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尽管胆囊癌的相关分子生物学研究已经取得了突破性进展，但临床确诊胆囊癌仍采用组织活检的方法。虽然这是诊断肿瘤的金标准，但这种方式存在一定的弊端，如对患者造成的创伤较大、易导致肿瘤的转移等。近年来，肿瘤液体活检技术正在兴起，有望迅速进入临床并指导肿瘤的诊断与治疗。它的优势在于能够通过非侵入性取样降低活检危害，从而对肿瘤进行早期诊断、评估转移风险、判断疗效、指导预后，具有高性价比。在肿瘤领域，液体活检技术主要包括对循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环非编码RNA（circulating non-coding RNA）及肿瘤外泌体（exosome）检测，这些检测技术在临床上可抽检患者血、尿、脑脊液、胸腔积液及腹水等体液，通过定量测定与肿瘤相关的蛋白质、DNA、RNA等物质的表达变化，从而帮助或辅助诊断疾病，以及评价临床疗效。
1869年，澳大利亚籍医师Ashworth首次提出CTC的概念。由于条件的限制，此后的100余年里，这项研究并没有引起研究者足够的重视。直到2004年，Cristofanilli等提出外周血循环肿瘤细胞可能是提示恶性肿瘤转移早期事件的重要生物学标志物，CTC才再次引起广大学者的关注。
CTC指来自原发病灶或转移病灶的肿瘤细胞，自发地或在手术、肿瘤穿刺活检等操作过程中，离开原生存环境，进入血液循环。目前，众多研究表明，在疾病早期，CTC对于鉴别良恶性肿瘤具有一定的提示价值，也有助于预测和判断转移风险，在疾病进展及治疗过程中，CTC还能为动态监测病情、疾病耐药性等临床诊疗关键因素提供重要信息。同时，CTC也可以作为靶向治疗的靶标。
近年来，人们逐渐认识到恶性肿瘤的播散和转移不仅仅发生在疾病的中晚期，也可能发生在疾病的较早阶段。在某些病理生理因素作用下，一部分位于肿瘤原发灶的肿瘤细胞在肿瘤微环境作用下，通过上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等一系列复杂的生物学过程使肿瘤获得高度的侵袭能力，侵袭周围组织，最终使肿瘤细胞进入外周血，形成循环肿瘤细胞。在循环过程中，极少数CTC细胞存活下来，相互聚集成团，形成肿瘤微栓，通过循环定植于某一组织或器官中，从而形成了肿瘤的转移。
印度学者定量检测了25名胆囊癌患者及12例对照组人群（包括6例健康人群和6例胆囊炎患者）血液中CTC数量，通过统计学比较发现CTC的定量检测对于区别胆囊癌组及对照组具有较高的敏感性、特异性及诊断准确率。通过胆囊癌组组间比较发现，设定不同的比较阈值对于区分肿瘤分期、评估转移风险具有重要意义。尽管这项技术尚不成熟，很多有争议的地方尚需解决，但不可否认这项技术将在胆囊癌早期诊断、动态检测、临床决策、提示预后、鉴别良恶性等方面发挥巨大作用。
循环肿瘤DNA（ctDNA）是人体血液循环系统中携带的具有一定特征（包括基因突变、缺少、插入、重排、拷贝数异常等）、来自肿瘤基因的DNA片段，它可以存在于肿瘤细胞或者由外显子携带，也可以以无细胞状态游离于外周血中，也称为循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）（尽管cfDNA可以包括非肿瘤相关的DNA）。早在1974年，Mandel和Metais就发现血浆游离核酸分子的存在。1977年，Leon等发现肿瘤患者的血浆游离DNA水平明显高于健康人群。之后的研究者在血浆和血清中发现了肿瘤原癌基因突变，并且证实与原发肿瘤一致。后来研究证实，cfDNA携带的那一小部分DNA，就是由肿瘤细胞释放出来的。近年来国内外许多研究表明ctDNA在多种肿瘤，如肺癌、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤中存在高表达，且在早期诊断、侵袭转移、预后复发等方面具有重要研究意义。
2016年，印度学者定量测定胆囊癌患者循环中cfDNA，表明cfDNA是诊断胆囊癌患者的一种高敏感性和高特异性的标志物。该项研究定量测定了34例胆囊癌患者与39名年龄和性别相匹配的对照组人群的血清（包括22例胆囊炎患者和17例健康人）cfDNA，通过统计学比较发现鉴别胆囊癌组和对照组，cfDNA的灵敏度和特异度均达到100%，鉴别胆囊癌组与胆囊炎对照组，敏感性和特异性分别为88.24%、100%。同时，该研究表明胆囊炎患者的cfDNA水平较健康人群明显升高，但明显低于胆囊癌患者cfDNA水平，这对于早期诊断胆囊癌具有重要意义。
近年来，众多研究者发现胆汁中也存在ctDNA。Kinugasa等分析30例胆囊癌患者胆汁和肿瘤组织的49个原癌基因的突变情况，发现肿瘤组织突变阳性率为57.1%，在这些患者中又有87.5%的患者的胆汁样本具有相同的突变。胆汁ctDNA与肿瘤组织样本一致率为85.7%。该研究最终结果表明胆汁中检测ctDNA可能有助于胆囊癌早期诊断，其与内镜逆行胰胆管造影（endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP）细胞学检查相比，敏感性和阳性预测值更高。
循环血液中ctDNA在胆囊癌中的精确定量并无相关报道，但是对于胆囊癌早期诊断、侵袭转移、评价疾病预后方面ctDNA定量测定具有重大意义。因此，ctDNA的出现将会为胆道外科医师提供一个新的思路。
非编码RNA是一类不编码蛋白质的无功能RNA。近几年发现，一部分非编码RNA可以在循环血液中被检测到，它既可以存在于有核细胞内，也可以存在于无核细胞内即非细胞RNA，这些非细胞RNA通过膜泡结构（凋亡小体、微泡、外体），以及非细胞核糖核蛋白在血液中循环。非编码RNA主要分为两大类：短链非编码RNA（small noncoding RNA，sncRNA，＜200bp，包括miRNA）和长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA，＞200bp）。组织及循环体液（如血、尿、母乳等）中检测miRNA的研究报道相对较多，且多项研究表明其可反映对肿瘤生物学及治疗干预的影响，有助于诊断及治疗。而循环中lncRNA的研究相对有限。近几年越来越多的研究证实，lncRNA在肿瘤的发生发展及抑制中发挥了巨大作用。由于lncRNA更容易获取，且Arita、Tong和Ren等研究证实血浆中的lncRNA无论在反复冻融还是核糖核酸酶存在情况下，均可以稳定存在，因此，循环中lncRNA与肿瘤发生发展关系的研究越来越受到关注。
目前为止，在众多肿瘤（如肝癌、胰腺癌等）中已经发现相关的循环lncRNA，且与肿瘤发生发展、预后关系密切。由于预分析及分析因素、供体因素原因，循环lncRNA的精确定量仍受到质疑。尽管如此，循环lncRNA的发现使人们对肿瘤发生的基本机制有了新的认识，并为诊断和预后开辟了令人兴奋的前景。
虽然目前尚未有关于循环非编码RNA与胆囊癌关系的报道，但这无疑给众多的胆道外科医师提供了新的思路，随着对循环非编码RNA分子机制的不断研究，相信在不久的将来，其可以作为一种高度特异、高度敏感的用于早期诊断、评价预后的胆囊癌新生标志物。
外体是一类细胞释放的直径为30～150nm的天然微囊泡，它与来源细胞具有功能相关的生物活性分子，可以在细胞及组织间相互传递，是相互间通信的重要介质。由于具有这一特性，人们相信由肿瘤细胞释放的外体必然携带肿瘤发生转移的相关分子，作用于受体细胞从而改变周围及组织细胞的正常生理状态。因此，外体与肿瘤的相关研究成为目前研究热点。
外体包括核酸分子，如微RNA、mRNA、lncRNA及DNA等。目前研究证实，因外体脂质膜结构可以防止内部miRNA降解因素，其在肿瘤诊断中更具有优势。瑞士日内瓦大学的一项关于良恶性胆道狭窄外体浓度测定的研究发现，恶性胆道狭窄患者的胆汁中外体浓度明显高于良性，其建立的检测阈值对区分良恶性胆道狭窄准确度达到了100%，血清中外体浓度区分恶性与非恶性胆道狭窄准确度达到了63.3%。同时外体还包括外体蛋白、脂质及一些小分子代谢物。
液体活检技术近几年无疑成为当前无创性临床诊断的研究热点，而外体检测作为其中一项重要技术，在胆囊癌诊断与治疗方面无疑具有巨大的开发价值。
目前，液体活检技术在肿瘤领域快速发展，有望进入并指导临床（图5-5）。但是液体活检技术仍面临着众多的挑战，如肿瘤异质性、肿瘤的CTC和ctDNA的数量不足、检测设备的不完善等。随着分子生物学研究的不断进步，相信这项技术将会成为胆囊癌及其他肿瘤诊断和治疗干预的重要技术手段。
图5-5 液体活检技术流程图
（程石 郭伟）
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