺中功能IL-1信号的水平，该研究采用了IL-1报告生物测定法来检测游离肺的无细胞培养上清液中IL-1的活性。感染B6.Sst1 S 小鼠的肺似乎具有较低的功能IL-1信号能力，而B6.Sst1 s Ifnar -/- 小鼠的IL-1信号水平则相反。
该研究进一步从遗传学角度分析在 Mtb 感染过程中，过量的Ⅰ型干扰素信号是否中和了B6.Sst1 s 小鼠通过IL-1Ra介导的IL-1信号，结果显示杂合子和纯合子IL1rn缺乏症都能保护B6.Sst1 s 小鼠免受结核分枝杆菌感染。感染肺的组织学样本显示，与B6.Sst1 s 相比，B6.Sst1 s il1rn +/- 和B6.Sst1 s il1rn -/- 小鼠的病变面积均显著减小。
IL-1Ra部分降低对B6Sst1 s 小鼠有明显的保护作用，提示IL-1Ra可能是 Mtb 感染过程中宿主导向治疗的合适靶点。用抗IL-1Ra抗体治疗感染的B6.Sst1 s 小鼠后，接受抗体的Sst1 s 小鼠的肺部细菌负荷显著降低，肺部病变减少。为了确定IL-1Ra是否作用于Ⅰ型干扰素信号的下游，他们中和了B6.Sst1 s Ifnar -/- 小鼠的IL-1Ra。抗IL-1Ra抗体处理后B6.Sst1 s il1rn -/- 小鼠的细菌负荷与对照组相似，与B6.Sst1 s Ifnar -/- 小鼠IL-1Ra的低表达一致，而抗体处理后B6.Sst1 s 小鼠的菌落数量减少。
Sst1基因长约10Mb，编码约50个基因。该研究表明，在B6（Sst1 R ）小鼠中，Sst1基因位点直接或间接地抑制Ⅰ型干扰素信号。以前发现Sst1 s 小鼠缺乏Ipr1（也称为Sp110）的表达，B6来源的Ipr1/Sp110的重新表达部分恢复了小鼠对 Mtb 的抗性。因此，Ipr1/Sp110的缺失可能是Sst1 s 表型的原因，尽管这一点还有待于B6.Ipr1 -/- 小鼠的传代确认。人类Sp110基因多态性与某些队列中的结核病相关。Ipr1/Sp110是Sp100转录调控家族的成员，它能调节Ⅰ型IFN和/或干扰素诱导基因的染色质状态。
人们对开发针对 Mtb 的宿主导向疗法的兴趣与日俱增。如果Ⅰ型干扰素确实加剧了人类的结核病，那么以IL-1Ra为靶点的宿主导向疗法前景可期。
B6.Sst1 s 小鼠可以作为研究干扰素驱动的 Mtb 易感性的动物模型，而且IL-1Ra是体内由Ⅰ型干扰素驱动的对 Mtb 易感性的重要调节因子。
干扰素（interferon，IFN）可分为三个家族：Ⅰ型IFN包括IFN-α与IFN-β，IFN-α是由群聚在第9对染色体上的至少23个不同基因编码的多种功能蛋白，而IFN-β只由单个基因编码，主要由固有免疫细胞（如巨噬细胞、树突状细胞、白细胞）和成纤维细胞等分泌，结合相同的受体，该受体是由IFNR1和IFNR2两个亚基组成的位于细胞膜上的异源二聚体；Ⅱ型IFN即IFN-γ，主要由活化的T细胞产生，发挥主要的抗结核作用；Ⅲ型IFN为IFN-λ，目前对其了解有限。Ⅰ型干扰素是参与抗病毒免疫的重要效应分子，在2020年研究发现Ⅰ型IFN在抗细菌、病毒及抗真菌感染中既有一些正效应、也有一些负效应，如一些研究发现Ⅰ型IFN能够促进树突状细胞、CD4 + 与CD8 + T细胞及B细胞的活化；而Lee JS等的研究发现重症新型冠状病毒肺炎患者的单核细胞中，Ⅰ型IFN应答与TNF/IL-1β驱动的炎症同时存在，Ⅰ型IFN加剧了重症患者的炎症；目前的研究也发现增强型Ⅰ型IFN反应与活动性结核病进展及 Mtb 感染的易感性相关， Mtb 强毒株能够诱导更高水平的IFN-β。
为了阐明Ⅰ型IFN介导活动性结核易感性的机制，本论文Ji DX等在B6基因背景上携带一个C3HeB/FeJ小鼠1号染色体上10.7Mb的“对结核病超易感性1”区域，创新地建立了B6.Sst1 s 小鼠IFN驱动的结核易感性模型；通过一系列研究证明了体内Ⅰ型IFN信号增强，会加重 Mtb 感染，尤其是在感染的早期阶段。Ⅰ型IFN可诱导数百个靶基因的表达，IL-1α和IL-1β均是促炎性免疫反应的主要诱导因子，IL-1Ra是IL-1生物活性的竞争性抑制剂。Ⅰ型IFN可通过多种机制负性调节抗 Mtb 免疫反应，Ji DX等研究发现 Mtb 感染期间IL-1Ra的编码基因 il1rn 显著上调，诱导表达的IL-1Ra与IL-1R1和IL-1R2结合后无信号传导，却竞争性阻断IL-1α/β的结合，使体内高水平的IL-1α/β不能抵御 Mtb 感染。因此，由单核/巨噬细胞产生的IL-1Ra是体内Ⅰ型IFN驱动的 Mtb 易感性的重要介导因子。Ji DX等通过抗IL-1Ra抗体治疗 Mtb 感染的B6.Sst1 s 小鼠，以阻断IL-1Ra、恢复IL-1与IL-1R1的结合，使小鼠体重显著增加、肺病变减少及细菌负荷显著降低，证明通过阻断IL-1Ra可降低B6.Sst1 s 小鼠由Ⅰ型IFN驱动的结核易感性，也提示IL-1Ra可能成为 Mtb 感染期间宿主导向治疗的靶点。2018年美国食品与药物管理局（FDA）已授予目前唯一吸入给药的IL-1Ra研究性产品OSP-101孤儿药资格认证，用于治疗闭塞性细支气管炎，也证明IL-1Ra靶向治疗的可行性。未来在研究结核病宿主导向治疗时，尤其是对于耐多药或广泛耐药结核病的辅助治疗时，应对Ⅰ型IFN导致 Mtb 感染中的免疫抑制以及炎症反应、使结核病加重的机制进行进一步深入研究，IL-1Ra或IL-1R的宿主导向治疗可能成为调节肺结核免疫病理细胞因子网络的一种可能途径，但需在动物实验中进一步验证其对结核病的治疗效果。
点评专家：吴雪琼。
2020年1月同济大学附属上海肺科医院戈宝学团队和上海科技大学饶子和院士团队合作在 Nature 杂志发表了一项最新的研究。为了鉴定 Mtb 抑制宿主炎症反应的蛋白，他们检测了208个 Mtb 分泌蛋白和脂蛋白对转录因子NF-κB激活的影响，结果发现Rv0222可抑制NF-κB的激活。在HEK293T细胞中瞬时表达Rv0222也显著抑制NF-κB和另一个转录因子AP-1的激活。Rv0222转染还可以降低感染 Mtb 的永生化骨髓巨噬细胞（iBMDM）中NF-κB的激活。
鉴定 Mtb 抑制宿主炎症反应的蛋白。
1）菌株和细胞：
分枝杆菌基于H37Rv，细胞采用HEK293T、iBMDM、腹腔巨噬细胞、THP1细胞。
2）质粒和抗体：
质粒详见文章附表1。蛋白印迹或免疫沉淀实验使用针对血凝素、GAPDH、Flag、Myc、K11、APC2、磷酸化p65、磷酸化p38、磷酸化Jnk、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）、K11/K48泛素链、Rv0222等的抗体。
3）菌株构建：
用pYUB854构建Rv0222缺失株（H37RvΔRv0222）。用pMV261回补得到H37RvΔRv0222+Rv0222或H37RvΔRv0222+Rv0222（K76A）。通过免疫印迹分析Rv0222或其突变体在分枝杆菌中的表达。
4）小鼠与感染：
从6～8周龄雌性C57BL/6小鼠获取巨噬细胞。 Mtb 气溶胶感染雌性C57BL/6和SCID小鼠，于1天、7天、14天或30天处死，进行肺组织CFU计数及病理学观察。体外 Mtb 感染巨噬细胞MOI=5。
5）短发夹RNA（shRNA）介导的基因干扰：
用含不同shRNA的载体转染细胞，48小时后收集慢病毒，并感染iBMDM、HEK293T或THP1细胞，用嘌呤霉素筛选。
6）泛素化测定：
细胞瞬时转染HA-标签泛素质粒。通过免疫印迹检测泛素化Rv0222或TRAF6。体内实验需免疫沉淀洗涤后进行免疫印迹检测。
7）其他实验：
使用脂质体2000瞬时转染HEK293T细胞，共聚焦显微镜观察；pNF-κB-luc、p-AP-1-luc、pRL-TK瞬时转染细胞，采用双荧光素酶报告系统测定荧光；用逆转录定量PCR分析mRNA水平。
8）统计分析：
采用Student’s t 检验、方差分析和Bonferroni两两比较、或Mann-Whitney U 检验分析组间差异，双侧检验， P <0.05为差异有统计学意义。实验未进行随机化，实验和结果分析未采用盲法。
感染Rv0222缺失株的巨噬细胞和小鼠肺组织中促炎细胞因子（IL-1b，IL-6，IL-12/IL-12p40）mRNA水平比感染野生株的高得多，但细胞死亡和细菌侵入无明显差异，同时回补实验可以恢复对这些细胞因子的抑制，表明Rv0222可抑制 Mtb 触发的炎症反应。感染Rv0222缺失株的小鼠肺组织具有更少免疫细胞浸润、更少炎症损伤和更低菌负荷，提示Rv0222是 Mtb 必需毒力因子。
缺乏Rv0222时，感染H37Rv的巨噬细胞表现出更强的MAP激酶和NF-κB活性，提示Rv0222在 Mtb 感染时可能抑制p38 MAP激酶、c-Jun氨基末端激酶（JNK）或NF-κB通路的激活。抑制p38、JNK或NF-κB减弱了感染缺失株巨噬细胞IL-1b和IL-6表达水平的增强，提示Rv0222可能通过下调p38、JNK和NF-κB通路的激活来抑制 Mtb 诱导的促炎细胞因子表达。
研究发现Rv0222与Toll样受体信号通路中的TRAF6相互作用，感染 Mtb 巨噬细胞的免疫共沉淀和共聚焦显微镜分析也证实了两者的内源性相互作用。shRNA敲低TRAF6可显著减弱Rv0222对 Il1b 、 Il6 和 Il12 p40 表达的抑制作用。以上结果表明Rv0222可能通过靶向TRAF6通路抑制宿主MAP激酶和NF-κB信号的激活。
Rv0222过表达显著抑制HEK293T细胞中TRAF6的总泛素化和K63泛素化，Rv0222缺失则效果相反。Rv0222能促进HEK293T细胞中蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP1和SHP2（SHP1/2）与TRAF6结合，shRNA沉默SHP1/2可消除Rv0222对细胞因子表达的抑制作用，已报道SHP1/2与TRAF6相互作用并抑制其泛素化。这些表明Rv0222促进了SHP1/2与TRAF6的相互作用，从而抑制了TRAF6的激活。
HEK293T细胞中可检测到Rv0222多聚泛素化，共转染Rv0222和野生型泛素（包含所有7个赖氨酸残基）或突变体泛素（只保留1个赖氨酸残基，其余6个用精氨酸替代）至HEK293T细胞，显示K11泛素突变体显著增加了Rv0222的多聚泛素化作用。在感染 Mtb 的巨噬细胞中也检测到Rv0222上存在内源性K11多聚泛素物。以上实验结果提示Rv0222在宿主细胞中经历K11多聚泛素化。
此外，实验证明泛素连接酶ANAPC2与Rv0222存在相互作用，并显著增加Rv0222K11多聚泛素化，Rv0222的K11多聚泛素物仅存在于ANAPC2，提示此酶在介导Rv0222K11多聚泛素化中直接发挥重要作用。
实验证明宿主ANAPC2可增强Rv0222在K76赖氨酸残基上K11多聚泛素化。后续发现，TRAF6诱导的NF-κB和AP-1报告基因的激活受Rv0222显著抑制，但不受Rv0222（K76A）突变体抑制；与感染H37RvΔRv0222+Rv0222相比，感染H37RvΔRv0222+Rv0222（K76A）的细胞和小鼠肺中的促炎细胞因子mRNA水平均显著升高，表明K76对于Rv0222抑制宿主促炎细胞因子产生至关重要。进一步敲低ANAPC2以及下游通路分子等实验表明，宿主ANAPC2通过促进Rv0222K11多聚泛素化调控该蛋白对细胞因子表达的抑制。
H37Rv、H37RvΔRv0222+GFP、H37RvΔRv0222+Rv0222、H37RvΔRv0222+Rv0222（K76A）四种菌株小鼠感染实验结果显示，C57BL/6小鼠中，H37RvΔRv0222+Rv0222导致更严重的组织学损伤和更多免疫细胞肺部浸润；SCID小鼠中，感染8周时几乎所有感染H37Rv或H37RvΔRv0222+Rv0222的小鼠都死亡，但感染H37RvΔRv0222+GFP或H37Rv∆Rv0222+Rv0222（K76A）的小鼠存活时间较长；野生型Rv0222而非K76A突变体Rv0222的回补，可挽回H37RvΔRv0222+GFP感染小鼠肺组织中的CFU减少。
该研究发现Rv0222是以往未被认识的 Mtb 免疫信号元件。以往曾报道，含 Mtb 的宿主细胞膜结构上存在泛素积聚；细菌的一个泛素结合蛋白与宿主的一个信号分子相互作用；分枝杆菌仅具有蛋白质翻译后修饰的类泛素化（pupylation）系统，不具有内源性泛素化系统。该研究揭示了一种利用宿主E3连接酶（ANAPC2）进行 Mtb Rv0222泛素化而破坏宿主免疫的机制，突显了宿主与 Mtb 相互作用的多样性。未来研究将扩展至其他宿主E3连接酶介导泛素化的功能。值得注意的是，ANAPC2介导的Rv0222K11泛素化引发的细胞效应似乎与APC/C触发的降解许多细胞周期调节子不同，其泛素化促进磷酸酶与免疫信号分子结合，而非蛋白酶体的底物识别。该发现可为开发针对Rv0222-ANAPC2的有效抗结核治疗方法奠定基础。
Rv0222是以往未被认识的 Mtb 免疫信号元件。利用宿主E3连接酶（ANAPC2）进行 Mtb Rv0222泛素化而破坏宿主免疫的机制，突显了宿主与 Mtb 相互作用的多样性。
机体中的蛋白质主要通过溶酶体途径和泛素-蛋白酶体途径降解，后者是维持体内蛋白动态平衡的主要途径。泛素是真核生物中广泛存在的一类高度保守的由76个氨基酸组成的小蛋白。泛素蛋白在一系列特殊酶的作用下，可对翻译后的靶蛋白进行特异性的修饰，这个过程被称为泛素化。泛素化是重要的蛋白质翻译后修饰方式。泛素化过程是一个由下列三类酶催化完成的级联反应：首先，泛素激活酶（E1）的半胱氨酸残基与位于泛素C末端的甘氨酸残基在ATP供能下形成硫酯键；而后，E1激活的泛素转移到泛素结合酶（E2）；最后，泛素连接酶（E3）催化泛素从E2转移到靶蛋白上进行修饰。人体中有1 000多个泛素连接酶，它能够将泛素共价结合到靶蛋白的特定赖氨酸残基上。泛素含有7种赖氨酸（即K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63），如果多个泛素形成多泛素链后再连接在靶蛋白的赖氨酸上，被称为多聚泛素化（polyubiquitination），将被26S蛋白酶体降解；如果一个泛素连接在靶蛋白的赖氨酸上，被称为单泛素化（monoubiquitination），单泛素化的靶蛋白一般不会被导入蛋白酶体降解，可能会发生功能或细胞定位的改变。
目前研究发现泛素化修饰有多种形式，参与免疫功能、细胞周期、DNA修复、细胞生长等的调控，与许多疾病的发生密切相关，尤其是一些病原菌能利用宿主的泛素化系统致病。该论文作者Wang L等首次发现宿主E3泛素连接酶ANAPC2可将K11连接的泛素链附着在 Mtb Rv0222的第76位赖氨酸上，导致Rv0222多聚泛素化，揭示 Mtb 通过其效应蛋白Rv0222调节宿主泛素化途径、干扰宿主细胞信号通路，从而有效地抑制宿主的免疫防御，诱导免疫逃逸，促进 Mtb 的感染、生存和致病。该研究发现的 Mtb 免疫逃逸机制为结核发病机制提供了新的见解，也将为研发抗结核新药的设计提供新思路和新策略，Rv0222第76位赖氨酸也可能成为抗结核治疗的新靶点。未来尚需更深入地研究ANAPC2-Rv0222及其他泛素化修饰的调控网络和调控效应，为结核病致病机制的阐明和靶向药物的研制提供更有力的科学依据。
点评专家：吴雪琼。
结核初始感染阶段血小板可以改变对 Mtb 的免疫力，更多严重的肺部病理伴随着血小板增多和血小板功能状态和形态改变，表明血小板参与结核病的发生。血小板迅速迁移到炎症部位并积聚，引发多种免疫功能，如杀微生物蛋白、细胞因子和趋化因子的释放，提示血小板可能参与免疫细胞的直接相互作用并改变其反应性。2020年9月，德国马克斯·普朗克感染生物学研究所的Anca Dorhoi团队在 American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 杂志发表了最新的研究。
应用肺结核小鼠感染模型分析组织中血小板功能，以期了解血小板对结核病发生的影响。
1）细菌：
生长至对数中期的 Mtb H37Rv和H37Rv-GFP菌株、铜绿假单胞菌（PAO-1）和嗜肺军团菌（JR32）。
2）动物和感染：
10～12周龄和性别匹配的129S2、C57BL/6和C3HeB/FeJ小鼠。使用glass-Col吸入暴露系统用低剂量（100CFU）或高剂量（1 000CFU） Mtb 感染小鼠。轻度麻醉下，在浓度为4×10 6 CFU和1×10 6 CFU的气管内和鼻内感染小鼠嗜肺乳杆菌。
3）血小板消耗和重建：
小鼠接受每3.5天4μg/g身体重量的消耗抗体（R300）或同种型对照（C301）。光麻醉下经眶静脉注射5×10 8 洗净血小板，进行血小板重组。
4）队列研究和流式细胞术分析：
获得书面知情同意书，经上海市肺科医院伦理审查委员会批准，纳入经临床和放射学诊断为肺结核和痰涂片、培养确诊的结核病患者。血细胞经CD14、CD15、CD41a染色并Accuri C6流式细胞仪分析。
5）小鼠细胞分离和流式细胞术：
从器官和支气管肺泡灌洗制备单细胞悬液。经荧光素标记抗体染色，应用CellROX观察总活性氧（ROS），上机前经4% PFA固定细胞，用FlowJo软件分析。
6）组织学和免疫荧光：
肺部切片用苏木精和伊红Y（H&E）染色，并进行细胞类型、自噬和氧化应激标记。通过金胺-罗丹明染色观察 Mtb 。使用ProgRes CT5软件获取载玻片并用Cell Profiler软件量化免疫荧光。
7）微阵列和基因富集分析：
在TRIzol中裂解BAL细胞，提取总RNA，进行微阵列并用R version 3.5.1软件进行数据分析。
8）统计学分析：
应用GraphPad Prism 7软件，原始或对数转换数据正态性检验采用 t 检验/方差分析。多组间比较采用单向或双向方差分析（ANOVA），两组 t 检验和生存曲线分析。 P <0.05有统计学意义。
Mtb 感染的TB C57BL/6小鼠中，血小板与各种髓细胞形成聚集体，PMNs和AMs百分比增加。血小板在结核病患者感染肺中的增量积累、血小板发生加速和先天免疫细胞-血小板聚集体的形成表明血小板可能影响结核病的预后。
不同品系小鼠血小板消耗试验显示血小板减少并没有改变 Mtb 的传播。易感的C3HeB/FeJ小鼠在 Mtb 感染前不久出现血小板衰竭，并持续到感染后的第一周，肺细菌载量保持不变。炎症影响结核的进展，且血小板抑制药物对结核进展无影响。血小板可改变肺结核患者免疫细胞的肺动态。血小板减少时常驻骨髓种群和各种淋巴细胞的数量保持不变；衰竭时大多数细胞亚群的频率显著降低，同时肺细菌负荷降低。结核病进展中，血小板不改变免疫细胞在肺部的募集。
血小板不能通过调节适应性免疫的动力学和模式来促进结核病的进展。在有血小板存在的 Mtb 单核细胞分化过程中，血小板减少了髓系细胞中脂滴的积累。血小板耗尽启动后不久对BAL细胞进行了全基因转录组学分析，显示ROS途径富集程度最高。血小板减少小鼠的总ROS水平显著升高，活性氧水平的差异与吞噬细胞内 Mtb 区室化无关；肺切片原位氧化模式增强，巨噬细胞几乎无变化。因此，在肺结核期间，血小板通过限制NADPH依赖的ROS的产生，调节髓系细胞抗分枝杆菌活性，这在结核病中是有害的，它阻碍了肺常驻髓细胞的细胞（主要是AMs和pmn）固有防御机制。
血小板作为结核病进展的新调节因子与导致急性肺损伤的情况不同，它选择性地限制ROS的产生和髓细胞中的抗菌免疫，对肺结核是有害的。肺结核存在区域免疫专门化，包括巨噬细胞亚群、独特的定位和选择。129S2小鼠是结核进展的可靠模型，在血小板动力学方面与活动性结核病患者相似，提示肺结核患者血小板增多、活化及其外渗与炎症高峰相关，可改变肺结核的免疫事件，调节病理生理学反应。在原发性进行性结核期间，血小板的有害作用独立于典型的激活途径。体外实验表明 Mtb 并不直接激活血小板，而是由持续的免疫应答诱导，无组织特异性，但对肺结核的进展至关重要。
该研究揭示了早期感染小鼠的血小板-骨髓细胞在血液和BAL中聚集，与疾病易感性相关。在结核病中，AMs和pmn对细菌复制的控制受血小板影响。髓系细胞内 Mtb 复制的增强可能是由于血小板存在时聚集杆菌的吸收，感染细胞内的 Mtb 区室化在细胞消耗时未改变，细胞毒性无变化，提示血小板调节髓细胞的内在防御武器库。 Mtb 利用活性氧并清除活性氧，未感染的细胞中也观察到了活性氧的变化，提示血小板可能会在渗出时促进活性氧的减少，有助于杀死细菌。
人pmn中大量的ROS诱导巨噬细胞坏死和随后的 Mtb 复制，血小板通过改变疾病的耐受性限制ROS，ROS再通过影响信号或代谢改变 Mtb 复制。血小板调节ROS的具体机制和后续事件，仍需进一步研究。此外，一旦组织病变建立或重新激活，早期结核感染和晚期感染期间髓细胞功能的调节可能不同。
早期感染小鼠的血小板-骨髓细胞在血液和BAL中聚集，与疾病易感性相关。 Mtb 利用活性氧并清除活性氧，有助于杀死细菌。人pmn中大量的ROS诱导巨噬细胞坏死和随后的 Mtb 复制，血小板通过改变疾病的耐受性限制ROS，ROS再通过影响信号或代谢改变 Mtb 复制。
血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆解脱落下来的小块胞质，在生理止血过程中发挥着重要的功能。早在1955年，意大利学者Avogaro P和Caturelli G就发现血小板水平和功能与慢性肺结核存在着联系。到了1974年，Shanker A等也发现了血小板与肺结核之间类似的关联。后来随着科学技术的不断发展，人们发现在结核病患者中，初始感染阶段血小板可以改变对 Mtb 的免疫力，更多严重的肺部病理伴随着血小板增多和血小板功能状态和形态改变，表明血小板参与结核病的发生。但是这些研究大多是观察性研究，缺乏对两者联系的深入分析，特别是从机制上来证明或阐明这些现象。
该研究中，Scheuermann L等应用原发性进行性肺结核小鼠模型分析了组织中的血小板功能，发现血小板存在于感染部位，并在实验性结核病期间与不同的髓系亚群形成聚集体。在结核病患者中也检测到这种聚集物。研究者进一步发现血小板不改变左肺细胞动力学和抗分枝杆菌T细胞反应模式，但通过限制肺驻留骨髓细胞中活性氧的产生阻碍了抗菌防御。该研究首次证明了血小板在原发性进展性肺结核中发挥的有害的作用，提示通过调节先天性免疫反应协调肺免疫，可能适合对这种致命疾病进行新的干预。
无独有偶，早在2004年，Khechinashvili GN和Khvitiya NG发现在结核病不同的病程阶段，血小板的结构是动态变化的，特别是α颗粒、致密颗粒之间的比例变化，线粒体和溶酶体的不同紊乱等。两项研究先后从不同的角度对血小板与结核病之间的关系进行了探讨，Khechinashvili GN等从血小板结构变化入手，而Scheuermann L等则从动物模型、细胞和分子层面对两者之间的关系进行了验证。这两项研究殊途同归，为以后的研究奠定了基础。
点评专家：龚文平。
2020年1月来自美国的Adrie J.C.Steyn团队在 Nature Communication 杂志上发表了一篇关于H 2 S参与 Mtb 持留作用的最新研究报道。 Mtb 是一种古老的胞内致病菌，可以在人体内长期潜伏存在，阐明影响 Mtb 存活的宿主因素对揭示其持留机制至关重要。近来，H 2 S作为一种新型信号分子参与了多种病理生理学过程，并且它与一氧化碳和一氧化氮具有功能交叉性。哺乳动物中H 2 S主要通过胱硫醚β-合成酶（cystathionine β-synthase，CBS）、胱硫醚γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase，CSE）和3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfur transferase，3-MST）酶促反应产生。研究报道发现H 2 S通过调控线粒体呼吸使小鼠进入一种休眠状态；在哺乳动物中，H 2 S以浓度依赖的方式对线粒体呼吸进行双向调控，高浓度H 2 S抑制线粒体上细胞色素氧化酶的活性，而低浓度H 2 S可以促进线粒体呼吸作用。
在缺失CBS（CBS+/-）的小鼠模型中开展 Mtb 感染实验，检测CBS在炎症反应中的作用，鉴定感染小鼠模型中H 2 S的水平，研究H 2 S如何调控 Mtb 生长、基因表达、代谢及呼吸作用。
H37Rv标准株， Mtb cydC：aph， Mtb ΔdosS，ΔdosT和ΔdosS/dosT突变株。构建 Mtb 感染小鼠模型；AOAA/GYY4137处理小鼠；小鼠肺部病变的组织学分析；细胞因子分析；小鼠巨噬细胞分离；RT-PCR；免疫印迹；流式细胞技术；生物能分析（Seahorse XF96分析仪或Oroboros Oxygraph-2k）；菌体总ATP定量分析：活性氧产物水平检测；液质联用LC-MS/MS靶向代谢物分析；不同组分营养成分贡献度分析（fractional nutrient contribution，FNC）；硝酸盐/亚硝酸盐估算；亚甲蓝法测定硫化物；WSP-1荧光探针法测定H 2 S；氧化压力试验；阿拉玛蓝分析；RNA提取及测序等。RNA测序数据上传至EMBL-EBI ArrayExpress数据库（E-MTAB-7421）。
用 Mtb H37Rv感染小鼠RAW 264.7巨噬细胞系引起CBS蛋白质表达水平上升34倍。在缺陷型小鼠（Cbs+/-）中，CBS蛋白质水平下降约50%，而 Mtb 感染野生型小鼠（WT）导致外周血巨噬细胞CBS表达水平增加25倍，但CSE和3-MST水平不受影响。与 Mtb 感染的WT小鼠相比，Cbs+/-小鼠的外周血巨噬细胞中 Mtb 存活率下降，同时伴随着H 2 S水平的降低，用H 2 S供体化合物GYY4137处理后， Mtb 菌株存活率明显升高。这表明， Mtb 的存活率主要与H 2 S水平相关。
与 Mtb 感染的WT小鼠相比，Cbs+/-小鼠存生存时间更长（Cbs+/-：286天；WT：211天），并且 Mtb 感染Cbs+/-小鼠8周和14周后，肺和脾的荷菌量都有所降低，同时伴随着肺部损伤程度的减轻。结果表明，CBS的存在可以上调H 2 S水平，并从宿主生存率和携菌量两个方面促进结核病病情恶化。
检测 Mtb 感染WT小鼠和Cbs+/-小鼠后免疫细胞组成及比例、炎性细胞因子水平及Th1/Th2应答反应，结果显示受感染的Cbs+/-小鼠生存率增加及荷菌量的降低不单单是由于宿主免疫应答反应的显著差别，而更可能与H 2 S对 Mtb 的直接作用有关。
通过体外实验检测 Mtb 感染巨噬细胞系的 Mtb 存活率发现，低水平的硫化产物（5、10和25µM GYY4137处理）以剂量依赖的方式促进 Mtb 生长。体内实验检测ATP的合成及氧气消耗比例（oxygen consumption rate，OCR）发现，低剂量的H 2 S可以通过作用于 Mtb 的电子传递链（electron transport chain，ETC）提高呼吸作用及ATP水平促进 Mtb 生长。
采用液相色谱质谱法（LC-MS/MS）对GYY4137处理后 Mtb 菌体内代谢物进行分析发现，糖酵解中间产物6-磷酸葡萄糖、1，6-二磷酸果糖和丙酮酸的水平升高。碳示踪数据表明H 2 S暴露后， Mtb 通过糖酵解、戊糖磷酸途径和三羧酸循环中能量流的增强来提高 Mtb 能量代谢和合成代谢底物中间体，最终促进菌体生长。
采用缺失细胞色素bd型甲萘酚氧化酶（cytochrome bd-type menaquinol oxidase，CytBD）突变株 Mtb cydC：aph以及回补株 Mtb cydC：aph-Comp暴露在GYY4137中，采用Oroboros O2k呼吸计进行检测，发现当呼吸作用仅由aa3型细胞色素c氧化酶维持时， Mtb cydC：aph中OCR和生长显著下降，这表明H 2 S在 Mtb 中主要通过CytBD发挥呼吸和生长促进作用。
在暴露于亚硫酸铜后， Mtb 重组代谢和转录机制，包括铜调节子，以减轻亚硫酸铜产物的形成。这表明除了一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化碳（carbon monoxide，CO）和低浓度O 2 之外，该研究发现了第四种气体H 2 S可以诱导Dos休眠调节子。
GYY4137处理的 Mtb 与未处理相比，更快地被抗结核药甲硝唑杀灭（甲硝唑选择性杀灭缺氧环境中的 Mtb ）。同时，H 2 S暴露后呼吸增加导致 Mtb 细胞中ROS生成增加。以上数据表明，H 2 S在 Mtb 进入低氧环境时起到了有益的作用，并保护其免受氧化损伤。
研究观察到与WT相比， Mtb 感染8周后的Cbs+/-小鼠肺部iNOS水平升高，体外 Mtb 暴露于NO后基础OCR及ATP水平都降低，但继续加入GYY4137后可重新提高其OCR及ATP水平。而GYY4137处理的 Mtb 生存率升高，在加入NO后生存率下降。以上数据表明H 2 S逆转了NO对 Mtb 呼吸和生长的抑菌作用。
采用CBS抑制剂氨基氧乙酸（aminooxyacetic acid，AOAA）处理WT小鼠或Cbs+/-小鼠外周血巨噬细胞、加入GYY4137处理上述细胞，检测 Mtb 存活率、肺部荷菌量以及血清中硫化物的水平，结果发现AOAA通过减少宿主H 2 S的产生来调节 Mtb 的感染。
该研究发现利用宿主H 2 S促进自身生存是 Mtb 致病的重要策略，同时揭示了宿主气体递质和 Mtb 之间复杂相互作用，并提示可将宿主H 2 S作为结核病治疗的潜在药理学靶点。
挥发性物质H 2 S与NO和CO均是气体递质，是哺乳动物体内一种生物相关的信号分子。内源性H 2 S具有广泛的病理、生理作用，局部H 2 S浓度较低时，可能发挥多种细胞保护、抗氧化和抗炎功能；而局部浓度较高时，可能成为细胞毒性、细胞抑制和促氧化剂，对人类和动物大多数器官系统都有深远的影响。在哺乳动物中CBS、CSE和3-MST三种酶催化大部分H 2 S的生成，近年来的研究发现H 2 S生成的变化与多种肺部疾病的发病机制有关，H 2 S参与呼吸道调节气道张力、肺循环、细胞增殖、凋亡、信号传导、纤维化、氧化应激和炎症等过程，但宿主产生的H 2 S在结核发病机制中的作用尚不清楚。本论文Saini V等通过CBS杂合基因敲除小鼠以及随后Rahman等通过CSE基因敲除小鼠的结核感染模型的研究，首次发现宿主产生的H 2 S可调控 Mtb 生长、基因表达、能量代谢及呼吸作用，CBS+/-和CSE-/-小鼠与野生型小鼠相比存活时间延长，结核病变减轻，器官菌落数减少，对 Mtb 感染抵抗力增强，提示CBS和CSE均可引起有害的宿主反应，从而有助于 Mtb 的生长和疾病的进展。这些发现证明宿主来源的H 2 S参与了 Mtb 的致病作用，不仅丰富了我们对 Mtb 致病机制的认识，也可能产生新的干预模式，如提示CBS或CSE可能成为结核病宿主靶向治疗的合适靶点，针对H 2 S产生路径设计抗结核新药可能成为研发新策略。Brancaleone V等和Xu S等的研究均证明以H 2 S为靶点的治疗策略是可行的。用于治疗类风湿性关节炎的D-青霉胺是二甲基半胱氨酸的异构体，Brancaleone V等研究发现D-青霉胺以吡哆醛-5′-磷酸依赖的方式选择性地抑制CSE，从而抑制H 2 S的生物合成。因此，未来还需深入研究H 2 S的基本生物学，阐明宿主来源的H 2 S是如何在结核病病理、免疫和代谢方面发挥作用、促进 Mtb 毒力和生长、调节 Mtb 休眠的，CBS或CSE阻断/抑制后会出现哪些与H 2 S无关的多效性效应，为未来H 2 S生成抑制剂（如CSE抑制剂——抗关节炎药物D-青霉胺）在结核病治疗中的应用奠定坚实的实验基础。
点评专家：吴雪琼。