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胆囊癌是胆系肿瘤中最常见的一种，早期诊断率和手术切除率均较低，预后差。为了提高胆囊癌的诊疗水平，胆囊癌的分子生物学研究日益受到人们的重视，人们希望能够从分子水平上阐明胆囊癌的发生、发展、转移和预后。近年来，由于分子生物学方法和技术的迅速发展，国内外学者对多种与胆囊癌相关的分子生物学标志物，如胆囊癌原癌基因与抑癌基因，以及分子转移机制等方面进行了研究。以下简要介绍几种目前应用十分广泛且与胆囊癌密切相关的分子生物学方法和技术。
随着生物学技术的不断发展，众多科学家对各种临床疾病特别是肿瘤领域不再仅仅局限于单个基因或位点的研究，全基因组的研究日益受到重视。因此，第二代测序技术（second generation sequencing techniques）于20世纪80年代应运而生。其具有精确度高、通量大和信息量丰富等优点，基本原理就是聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增DNA时，利用标记在碱基上的化学标记物发出的光信号或质子流信号间接读取序列信息，同时它可对目标基因进行染色体定位，为肿瘤的研究及治疗提供了崭新的思路。2005年，第二代测序仪出现，并且很快应用到了医学领域。目前第二代测序技术在肿瘤的预防、发生、转移、治疗，以及肿瘤预后研究中发挥了巨大的作用。在胆囊癌研究中，众多科学家利用第二代测序技术分析胆囊癌基因突变谱，筛选出有意义的突变位点，如肿瘤抑癌基因 TP53 、 KRAS 、 ERBB 家族基因、染色质重塑基因家族等。
Javle等通过对554例胆道恶性肿瘤患者（包括85例胆囊癌）的石蜡标本测序发现， TP53 突变基因最多，约占59%，同时其与肿瘤分级、预后密切相关。深层次研究 TP53 对于评估患者预后及靶向治疗意义重大。同时，Javle等通过对胆囊癌组织标本进行基因组测序，发现 KRAS 基因突变与预后不良关系密切，其研究还发现两种特殊突变类型—— FGF10 基因扩增和 FGF3 - TACC 基因融合，这两种突变基因可为个体化治疗提供重要信息。
近几年来， ERBB 基因家族在胆囊癌中的突变研究越来越受到重视。国内一项研究利用外显子测序和癌症相关基因的超深度测序组合鉴定57个胆囊癌体细胞突变，发现 ERBB 信号转导（包括 EGFR 、 ERBB3 、 ERBB4 及其下游基因）是最广泛的突变途径。进一步统计学分析发现ERBB信号转导途径突变的病例预后较差，而这些突出了 ERBB 信号转导在胆囊癌发病机制中的关键作用。
尽管胆囊癌突变谱尚未完善，突变基因对胆囊癌发生发展的影响尚未完全阐明，甚至存在众多争议，但相信随着第二代测序技术的不断发展，胆囊癌患者终将会因为该项技术而受益。
基因芯片技术又称DNA芯片，其测序原理就是通过杂交技术与一组已知序列的核酸探针杂交，然后进行核酸序列测定。该技术具有高效率、高通量、低污染等优点。目前基因芯片技术可用于寻找肿瘤相关基因、研究肿瘤基因表达谱、寻找肿瘤治疗的靶向位点。在肿瘤的预防、诊断、治疗、预后等方面被广泛关注和应用。
基因芯片技术的出现使肿瘤的研究内容更加丰富、研究方法更加快速高效，获得结果更加直接准确。目前，众多研究者利用这一技术研究胆囊癌突变位点，通过与健康人群基因比对筛选肿瘤相关基因，以及提取胆囊癌组织产生的小分子核酸物质，而这也为胆囊癌的早期诊断、评估转移风险、治疗及评价预后提供了新的思路。
水孔蛋白（aquaporin，AQP）被认为在控制胆汁形成过程中十分重要，但确切作用尚未阐明。Sekine等用抗AQP-5小干扰RNA转染表达AQP-5胆囊癌细胞系，然后再利用芯片技术及组织微阵列测定微RNA（microRNA，miRNA），发现miR-21在胆囊癌细胞系中高表达。进一步研究发现磷酸酶和张力蛋白同源物是miR-21的靶标，最后通过统计学分析表明AQP-5和 PTEN 基因级联是评价胆囊癌侵袭性及预后的有利生物标志物。
尽管这项技术仍旧面临着众多的挑战，但随着该项技术的不断运用及完善，其在胆囊癌后续研究中，必将发挥越来越大的作用（图5-1）。
图5-1 基因芯片技术流程图
聚合酶链反应（PCR）是最常用的分子生物学技术之一，通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增。由于肿瘤是一种多基因、多阶段、多因素参与的疾病，且它的发生一般表现为原癌基因激活、抑癌基因抑制、DNA修复基因失活等。利用PCR联合其他一些技术，如聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR restricition fragment length polymorphism，PCR-RFLP）可检测有无基因突变，以及寻找基因突变位点，为肿瘤靶向治疗提供理论依据。近年来，数字PCR技术正在兴起，它可用于极微量核酸样本及稀有突变位点的检测，尤其适用于肿瘤治疗过程中的动态监测。它具有灵敏度高、可定量分析的优势，可用于肿瘤的诊断、治疗干预、药物疗效评价、肿瘤复发转移预测等。PCR技术往往不会单独应用，一般会联合其他生物学技术如基因芯片、印记杂交等，将筛选出的目标基因进行PCR扩增，进行进一步研究。
当一个正常细胞转变成为一个肿瘤细胞时，蛋白质的表达会发生一些明显变化。蛋白质分析技术能够从细胞水平上显示出肿瘤变化过程中蛋白质的变化，对肿瘤的早期诊断、发生发展、治疗及预后的评估具有重要的意义。目前常用的蛋白质分析技术包括双向凝胶电泳技术及蛋白质芯片技术等。
双向凝胶电泳技术是目前蛋白组学的三大支撑技术之一。其原理是先根据蛋白质等电点不同，使蛋白质得到第一次分离，然后再根据蛋白质分子量大小不同，在特殊介质下再一次分离。随着双向凝胶电泳的不断发展，在此基础上又发展出一种新型的分析手段：荧光差异显示双向凝胶电泳。此技术是在双向电泳基础上加入荧光标记技术，从而得到不同样品结果，分析得到存在表达差异的蛋白质。
蛋白质芯片（protein chip）是一种高通量的蛋白功能分析技术，该技术不仅是蛋白质组学研究中强有力的工具，也是疾病早期诊断、治疗效果评测的新手段。其原理是用未标记或标记的生物分子与芯片上的探针进行特异性结合，再通过特定的扫描装置进行检测、分析处理。具有特异性强、样本前处理简单、效率极高、使用方便等优点。但是蛋白质芯片的制备及反应过程比基因芯片更复杂，在众多环节中存在着技术问题，随着蛋白质芯片技术的日益完善，它必将为肿瘤疾病的生物学表达信息、药物筛选及药物靶点的选择提供更有利的技术支持。
尽管蛋白质分析技术多种多样，但是应用于胆囊癌的研究中却较少。目前，多种肿瘤如乳腺癌、肺癌、大肠癌等恶性肿瘤因蛋白质分析技术的发展而受益，如发现新的蛋白标志物，建立肿瘤蛋白差异图谱等。希望不久的将来，蛋白质分析技术会更多地应用于胆囊癌的研究（图5-2）。
图5-2 蛋白质芯片研究内容
分子印迹技术发端于20世纪70年代初，是制备模拟抗体和酶的专一识别性能的重要仿生识别技术。分子印迹材料是近20年来研究非常活跃的功能材料之一，已经在肿瘤领域研究中展现出独特的优势和潜力，并广泛用于肿瘤DNA、RNA、蛋白质的检测。人们熟知的分子印迹技术包括DNA印迹法（Southern印迹法）、RNA印迹法（Northern印迹法）、蛋白质印迹法（Western印迹法）、斑点印迹法。
国内一项研究利用蛋白质印迹法探讨黏着斑蛋白Kindlin-2对胆囊癌细胞生物学行为的影响及相关分子机制，通过测定30例胆囊癌组织及癌旁组织Kindlin-2表达水平，发现Kindlin-2在胆囊癌组织中高表达，且与胆囊癌侵袭迁移等恶性行为密切相关。
目前分子印迹技术使多种肿瘤的研究取得重大突破，但是关于胆囊癌研究应用分子印迹技术的仍然很少。
单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）是只识别单一抗原表位的抗体，它来源于一个杂交瘤细胞的克隆，也可来源于单个B淋巴细胞。与目前用于临床诊断的肿瘤标记物相比，它具有性状单一、生物活性单一、特异性更强等优点。筛选和制备特异性肿瘤标记物的单克隆抗体一直是研究的热点。目前，众多学者利用单克隆抗体技术特异识别胆囊癌组织表达的抗原，通过分析其表达水平来揭示其在胆囊癌诊断、侵袭、预后的意义。
日本学者利用单克隆抗体MY.1E12识别胆囊癌组织中MUC1表达，通过分析其表达水平发现MUC1可能是与胆囊癌侵袭性相关的一种独特的生物学标志物；同样是日本学者利用单克隆抗体FU-MK-1特异识别胆囊癌组织表达中的MK-1，发现它是一个更好的评估预后的抗原预测标志物。随着单克隆技术的不断发展，越来越多的更有意义的单克隆抗体将会应用于胆囊癌研究，并在胆囊癌的早期诊断、治疗干预及评估预后等方面发挥巨大作用。
液体活检技术这一概念最早在1974年由Sorrells等提出，但是由于各种原因并没有受到人们的重视。近几年来，液体活检技术再次回到人们的视线，特别是在肿瘤领域研究十分火热，多方面的研究已经证实其在肿瘤的早期诊断、发生转归、转移、治疗及疗效判断等方面具有重要的意义。本技术将在本章第三节重点讲述。
以上简要介绍了几种近年常用及新兴的分子生物学技术，当然，分子生物学的研究方法及技术不仅仅局限于这些。这些技术中有的已经用于胆囊癌的分子生物学研究，有的还尚在探索当中，而且研究胆囊癌的分子生物学特性有时需要几种技术的联合应用。相信在不久的将来，随着分子生物学的发展及人们对这些方法和技术的熟练应用，胆囊癌的诊治水平会得到进一步的提高。