基础研究常常是临床研究的理论基础,只有在基础研究上得到充分验证的疗法才能进行进一步的临床试验。低温的基础研究不仅能够验证其在各种疾病中的有效性、安全性以及可行性,更重要的是基础研究能够揭示低温的神经保护作用机制。探究低温的保护机制不仅是知其然而知其所以然,为进一步的临床试验提供依据,而且是为其他神经保护疗法提供治疗靶点。所以回顾并展望低温的基础研究是必要的。本节将以神经系统疾病模型为线索,回顾既往的低温基础研究。
脑缺血模型根据其缺血范围,可以分为全脑缺血模型以及局灶性缺血模型。全脑缺血主要由外伤所致低血容量性休克、心脏骤停及新生儿缺血缺氧性脑病等疾病引起。故啮齿动物全脑缺血模型常用于模拟心搏骤停、新生儿缺血缺氧性脑病等疾病,早期也有部分研究人员通过结扎颈内动脉的方式构建全脑缺血模型模拟缺血性卒中。其操作方法包括且不限于环境缺血缺氧、断头、双侧颈总动脉及其他大血管结扎。然而,全脑缺血模型与人类发生缺血性卒中的病理机制有所不同。研究亚低温治疗对急性缺血性卒中神经保护作用的最佳模型是局部脑缺血模型。局部缺血模型主要是通过结扎颈总动脉以上大血管或利用线栓或自体血栓等闭塞大脑中动脉来起到模拟缺血性卒中发病过程的作用。
早在20世纪80年代,已有动物实验证明了低温治疗对于心室肥大引起心搏骤停大鼠模型神经预后的改善作用。90年代亦出现专注于新生儿缺血缺氧性脑病的低温保护实验。通过对出生10天的豚鼠进行全身缺氧,再随机分为低温(32℃)及常温组,结果发现低温组豚鼠其神经功能预后更好。1989年,有研究使用猫全脑缺血模型发现,低温可以改善全脑缺血及循环恢复后细胞代谢及稳定细胞内pH。这提示低温不仅对啮齿类动物脑缺血有保护作用,对于其他更大型的动物也有一定的神经保护作用。
对于局灶性卒中,早在1954年,低温便被发现可以降低狗的脑代谢率,1957年,研究者们更是在狗的局部脑缺血模型上观察到低温(24℃)的脑保护作用。但是重度低温引发的副作用使实验得不偿失,之后甚至有研究报道因为过低温度引起的血液黏稠会加重脑损伤。1992年,有研究者使用自发性高血压大鼠,首次探讨了亚低温治疗对大脑中动脉闭塞性卒中的作用。研究人员分别构建永久闭塞模型和短暂闭塞模型,并通过自然降温的方式诱导亚低温(颅骨膜温度被降至33℃),其结果是亚低温治疗显著降低了大脑中动脉短暂闭塞模型大鼠的脑梗死体积,而对永久闭塞模型大鼠的梗死体积则无明显影响。这一结果不仅提示亚低温治疗对于缺血性卒中具有神经保护作用,更进一步表明亚低温治疗的具体疗效可能与血管是否再通有关。
2002年,选择性脑动脉内低温的概念被提出,即直接向短暂缺血模型大鼠的闭塞血管内灌注低温液体诱导低温治疗。研究结果证实了这种局部动脉内低温治疗的神经保护作用。选择性脑动脉内低温概念的提出是开创性的,后续有多项研究在此基础上进行了进一步的探索。
一篇2020年发表的研究,研究者通过人造血栓短暂或永久闭塞恒河猴大脑中动脉来模拟人类卒中后血管再通与未再通两种状况,并通过微导管向大脑中动脉近端注入冷溶液将缺血区域降至35℃以下。结果发现,在再通组,局部亚低温显著地减少了梗死体积以及神经功能损伤,改善了恒河猴上肢运动功能,而在未再通组,局部亚低温并不能有效改善梗死体积及神经功能预后,这一结果一方面提示了亚低温在非人灵长类动物卒中模型中仍能够起到神经保护作用,另一方面提示了再通疗法仍然是急性缺血性卒中最具有保障的疗法,亚低温可以对再通疗法起到辅助作用。
低温对脑缺血的神经保护作用覆盖脑缺血病理生理各个方面(表1-1)。有文章指出,如果核心体温降低1℃,机体的代谢可降低5%~8%。在脑细胞发生缺血时,降低细胞代谢一方面减少细胞对氧气和营养物质的消耗,另一方面也可以减少有害物质如乳酸的堆积。减少乳酸及二氧化碳等物质堆积可以延缓细胞酸中毒的发生。同时,低温降低细胞代谢也维持了细胞内ATP浓度,间接稳定细胞内离子浓度。当细胞内ATP耗尽时,会引起钙离子的内流,从而引起谷氨酸等兴奋性氨基酸的内流,引起神经兴奋性毒性损伤。而低温可以对这一通路起到一定程度的抑制作用。脑组织发生缺血缺氧后的数小时,神经细胞缺血死亡,释放“危险信号”,促进细胞炎性因子、趋化因子、活性氧和一氧化氮等神经毒性物质的产生,介导血脑屏障破坏以及一系列炎症级联反应;与此同时,脑血管内皮细胞黏附分子表达增高,免疫炎症细胞如多形核中性粒细胞、淋巴细胞和单核巨噬细胞等穿过血管内皮细胞进入脑组织,通过识别脑内中枢神经系统所暴露的抗原,激活适应性免疫反应。大量基础研究表明,低温可以通过调节炎症反应减少缺氧带来的损伤。如果不经过血管再通或者循环恢复,在缺血性疾病的亚急性期,细胞还会因为缺氧环境对细胞凋亡途径的激活而发生凋亡。而低温可以抑制这些细胞凋亡途径从而增加脑细胞存活率。其中具有代表性的是低温可以抑制细胞色素C的释放进一步抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)诱发的细胞凋亡。对于缺血性疾病,其损伤不仅是缺血带来的各种原发性损伤,还有再灌注后发生的继发性损伤。在缺血组织接受血流再灌注后,细胞在缺血时累积的琥珀酸可经由线粒体产生大量氧自由基引起细胞损伤。而啮齿类动物实验表明,低温可以通过减少氧化应激来减轻再灌注损伤。
表1-1 亚低温对脑缺血神经保护作用
颅脑外伤在低温治疗领域中是较早引起研究人员兴趣的疾病。根据文献报道,早在20世纪50年代就有科研人员将低温治疗用于重症颅脑外伤患者的救治。然而,受严重不良反应的影响,这一治疗方式后续逐渐被弃用。一些科研人员开始回归到基础研究中探索低温治疗对颅脑外伤模型动物的神经保护作用。1991年,一项利用大鼠液压冲击损伤模型的研究发现,在大鼠发生颅脑外伤前给予低温保护可降低模型动物的死亡率并改善神经功能预后。1994年,有研究者指出,颅脑外伤发生5分钟后对模型动物进行低温治疗也可有效减轻脑组织挫伤程度并改善神经功能预后。除了低温开始诱导时间,也有研究对低温治疗的时间窗进行了探索。根据研究结果,颅脑外伤发生60分钟内对模型动物诱导低温可产生明确的神经保护作用,而这种作用若在90分钟时诱导则不再显著。总而言之,相当一部分基础实验表明,低温对实验动物颅脑外伤是有效的。
脑出血发病率、致死率高,且其最佳治疗方式存在争议,大量基础实验对其发病机制、预后影响因素以及治疗方式进行了研究。血肿体积、部位、血肿周围水肿、占位效应、中线移位以及脑疝在内的诸多因素均决定了脑出血患者预后。脑出血血肿体积增大的机制复杂,可能涉及凝血酶形成、促炎介质释放、血脑屏障破坏以及促凋亡信号通路上调等。而低温对于这些机制的作用在其他疾病中已经得到部分证实,所以低温对于脑出血后的神经保护理论上是可行的。2017年一篇纳入18项基础研究的meta分析指出,低温可以减少脑出血后血肿周围水肿体积以及改善神经功能预后,但对血肿体积无明显影响。与此结果类似,Broessner等人的一篇综述系统回顾了低温对于脑出血神经保护的基础研究。在这6项关注于血肿体积的研究中,有5项研究未能发现血肿体积的变化。另一方面,共有11项研究评估了低温治疗对血肿周围水肿的影响。其中研究均报道了低温治疗对减轻血肿周围水肿具有一定疗效。有8项研究评估了低温治疗对血脑屏障的保护作用,这些结果均一致表明低温治疗可提升脑出血后血脑屏障的完整性。这些基础研究结果显示,低温对减少血肿周围水肿体积、保护血脑屏障等均有一定作用。用低温来减少脑出血后继发性损伤是可行的。
癫痫是一组病因各异且预后不同的神经功能障碍疾病,其发病机制可能是神经元的异常放电。临床上常使用苯二氮
类、苯妥英钠等治疗痫性发作,但是仍然有部分痫性发作不能通过药物缓解,所以有部分学者将目光投向非药物治疗,其中就包括低温疗法。
低温对癫痫的治疗主要是通过抑制痫性发作以及对继发性癫痫原发病的治疗,后者将放在其他疾病讲解,此处不做赘述。1969年便有学者用青霉素诱发猫皮质癫痫,并发现将局部皮质温度控制在27.5~36℃(平均32℃),可停止痫性发作。需要指出的是,在复温过程中,痫性发作再次出现。在其他癫痫诱导模型[如钨酸凝胶、士的宁(番木鳖碱)诱导痫性放电等]中,同样观察到低温对痫性放电的抑制作用,但也观察到复温过程的痫性放电现象。有研究表明,低温抑制痫性放电很可能是通过调节与电信号转导相关的离子通道进行,低温可以减少突触传递。同时也有研究表明,低温可以增加神经元输入电阻,进而起到抑制痫性放电的作用。简而言之,低温对癫痫疗效在基础研究中已有表现,但是同低温在其他神经疾病面对的困境相似,低温的种种关键指标仍然未明确。
低温治疗领域的基础研究大致可分为两种思路。一种是深入探索低温治疗发挥神经保护作用的具体机制,进一步为其临床应用提供理论依据;另一种是服务于临床转化,对于同种疾病,尝试通过不同动物模型探索小动物—大动物—人类全链条临床转化理论的可行性(图1-2)。目前,低温治疗在小动物模型中展现神经保护作用的案例有很多,但能够在大型随机对照临床研究中同样展现出神经保护作用的案例却仅有心搏骤停以及新生儿缺血缺氧性脑病。其中的原因是复杂的,我们将在后文中结合我们的认知给出解释。
图1-2 亚低温临床转化证据链