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胆囊癌是指发生于胆囊（包括胆囊底部、体部、颈部及胆囊管）的恶性肿瘤，是胆管系统最常见的恶性肿瘤。胆囊癌具有隐匿性、发展速度快、预后差等特点。美国癌症数据库10 705例胆囊癌患者的随访数据提示，Ⅱ a 、Ⅱ b 、Ⅲ、Ⅳ期的5年生存率分别为7%、9%、3%、2%。世界范围内，胆囊癌发病的地理、种族、民族分布存在显著差异，提示遗传、环境因素在疾病发生发展中发挥重要作用。目前，临床上胆囊癌的确诊仍然依赖于病理诊断，如何能够早期发现和诊断胆囊癌成为亟待研究的课题。各种血清肿瘤标志物的临床检测能够部分反映和评价肿瘤的病理生理过程及对治疗的反应，也被尝试用于肿瘤的早期诊断和复发的早期评估。随着近年高通量技术的快速发展，肿瘤的分子生物学研究日趋精进，有关胆囊癌的研究亦进展迅速。本节就胆囊癌的分子生物学研究进展概述如下。
CA19-9是一种单唾液酸Lewis-a血型抗原，相对分子量约为210kD，主要分布在正常胎儿肝、肠、胆囊、胰腺等消化道组织中，在成人体内主要分布在胆管上皮、胰腺等组织。血清中含量低，以糖蛋白形式存在，正常范围为（0～40）×10 3 U/L，主要为胰腺癌、结直肠癌、胆管癌、胆囊癌等消化系统恶性肿瘤的血清学标志物。Sasaki R对35例胆囊癌及21例胆管癌行CA19-9免疫组织化学检测，发现70%～90%的胆囊癌及胆管癌组织中均有CA19-9和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）。Shukla VK等发现在胆囊癌患者、胆石症患者、健康患者的CA19-9水平间有显著差异，胆囊癌患者平均为211.27U/ml，胆石症患者平均为86.06U/ml。刘飞等回顾性分析了90名接受了手术治疗的胆囊癌患者的资料，结果显示高CA19-9组（CA19-9＞250.9U/ml）与低CA19-9组（CA19-9＜250.9U/ml）在肿瘤分化程度及切缘状态方面，有显著差异（ P ＜0.05），且低CA19-9的中位生存期（25个月）优于高CA19-9组（10个月）。Wang YF等对照分析了78例胆囊癌患者、78例良性胆囊疾病患者和78例健康对照者血清CA19-9、糖类抗原242（carbohydrate antigen 242，CA242）、CEA水平，发现CA19-9对胆囊癌的诊断敏感性可达71.7%，在完成随访的30例患者中，多因素生存分析表明CA19-9表达水平是影响预后的独立因素。虽然CA19-9敏感性较高，但其在一些良性疾病所致黄疸、其他消化道恶性肿瘤中亦可出现阳性，单独用于检测特异性较低。且据Takasaki报道，CA19-9在Lewis a - b - （即Lewis血型ab均为阴性）血型中无法表达，因此肿瘤患者可出现血清CA19-9的假阴性。
CA125来源于胚胎发育初期，最初于1981年从卵巢癌细胞检出，其相对分子质量为200k～1 000kD。血清CA125的正常范围为（0～35）×10 3 U/L，血清含量升高最常见于卵巢癌患者。Chaube A等对比了64例胆囊癌患者、47例胆石症患者和23例健康受试者的血清CA125水平，结果提示将阳性上限设为11U/ml时，CA125的诊断敏感性和特异性分别为64%和90%，但在不同分级与分期的胆囊癌患者中CA125水平无明显统计学差异。Shukla VK等的研究表明，胆囊癌患者CA125平均浓度与胆石症患者相比显著增高，其CA125和CA242两种肿瘤标志物联合检测可将诊断的敏感性和特异性分别提高至87.5%及85.7%。亦有研究显示，CA125可在多种恶性肿瘤组织中表达，如乳腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、结直肠癌等，因此其特异性较差，在对胆囊癌的诊断中常需与其他肿瘤标志物联合检测。
CEA是一种相对分子质量小的糖蛋白，来源于内胚层。内胚层来源的肿瘤及内胚层来源以外的肿瘤也普遍存在CEA的表达。CEA在正常人血液中很难检出，在胃肠道恶性肿瘤患者里一般阳性率较高，肝胆系统恶性肿瘤患者阳性率次之。Stefanovic D等检测了124例胆囊良恶性病变患者术前及术后CEA水平，发现其随着肿瘤的浸润及转移表达升高。国内学者研究也表明了CEA在胆囊癌患者中的高阳性率。但也有许多研究认为其在良性病变或部分健康人中也可呈一过性较低水平表达升高，在梗阻性黄疸中胆汁的CEA水平亦可升高，因此仅靠CEA水平无法鉴别疾病性质。美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology，ASCO）及欧洲肿瘤标志物小组（European Group on Tumor Markers，EGTM）认为血清CEA在诊断胆囊癌方面灵敏度及特异度均较低，不适合单独用于胆囊癌筛查。
CA242是一种唾液酸化的糖脂抗原，是从人结直肠癌细胞的单克隆抗体发现的，在健康人群及良性胆道疾病患者血清中含量很低，在消化系统肿瘤中其表达升高，如胰腺癌及结直肠癌。Shukla VK等的研究提示胆囊癌患者CA242水平显著高于胆石症患者。Haglund C等的研究认为CA242是一种潜在肿瘤标志物。何丽琳等同期对比胆囊癌患者、胆囊良性疾病患者及健康受试者各78例血清样本，发现CA242诊断的灵敏度及特异度可达64.14%及98.73%。一些国内学者研究发现胆汁中CA242的表达较CA19-9特异性强，较少受到其他非肿瘤肝胆系统疾病的影响，提示其诊断价值优于CA19-9。
由于CA19-9、CEA、CA125、CA242在不同疾病中的阳性率存在差异，且均属于肿瘤患者的常见抗原，表现出非特异性特点，在胆囊癌患者中，常出现几种标志物均异常升高，因此临床诊断时应多联合几种标志物检测以提升诊断的阳性率。近年来，国内外学者也研究分析了其他常见肿瘤标志物与胆囊癌的关系，如糖类抗原153、糖类抗原50、上皮细胞钙黏蛋白等标志物等，在胆囊癌的分期、评估及预后评价中亦具有一定指导价值。
p53 是一种重要的抑癌基因，于1979年被首次报道。人类 p53 基因定位于17号染色体，长约20kb，编码一个分子量为543kD的氨基酸蛋白，蛋白氨基端有一个与转录因子相似的结构，与DNA结合时，可起到监测调节细胞G1期及G2期、调控细胞凋亡、参与DNA错配修复进而维持基因组稳定，以及抑制血管生成基因表达进而抑制肿瘤血管生成等作用。包括胆囊癌在内的50%以上恶性肿瘤会出现 p53 基因的突变，导致P53蛋白失活而过表达，失去负性调控功能。Sicklick JK等研究发现在胆囊癌中 p53 基因突变率可达41%。Vidaurre T等提取了30例秘鲁胆囊癌患者组织切片中DNA进行测序检测， p53 基因突变率为33.3%，与玻利维亚（50%）、匈牙利（33.3%）、智利（55.0%）、日本（50%）的研究结果相似，且与Rashid A等对中国胆囊癌患者胆囊组织检测结果（31.9%）相一致。据报道，早期胆囊癌患者P53蛋白过表达可达70%，因此提示可能有助于早期胆囊癌诊断。
ras 基因家族与人类肿瘤相关的基因包括 H - ras 、 N - ras 、 KRAS ，分别定位在11号、1号、12号染色体上。在 ras 基因中， KRAS 基因对肿瘤影响最大。正常情况下， KRAS 基因被短暂激活后，可激活下游信号蛋白进而短暂促进细胞生长及分化（图5-3）；当 KRAS 基因突变时被永久活化，使细胞内信号转导紊乱，细胞增殖失控。Hanada K等研究发现约59%的癌症中可检测到 KRAS 基因突变。Dobrzycka B等报道在肿瘤组织中， KRAS 基因阳性表达增加。卢晖等的研究对比了胆囊癌患者、胆囊炎患者及健康受试者胆囊的组织标本，发现在胆囊癌中， KRAS 基因突变阳性率达71.4%，但同时发现 KRAS 基因在正常胆囊和胆囊炎中均有表达；国外学者Itoi T等研究则认为， KRAS 基因突变或与 p53 基因过表达有关，其在胆囊癌发病的主要分子机制尚不明确。
图5-3 ras 基因突变导致Ras蛋白持续活化，细胞周期失去调控，细胞增殖失控
ERBB2 是原癌基因人类表皮生长因子受体基因，其基因定位于17号染色体，编码的跨膜受体样蛋白具有酪氨酸激酶活性（图5-4）。Yao JG等对123例胆囊癌 ERBB2 基因扩增，发现过表达检出率为22%。Li M等报道ERBB信号转导途径（包括 ERBB2 ）是胆囊癌基因突变中最广泛途径，影响约占36.8%，多因素分析进一步表明可能与患者预后相关。刘会春通过对40例胆囊癌组织进行免疫组织化学染色，发现 ERBB2 阳性反应达32.5%，但与病理分期无关，表明 ERBB2 突变在促进胆囊癌恶变中有重要作用，但与肿瘤发展的关系不密切。国内外研究认为 ERBB2 突变对于胆囊癌的作用，与 TP53 、 p16 等基因的失活、激活突变具有相互诱导、调节和协同作用。
图5-4 磷酸化的Rb蛋白无法结合E2F转录因子，导致细胞增殖基因持续开放
D.周期蛋白；A/E.周期蛋白A/E。
p16 基因是位于人类9号染色体短臂的一种抑癌基因，最初于1994年被报道。 p16 基因是一种细胞周期中起负性调节细胞增殖及分裂作用的基本基因，已在肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、皮肤癌等多种恶性肿瘤中发现缺失、无义、错义等突变。P16蛋白作用于细胞分裂周期关键酶CDK4及细胞周期素cyclin复合体使得细胞进入S期。突变的 p16 基因过表达，则不能完成上述过程，最终导致细胞进入恶性增殖，加速肿瘤进展。Ueki T等对68例胆囊癌基因测序，发现61.8%的 p16 基因发生了突变，且突变患者的平均生存期与无突变患者有显著差异。Choi HJ等对比正常胆囊、慢性胆囊炎、胆囊腺瘤、异型增生及胆囊癌的免疫组织化学检测结果，发现在高级别异型增生组织中 p16 表达率为45%，而在胆囊癌中表达率为27.6%，表明P16蛋白过表达是胆囊癌发生早期事件，可能是胆囊癌及其癌前病变的辅助诊断指标。
杂合性丢失（loss of heterozygosity，LOH）指一对杂合的等位基因变为纯合等位基因，通常是由父源或母源染色的局部重复引起。杂合性丢失是人类癌症中最常见的丢失等位基因的途径，这是肿瘤免疫编辑的关键。突变的基因产生新抗原易被免疫系统清除，而杂合性丢失的基因则可以降低突变抗原的表达使肿瘤细胞逃避免疫攻击。随着对突变癌细胞的免疫压力增加，一些具有广泛基因组突变、可以删除变异新抗原的LOH肿瘤细胞可能更具生存优势，从而扩大并占据整个肿瘤区域。Joseph CG等认为杂合性丢失的肿瘤细胞可能是一种比其他方法更快或更有效逃避免疫监视的方法，如第6号染色体上的杂合性丢失降低人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-Ⅰ的表达，从而将抗原隐藏在细胞表面。胆囊癌中存在很多杂合等位基因丢失，分布于多个不同的染色体区域，如3p、9p、22p等，特别是在3号染色体短臂上有许多等位基因丢失的位点。
微卫星由2～6个核苷酸序列组成，是具有高度多态性的核苷酸序列。微卫星不稳定性（MSI）是指由于复制错误，使微卫星增多或减少，导致DNA等位基因发生改变，是肿瘤危险性可检测指标之一。Goldin等研究发现约10%的胆囊癌病例存在高度的微卫星不稳定性现象。智利及日本学者报道当地胆囊癌病例微卫星不稳定性现象达20%～33%。目前有关这些方向的研究缺乏高质量的研究成果，尚处于描述性分析阶段。
对于低识别或中度外显原癌基因的研究方法一般为参考基因法，即通过病例对照研究比较癌症患者和健康对照者的等位基因，并对结果进行统计分析，这些基因也被称为易感性候选基因。大多数研究都是基于编码蛋白质的基因，如参与细胞凋亡、细胞周期调控、DNA修复或其他危险因素的基因。已知的基因对胆囊癌遗传易感性很小，但很多有潜在影响的基因尚未被发现。目前发现的多数的候选基因与胆汁酸合成、胆囊收缩、脂质代谢、细胞周期、DNA修复等相关，如 MTHFR 、载脂蛋白B、 GSTM1 、 CCKAR 、 XPC 、 APEX1 、 CYP1A1 等。但由于目前尚无系统研究胆囊癌靶基因谱的参考基因选择，大多数试验选用不同的参考基因，且由于数量有限，无法得出明确结论。
高通量测序技术又称第二代测序技术，以微板作为实验工具载体，同一时间检测数以千万的样品，对几十万到几百万DNA分子进行测序。近年高通量的研究使大规模重复试验成为可能，理论上可以研究所有21 000个基因对细胞功能或疾病的潜在影响。但对于胆囊癌，高通量的研究很有限。中国学者Li等利用高通量技术对胆囊癌靶基因测序发现了ERBB通路的反复突变。胆囊癌相关的单基因研究数量较多，但分子靶点、诊断缺乏系统性，成果转化为临床应用的比例仍较低。
胆囊癌的发生发展生物分子机制复杂，目前对于胆囊癌的分子生物学研究多基于胃肠道、胰腺恶性肿瘤的研究，且深度尚不充分，尽管有许多关于胆囊癌遗传易感性的文章，但目前尚无明确的遗传标记。技术进步有助于更好地了解胆囊癌的发病机制，通过高通量测序技术的研究可以发现其他特征性突变。诊断胆囊癌的肿瘤标志物特异性较低，使疾病直到晚期才被发现，增加了治疗的困难。目前研究领域的技术虽有进步，但胆囊癌患者的预后都没有显著改善，因此，未来对胆囊癌分子生物学研究的侧重点应为早期诊断、新药开发及基因治疗，这些又必须依赖于对胆囊癌基础的研究。新兴技术如单克隆抗体、基因芯片技术的改进，使我们可以进行基因表达、药物实验、靶点检测等分析，以期实现胆囊癌的个体化治疗。本节对胆囊癌分子生物学研究进展进行了综述总结，望有助于研究人员了解目前研究情况及成果，为今后的研究工作提供适当方向。