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非人灵长类应用于医学研究已经有很长的历史，由于其在亲缘关系上与人类最接近，与人类的遗传物质有75%～85%的同源性，在生理结构以及免疫代谢方面与人类高度相似，是医学研究中具有极高价值的实验动物。非人灵长类动物脑卒中模型具有巨大的转化研究优势。相比于啮齿类动物，灵长类动物的止凝血成分，包括血小板、血浆凝固、纤溶和抑制蛋白，以及多形核白细胞在超微结构、抗原性、功能（动力学）和浓度方面与人类更接近。在脑组织解剖结构方法，灵长类动物的脑血管解剖学与人类相似，特别是灵长类动物有大量的脑皮质下白质。在制备脑缺血模型研究中，灵长类动物大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）卒中模型在MCA分支的单一血管区域提供了可重复的、明确的、可预测的非致命性脑梗死。MCA血流阻塞在动脉压迫模型中是非血栓性的。MCA流动障碍是可选择的，可以方便地研究临床相关结果，远离手术植入程序，从而避免了手术和麻醉对细胞功能的混淆变量。
灵长类动物MCA再灌注可使血流进入同侧MCA，模拟患者再灌注情况，同时也存在再灌注损伤的影响。采用介入手术方法制备模型，动物的颅脑是封闭的，从而保持颅内压和中枢神经系统的正常温度（37～38℃），采用开颅手术制备模型，需要打开颅骨、硬脑膜等揭破结构，破坏颅脑封闭情况。持续MCA闭塞后的病理变化为典型的完全脑梗死。局灶性脑缺血模型的一个高度相关的新方面是灵长类基底神经节的神经元损伤速度明显快于大鼠尾壳核和这些区域微血管解剖的相关差异。这种情况与脑卒中患者病理改变非常相近。但是，灵长类动物模型也存在一些缺点，例如模型的开发和维护需要专门配备人员和设备、设施来照顾灵长类动物；需要适当的高质量手术和成像设备来准备模型和量化结果；非人灵长类庞大的开支是该模型应用的主要劣势。
内皮素-1（ET-1）是一种血管收缩剂，最近被用来诱导啮齿类动物和狨猴局部缺血。然而，与啮齿类动物和狨猴相比，猕猴有很多优势，这使得猕猴成为研究脑卒中的不可替代的动物模型。ET-1可诱导非人灵长类动物局灶性脑缺血是研究脑卒中机制及脑卒中后修复的潜在的模型。
该项研究中选择成年恒河猴，手术过程中使用加热垫使体温保持在正常水平。麻醉后将头固定在立体定位仪上，在中央前回上方2～3cm的头骨部分，包含了M1的手部表现与常用手相反的移动。利用电针治疗仪进行皮质内微刺激，构建了手运动皮层的表示区域地图。两个电极的穿透间隔为2mm。一个电极被放置在大脑表面，另一个电极被放置在深度为3mm的大脑皮质。传统的电刺激被用来唤起在每个电极穿透运动。在刺激过程中，M1皮质与2mm 2 范围内的一根手指相对应的区域被仔细的定义。在覆盖主要手指区域的皮质5个位置注射ET-1，注射是在皮质表面以下3.5mm的深度进行的，每注射1/3体积后抬高注射针0.5mm。采用进样泵进行进样。手术后，小心地关闭颅骨开口，用密封线固定在颅骨上。麻醉苏醒。术后影像学研究显示，注射ET-1后7天存在局部脑缺血、水肿等表现，行为学评估发现，模型动物出现手部精细运动障碍等神经功能缺损症状。局部注射ET-1的方法易于操作，但是每只模型动物对于ET-1反应不完全相同，而且不能控制缺血和再通时间，出现的临床症状通常较轻。
该方法是以往研究中报道最多的制备灵长类动物模型的方法。制作颅骨钻孔和脑内细线热电偶传感器被放置在额叶或顶叶的薄壁组织中。动物身体下部有温毯保暖保持体温。
动物采取俯卧位，头部支撑在立体定向头部固定器中。准备好左侧眼眶，左眼球用探针进行导出。分开视神经和眼动脉，左边眼球被切除。切除剩余眶周的脂肪和眼外肌。用高速气动钻取出后眼眶骨，暴露前颅窝硬脑膜。硬脑膜被切开烧灼，蛛网膜被从Willis环中清除。将显微动脉瘤夹放置在大脑前动脉两侧和左侧颈内动脉的前脉络膜动脉的水平，夹合后阻止了脉络膜动脉。放置夹子后缺血1小时。头皮上放置不锈钢电极，对后额区域和顶点进行刺激，并记录。在间脉冲间隔时，应用3个低脉冲。5～20次训练后记录复合肌肉动作电位，取平均值测量MEPs。在夹闭动脉期间，全身血压、体温和动脉血气维持在正常水平。1小时后取出动脉夹，实现血管再通，在硬脑膜缺损处覆盖一层凝胶泡沫。用一个紧密的甲基丙烯酸甲酯填塞眼窝，然后缝合眼睑。
该方法的最大优势在于可以明确夹闭大脑中动脉，控制缺血和再通时间。但是，研究者需要在显微镜下进行眼眶摘除和眼眶后侧内壁的摘除，打开硬脑膜，找出大脑中动脉，因此导致出现造模相关并发症，影响术后行为学评估。血管闭塞是通过在左侧大脑前动脉近端至前交通动脉处，右侧大脑前动脉近端、左侧锁骨内动脉闭塞处持续放置微型动脉夹来完成的。血管夹闭持续1小时，然后取出夹子以便再灌注。
将微导管置于食蟹猴MCA的远端分支，阻断局部血流3小时，MRI检查显示模型动物出现梗死灶。此后其他研究也采用该方法制备NHPs局部脑缺血模型。但是有可能模型中出现较小的梗死灶，提示微导管并未完全闭塞目标血管。此后研究采用外径更大的微导管制备NHPs脑缺血模型，即使采用相同的闭塞部位和时间，该研究发现较大的梗死体积，明显超出闭塞血管的供血区域，提示微导管完全闭塞目标血管，造成局部血流显著变化。因此，选择合适的微导管、最佳的闭塞位置成为该方法制备NHPs模型的关键。
运用血管内神经介入技术将球囊导管置入MCA之后，加压后充盈球囊可以闭塞MCA，释放压力后撤出球囊可以实现再灌注。GAO等采用球囊导管置入的方式，短暂闭塞恒河猴MCA 2小时成功制备缺血再灌注模型，梗死灶主要位于基底节和内囊部位，模型动物出现对侧肢体瘫痪症状。另一项研究采用相似的球囊导管，短暂闭塞狒狒MCA 3小时也成功制备缺血再灌注模型。上述两项研究表明，球囊导管可以成功制备NHPs缺血再灌注模型。但是，由于上述研究所用的球囊导管直径与NHPs MCA近端直径接近，因此球囊导管只能闭塞MCA近端或颈内动脉远端血管，梗死灶通常较大，症状较重。
大部脑卒中患者的病因都是局部血栓形成或栓子闭塞MCA造成。因此，血栓方法也是常用的模型制备方法。动物麻醉后，一种入路采用颈动脉穿刺方法，另一种常用入路是暴露双侧腹股沟区的股动脉入路。分离股动脉和股静脉用于血管内置管，对动物模型进行基础MRI扫描。随后切开股动脉，用血管鞘组在导丝牵引下，将造影导管推送到右侧颈内动脉。退出导丝进行正侧位右侧颈内动脉造影。退出造影导管，将导引导管推送到右侧颈内动脉。将微导管推送到右侧大脑中动脉M1段。退出微导丝，手推造影证实微导管位置。退出微导管，推送10cm血栓导管到大脑中动脉M1段。复查血管造影，证实大脑中动脉闭塞。局部脑缺血2.5小时开始给予rt-PA溶栓。直视下缝合右侧股动脉穿刺处，缝合右侧皮下组织和皮肤，加压包扎后恢复自主呼吸，然后进行MRI检查。视动物情况，回动物房后给予术后输液治疗。
这种低温方法是由冷却系统控制诱导的，包括一个冷却帽、冷水毯和一个循环水泵，初始温度8～12℃。所有恒河猴的体温由直肠温度传感器的反馈，专有的控制算法通过修改水温进行回应。使模型的目标温度达到精确，这使得以一种无创的、有效的和精确的方式管理体温，维持72小时（温度34.5℃±0.5℃）。这种低温方法选择幼年恒河猴作为模型，发现轻度低温可以降低七氟烷麻醉造成的神经功能损伤。这种方法简便、易于调控，可以严格控制低温目标温度和时长。
本研究选用成年雌性猕猴，冷热垫（ChillerPad）装置包括：①一个由铸型聚氨酯制成的20mm×25mm厚的冷垫；②泡沫绝缘输入输出油管；③电脑控制的泵；④热电冷却器。在控制性皮质撞击（controlled cortical impact，CCI）术后2.5小时左右颅骨被重新打开，冷却垫被放置在硬脑膜上，硬脑膜下有一个热电器。在CCI后3小时，通过激活水泵和热电冷却装置，开始降温。皮质表面冷却到15℃并保持24小时，24小时后大脑冷却装置再用于从15℃到37℃复温。复温方式2.5℃/h，大约复温10小时。此低温方法可以用于外科手术开颅后或创伤性脑损伤后的高度局部低温，然而开颅前可以运用其他低温方法作为损伤时间和放置制冷垫之间的桥梁。Ren等使用5只5～7岁、8～9kg成年食蟹猴进行实验。用环形热电设备对皮质表面进行局部冷却（内径/外径/厚度：15mm/3mm/3.6mm）。环形电热芯片被黏在一个椭圆形的空心铜散热器的底部。散热器有一对进水口和出水口，通过硅胶管连接到蠕动泵上。将冷盐水（0～4℃、90ml/min）灌注到散热器中，以达到散热器的目的。降温目标温度分别为20℃、18℃、16℃。我们用螺丝通过散热器两侧对称的小孔将整个冷却装置固定在头骨上，让仪器只接触到大脑皮质表面。整个冷过程由我们实验室设计的温度控制系统控制。通过连接两个直径为0.13mm的热电器来监测皮质表面温度。根据结果显示与对照组、20℃组、18℃组相比16℃组比值有显著差异。癫痫发作时间比对照组下降53.7%，16℃组癫痫间歇时间为175.0秒±16.7秒，明显长于对照组、20℃组、18℃组。
该项研究中，研究者将面积为352mm 2 的钛冷却板长期埋入猕猴大脑的硬膜外表面，测量冷却板温度响应的时间特性，以研究冷却性能。冷却大脑皮质表面，7分钟内皮质表面被降至15℃，并保持冷却温度30分钟，流速200ml/min，冷却板灌注液体：乳酸林格氏液。脑表面温度15℃±0.2℃，液体流入温度12℃±0.4℃。冷却停止，停止循环冷却剂，复温时皮质温度同样在7分钟内升至35℃，复温时间约15分钟。此方法发现重度低温（15℃）可持续抑制癫痫发作，并且在降温和复温过程中没有发现明显的运动异常。
该项研究中使用成年雄性狒狒作为研究对象，体重25～35kg，并且使用动脉夹夹闭脊髓缺血模型。研究者利用主动脉钳夹夹闭血管，用灌注液冷却至直肠温度15℃。CPB达到该温度所需的平均持续时间约为35分钟。冷却过程中流量逐渐减少至60ml/（kg·min）（上套管为每分钟20ml/kg，下套管为每分钟40ml/kg）。直肠温度和总流量维持在上述水平，直至主动脉松开。研究发现低温的保护作用与解除主动脉阻断后脊髓下胸和腰段的脊髓血流充血反应的钝化有关。在胸腹主动脉动脉瘤修补术中，低温心肺转流所产生的深度低温可能是一种保护脊髓的有效方法，并可能降低脊髓缺血性损伤的发生率。
自体血低温也是一种特殊全身低温方法，冷血灌注可迅速降低体温，并使体温降低到一定程度，从而产生有意义的神经保护作用。这种技术在减少手术干扰、设备简单、对血液的需求最小等方面具有全身灌注的优点。同时，由于其通过冷却动物模型的自身血液，对模型目标温度、持续时间的调控更加准确和精准。在狒狒上的研究证实低温具有明确的保护。暴露椎动脉、颈内动脉、颈外动脉、颈总动脉，通过颈部的正中切口进行。局部脑低温是通过一个小型热交换器从股动脉中泵出血液来实现放置在颈总动脉中的T型套管。放置后即刻开始灌注，两椎动脉、颈总动脉均立即恢复在灌注侧导管的上游，在未灌注侧的颈动脉分叉处和双侧颈外动脉均通过预先设置的圈套结扎术闭塞。因此，通过一个单独的颈内动脉为大脑提供低温血液，并在很大程度上防止了全身的暖血对脑血管的污染，灌注开始时的流速与动物的脑血流量相等。一旦获得了所需的大脑温度，灌注流速就降低到维持这一温度水平所需的量。大脑温度保持恒定缓慢持续的低温灌注30分钟。结果表明，灌注单侧颈总动脉与灌注单侧颈内动脉大脑物质冷却速度一样快，甚至一样均匀。同样在低温灌注7～8分钟后，记录大脑不同区域的最大温差为2.7℃。大脑不同区域温度相差约1℃。单一颈内动脉冷却34分钟至大脑深部温度7℃。William等导管被置入股静脉然后进入下腔静脉，冷却到目标温度32℃持续3小时（185.3分钟±17.5分钟），在开始缺血后持续了6小时。核心温度作为反馈来控制冷却系统，并在整个卒中诱导、再灌注、冷却和再升温过程中记录核心和大脑温度。治疗后将导管从血管中取出并检查是否黏附血栓。用表面加热毯将动物加热（1.0℃/h±0.1℃/h）到正常核心温度（36.5℃±0.5℃）用时超过6小时。
研究发现，在灵长类动物模型上，通过单一的颈内动脉进行局部的低温灌注，同时闭塞颅内外大动脉的，适合于大脑半球的快速、平稳降温，而不会显著降低全身的温度。低温的大脑可以通过以低流速持续灌注冷血来维持所需的温度水平。不能依靠颅内外主要脑动脉的闭塞来完全阻断流入大脑的血液。低温的大脑在整个血管闭塞期都有再升温的现象。尽管体温保持的相对较好，但全身血压和心率的严重下降伴随的是局部热疗。15℃的脑温度持续30分钟后完全恢复，无神经后遗症。脑温持续在11.5℃以下，灌注后呼吸功能紊乱。两三周后，在2只大脑温度保持在11℃的动物身上观察到行为的改变。术后即刻，2只脑温度维持在8～9℃的动物死亡。死亡原因为呼吸衰竭。7℃的脑温度并不是致命的，也没有随后出现脑损伤的证据。
啮齿类动物研究显示，通过中空导管局部给予低温盐水，可以实现血管内低温，可以显著降低梗死体积改善神经功能。Wang等在正常恒河猴模型上验证局部低温效果。经股动脉穿刺后，将微导管到达右侧大脑中动脉水平段，经导引导管及微导管内造影确认微导管位置正确。冷的林格氏液（4℃）100ml经过微导管注入大脑中动脉。经大脑中动脉局部灌注冷的林格氏液能迅速降低大脑皮质和纹状体区的温度，在皮质，降幅从37.7℃±0.1℃降低到34.0℃±0.6℃，在纹状体从37.6℃±0.1℃降至33.9℃±0.3℃。局部大脑中动脉灌注乳酸林格氏液20分钟后大脑温度降到最低的治疗温度。因此，局部血管内低温具有降温速度快以及血管内介入方法可以协同应用的巨大优势。
局部灌注时全身温度（直肠最低温度）出现在灌注低温液体20分钟时。局部低温林格氏液灌注后直肠温度从37.5℃±0.2℃降为37.1℃±0.2℃（ P ＜0.05）。体重10kg的恒河猴的总血容量为400m l，在此基础上，选择100ml生理盐水，占总血容量的25%。所有模型动物均能耐受局部低温，未出现手术并发症导致的生命体征变化。所监测的主要生理体征指标（血压、动脉血氧含量、呼吸频率、心率等）均在正常范围波动。局部灌注冷林格氏液诱导大脑低温实验结束麻醉复苏后，所有动物均表现出精神不振、厌食、疲劳等现象，但术后第三天时所有动物行为活动均已正常，神经功能评分显示无神经功能损害。以上结果显示，血管内局部低温对于灵长类动物模型具有安全性。随着介入神经技术和材料的不断改进，特别是急诊取栓的广泛开展，在溶栓或取栓基础上的低温神经保护方法将显著改善急性脑卒中患者的预后。
虽然低温在细胞通路水平上恢复了基因表达到正常水平，选择性的调节与蛋白质有关的几个基因的表达合成和折叠，钙稳态、细胞和突触完整性、炎症、细胞死亡和凋亡。我们发现在MCAO和早期再灌注4小时时的低温是一种有效的神经保护剂，可以显著地减少梗死体积，改善神经预后。在基因表达水平上，前期研究发现了几个与这种保护相关的个体基因，这些基因之前并未涉及脑缺血史的低体温，包括HNRNPAB、HIG-1和JAK3。低温可以选择性地调控与蛋白质合成和折叠、钙稳态、细胞和突触完整性以及炎症相关的基因表达。虽然没有与神经保护相关的单一通路，低温整体抑制了通路水平上的缺血驱动基因调控，低温显著改变了基因网络。因此，低温可在短暂的局灶性脑缺血后的亚急性期诱导细胞凋亡的积极抑制。
低温已被证明会降低神经元的新陈代谢。它最大限度地减少葡萄糖利用和氧气消耗，减少厌氧代谢的酸性终产物。研究表明，温度每下降1℃，大脑代谢氧消耗就减少约6%。代谢能量消耗降低的细胞将在相对能量衰竭的条件下存活更长时间。立即开始低温治疗可能会减小坏死核的大小，并使半影区更大比例的缺血组织存活，直到获得再灌注或充分的侧支循环。
低温抑制谷氨酸介导的电压依赖性钙通道的激活以及谷氨酸的突触前释放。此外低温降低甘氨酸水平，甘氨酸是激活钙通道所需的NMDA受体的协同激动剂，从而降低了NMDA受体的激活。低温还上调谷氨酸转运体，促进其摄取。阻断突触前谷氨酸释放和突触后NMDA受体的活化，激活谷氨酸吸收可能中断正反馈循环缺血性兴奋性毒性。低温可以抑制免疫细胞暴露于受损和坏死组织引起的炎症反应。低温还可以调节神经炎症反应，抑制或延迟胶质激活，降低白细胞介素-1b的上调，降低肿瘤坏死因子受体的表达。此外，BBB和趋化因子还原的完整性降低了炎症细胞向缺血组织的迁移。低温可以抑制多种细胞凋亡途径，这是一种对细胞损伤的基因程序化反应。降低促凋亡蛋白，包括p53、Bcl-2蛋白的表达，调节肿瘤坏死因子通路。这些机制将保持线粒体的完整性，减少细胞色素C的释放。最需要的是，它直接拮抗半光天冬酶途径，这是程序性细胞死亡的最终途径。冷休克蛋白在脑冷却过程中保持活性。这些蛋白减少内质网应激，诱导细胞凋亡。
低温可以抑制氧化应激，抑制由能量衰竭产生的自由基的产生和活动，以及他们对细胞膜和线粒体的破坏作用。因此，它保留线粒体结构，稳定膜通透性，并限制凋亡蛋白的释放。此外，低温可使抗氧化酶尤其是超氧化物歧化酶的水平升高，从而对有害的活性氧自由基产生拮抗作用。低温可以抑制水肿的形成，部分原因是通过降低NMDA受体的激活，调节过多的钠内流和高渗水拉力。缺血性水肿——细胞毒性水肿和血管源性水肿的结合，通过进一步压缩营养血液供应而加剧组织损伤。在极端情况下，缺血性水肿会升级为自我恶化过程，导致脑疝。低温通过抑制基质金属蛋白酶的产生和维持血脑屏障的完整性来降低出血性转化的风险。出血性转化的恐惧是一个更大的因素，阻止了各种再通治疗再延长时间窗的使用。低温可防止中、重度脑卒中引起的ICP升高。半影组织侧支的供应依赖于脑灌注压力，而颅内压升高与灌注压力呈负相关。较高的颅内压可导致侧支循环衰竭，使缺血的核心扩大。实验研究发现低温对卒中24小时ICP升高的持续影响。这可能会导致更好的结果，减少临床上疝和死亡率。低温通过抑制与缺血性卒中后高发病率和高死亡率相关的癫痫活动，提供了另一种神经保护途径。
按照动物实验的基本要求，我们应该采用3R原则，即减少（reduction）、优化（refinement）和替代（replacement）。采用最少数量的动物达到实验目标。首先，灵长类动物的饲养和管理需要达到伦理委员会的要求。模型动物需要单独饲养在环境可控的不锈钢笼具中，每天供应两次饲料和水果，饮水自由，居住地以12小时明暗循环（光照6～8小时）、笼具规格115cm×115cm×200cm。由专人饲养，猴子可在笼中自由活动。同时必须保障动物每日的营养及维生素摄入。其次，对于神经保护研究，应该根据已知保护方法的效果，计算所需动物的最低数量。最后，还需要给实验动物提供多种保护方法，降低手术造成的损伤和痛苦。
灵长类动物神经功能评估常用的方法包括NHPSS评分法、Spetzler评分法、pRS评分方法。其中NHPSS评分方法相当于脑卒中患者急性期评估的NIHSS评分，可以从感觉、运动、认知、平衡等多个方面评估灵长类动物的神经功能缺损。pRS评分相当于脑卒中患者的mRS评分，主要从慢性期神经功能恢复评估神经保护方法的疗效。
这项任务涉及猴子从开放的一侧（绕过障碍物）获取一个奖励（水果）系在托盘上的透明盒子。在测试期间改变开箱方向。行为测试进行了8天，所有的测试都是在动物最后一餐后的23小时进行的。在每个试验中，实验者分几个反应。对于动物的每一次尝试，实验员都会在记分单上记录3个项目：①动物达到盒子的前面、左边或右边的能力，在reach act上记分。②手的选择范围，左或者右在使用的手下得分。③达到与否，在结果部分评分。利用上述参数，我们得到了几个额外的变量进行分析。运动障碍：把手伸到盒子开口处，但是没有拿回奖励。这是对有问题的手的敏感性评分，左手肌肉运动和右手肌肉运动的问题。起始时间：从闸门开启到触摸盒子或延时拿回奖励。执行：在第一次测试中从盒子里取出奖励（表明完成任务的能力）。正确：最终在试验中从盒子中获取奖励（伸出手次数＞1，完成取回奖励的实验，因为实验没有限制）。达到的数量：这只动物试图触摸盒子的次数。优先手：受试者在试验中第一次伸出的手。偏好手：每次试验左手和右手的总次数。伸手失误：伸手却离盒子开口很远（左或右）。连续的伸手反应，不管盒子打开或关闭，重复的在同一侧伸手。伸手障碍：伸手触摸关闭一侧的盒子。
采用障碍-绕道模型进行目标检索任务，评价运动功能和认知功能。在这个任务中，获取奖励的行为测量了运动功能，而学习的能力，当盒子方向改变时绕过透明屏障的能力，测量了认知功能。在短暂的左侧MCA闭塞后三周，猴子在使用左侧（同侧）健康手进行对象检索任务时没有明显的缺陷。然而，右侧（对侧）精细运动技能的缺陷是很容易检测到的。这种缺陷的特征是：当开口在各自的一侧时，猴子无法用右手抓住和取回奖励。手指明显僵硬，抓取果实时失去灵活性。提示皮质区有病变，处理控制手指运动的感觉运动输入。值得注意的是，在执行任务的过程中，患有脑卒中的动物总是用他们健康的左手去碰箱子的封闭一侧，以取回水果。这种补偿行为与脑卒中患者用于执行运动任务的复杂补偿对策相似。
（吴迪 何小夺 师敬飞 罗玉敏）
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