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在过去的二三十年中，由于抗菌药物的普遍应用，革兰阴性菌在脓毒症中的地位更为突出，加之内毒素研究手段的突破性进展，越来越多的学者更关注严重烧（创）伤后革兰阴性菌感染及内毒素的研究，而对革兰阳性菌脓毒症少有问津。然而流行病学调查资料显示，近年来由革兰阳性菌引起的脓毒症和脓毒性休克明显增多，目前已达脓毒症发病率的50%以上，其中金黄色葡萄球菌感染的发病率位居首位，是烧伤创面感染、急性肝衰竭和血源性肾炎等疾病的主要病原菌。革兰阳性菌致病的严重程度及致死率与革兰阴性菌相当，且通常与革兰阴性菌脓毒症同时发生，协同作用，使脓毒症的病理生理过程进一步恶化，严重威胁着患者的生命。
与革兰阴性菌相比，以金葡菌为代表的革兰阳性菌致病成分更为复杂，包括细菌细胞壁成分、胞外酶和外毒素等多种因子，其中金葡菌细胞壁成分［主要是肽聚糖（peptidoglycan，PGN）和磷壁酸（teichoic acid，LTA）］、外毒素［包括葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxins，SE）和中毒性休克综合征毒素-1（toxic shock syndrome toxin-1，TSST-1）］在金葡菌脓毒症和MODS的发生、发展中可能占有重要地位。体内外研究表明，肽聚糖和磷壁酸具有很强的抗原性及“内毒素样”生物学活性，可通过脂多糖受体CD14介导的信号通路诱导单核-巨噬细胞活化以及TNF-α、IL-6和一氧化氮等炎症介质合成、释放，但其刺激能力明显低于内毒素。金葡菌的肠毒素和TSST-1均属“超抗原”（superantigen），具有强大的抗原刺激能力，T淋巴细胞为其主要的靶细胞。随着分子生物学和现代免疫技术的发展与应用，人们对细菌外毒素尤其是金葡菌外毒素的认识正在不断地深化。铜绿假单胞菌是烧（创）伤感染的另一重要致病菌，其内毒素所引致的病理生理效应已为人所熟知，但其外毒素A的作用往往被忽视。本节拟结合我们的研究工作，重点介绍细菌外毒素与烧（创）伤脓毒症关系的研究内容。
自发现白喉外毒素以来，有关细菌外毒素的研究已有近百年历史，但直到20世纪50年代进入分子生物学时期后，其研究才得到迅速发展。
经典微生物学曾认为，外毒素先是由细菌合成蛋白毒素，具有酶的活性，在菌体内多以酶原形式存在，合成后释放到菌体外，受蛋白酶作用被激活，而形成外毒素。革兰阳性球菌是产生外毒素的主要细菌，但是现在发现，许多革兰阴性菌也能产生大量的致死性外毒素，如霍乱弧菌、铜绿假单胞菌、肺炎杆菌及大肠埃希菌等。以往认为外毒素仅分泌到菌体外，现知也有存在于细胞体内的，菌体破裂后才释放于外环境中。
传统观念认为，仅有内毒素可造成机体血管舒缩功能紊乱，致使低血压并可发生休克。这种观念也已更新，Todd等首先报道了中毒性休克综合征（toxic shock syndrome，TSS），以后有人证实TSS由热原性外毒素C（pyrogenic exotoxin C，PEC）及葡萄球菌肠毒素F（staphylococcal enterotoxin F，SEF）引起。PEC及SEF均为外毒素，可见外毒素也可导致休克和MODS，甚至可以造成多器官衰竭。
多数学者认为，铜绿假单胞菌致病因素主要是内毒素，进入血循环后，形成内毒素血症。Liu等首先发现铜绿假单胞菌外毒素A（pseudomonas aeruginosa exotoxin A，PEA），并证实它是一种重要的潜在性致病的毒力因子。PEA被称为致死毒素，对鼠、狗、猴等多种动物可造成低血压及脓毒性休克，并有明显的致死作用。
在复制脓毒性休克动物模型中，单纯用内毒素攻击，结果往往不稳定。在临床中仅用内毒素抗血清治疗烧伤患者，疗效不显著。Pierson曾对严重烧伤患者给予多价铜绿假单胞菌免疫血清治疗，使菌血症的发生率及病死率显著降低。综合这些报道，大致可以体会到细菌外毒素确实有致病作用。我们测试严重烧伤铜绿假单胞菌感染患者血清中PEA含量变化，发现感染后血液中PEA含量剧增，与感染严重程度明显相关。
从分子水平的研究表明，细菌外毒素都有着相似的生物学特性以及相似的结构和功能。
无论哪一种细菌外毒素都具有双功能蛋白质。其一是结合部分，它可识别靶细胞膜上的特异性受体，并与之结合，决定毒素对机体细胞的选择亲和性。另一为毒素活性部分，在结合成分的协助下，可进入靶细胞，发挥其毒性活性作用，决定毒素的致病特点及作用方式。所有细菌外毒素在其C末端附近都有一个胱氨酸，并具有酶的活性；结合成分的N末端氨基酸排列顺序极其相似。
各种细菌外毒素在敏感细胞中的靶点各不相同，毒素进入细胞靶点的方式包括三方面：①毒素经由毒素-受体复合物形成的通道进入膜内；②毒素与受体特异性结合，启动跨膜信号而激活细胞内信号系统；③通过细胞吞饮作用直接进入细胞。一般认为，细菌外毒素对靶细胞的毒素效应不尽相同，至少可分为肠毒素、细胞毒素、溶细胞毒素和神经毒素4类。不同类型外毒素的作用机制均有一定的特异性，如PEA属于细胞毒素，它可催化辅酶Ⅰ（NAD ＋ ）水解为二磷酸腺苷（ADP）核糖基和烟酰胺两个部分，使延长因子-Ⅱ发生ADP核糖基片，抑制肽-tRNA及mRNA的移位，造成蛋白质合成障碍而导致细胞功能异常甚至破坏。
细菌外毒素进入细胞绝大多数都是由细胞膜上的受体介导的，细菌外毒素与糖苷脂结合，通过吞饮作用（endocytosis）进入细胞。
铜绿假单胞菌含有与致病有关的物质达十余种，目前公认，铜绿假单胞菌外毒素A（PEA）是最重要的致死性物质。现已基本搞清PEA的结构及功能。
PEA为单链蛋白质，相对分子质量66 000左右，最大吸收波长280nm，等电点5.0。PEA由A、B两个片段组成，A为活性片段，是ADP-核糖基转移酶；B为结合片段，链内有4对二硫键，无游离巯基，对热不稳定。经晶体衍射图分析，PEA分子由613个氨基酸组成，分成3个功能结构区。第Ⅰ、Ⅱ区位于氨基端，属结合片段，与易感细胞表面受体结合。第Ⅲ区有ADP-核糖基转移酶活性，是活性部分。PEA毒性作用主要通过受体介导的内化实现，但它也可不依赖于受体的“液相吞饮”而进入细胞。
PEA毒性很强，对多种哺乳动物及人细胞都有毒性。临床分离的铜绿假单胞菌菌株90%以上产生这种外毒素，其致死活性远远高于细菌内毒素。动物实验及临床观察证实多种外科感染与此毒素有关，它是铜绿假单胞菌感染中的重要致病因子。据报道，用提纯的PEA给小鼠注射后，可出现局部组织坏死、肝细胞肿胀和脂肪变性、肺出血及肾坏死等，其改变与烧伤小鼠感染产PEA的铜绿假单胞菌后病理损害相似。许多实验观察表明，PEA作用后肝、脾、肾、肺等器官中延伸因子-Ⅱ活性均降低，以肝表现最为明显。同样，PEA可以抑制各器官的蛋白合成，其中肝抑制最重。示踪研究发现PEA的靶器官主要是肝，其次是肺及肾。PEA还可引起未烧伤组织的坏疽性深脓疮（ecthyma gangrenosa）。除直接组织损害作用外，PEA对机体的免疫系统亦有重要调节效应。一方面它可以抑制抗体的产生，对T、B淋巴细胞产生细胞毒效应；另一方面它又是淋巴细胞较弱的促分裂原，在一定程度上可以促进免疫反应。
铜绿假单胞菌作为一种条件致病菌，常可使免疫功能低下的患者发生严重的或致命性脓毒症。虽然其发病与多种菌体成分和分泌产物有关，现已明确铜绿假单胞菌产生的PEA毒性最强，是最重要的致病因子之一。临床资料提示，PEA可引起人体中性粒细胞减少，出现酸中毒、低血压或脓毒性休克，并有明显的致死作用。据报道，PEA对人体外周血中单核细胞可产生显著的细胞毒效应。当分离的细胞与PEA共同作用一小时即可抑制细胞对同位素标记胸腺核苷的摄取，并破坏其吞噬能力，还可能出现细胞形态学异常改变，表明PEA对机体组织细胞具有广泛的毒性作用及损伤效应，它可能在严重铜绿假单胞菌感染诱发脓毒症、脓毒性休克过程中具有一定的意义。
PEA体外检测方法较多，常用有以下几种。
（1）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）：杨理邦等建立BA-ELISA法，并引入BA系统，只需制备一种特异性PEA抗血清就可检测。本法可用于临床，具有一定推广使用价值。
（2）ADP-核糖基转移酶活性测定：用Collier法测定ADP - 核糖基转移酶的活力，是一种较准确的检测法。
（3）血凝抑制试验：血凝抑制试验为PEA检测的常用方法之一，其敏感性比ELISA低。
（4）细胞毒试验：选用小鼠L 929 细胞做细胞毒试验，可测定少量外毒素，方法可靠。
PEA的免疫方法较多，一般可以分成两种方式。
（1）主动免疫：PEA可制成类毒素，用来免疫动物及人。用于小鼠，其保护率达50%～80%。每周注射一次类毒素，3周以后体内特异性抗体（主要为IgM及一部分IgG）水平升高，用其超免血浆可治疗铜绿假单胞菌脓毒症。此外，类毒素中含的溶血素及卵磷脂酶还可以提高其免疫效果。铜绿假单胞菌分成许多血清型，与致病有关的物质有多种，因此，制备一种含有几种主要致病物质的混合疫苗进行防治很有必要。Cryz将PEA与菌体O-多糖制成复合物疫苗，在健康者中显示良好的免疫效果。Homma使用多成分铜绿假单胞菌菌苗及PEA类毒素免疫接种，明显降低烧伤患者铜绿假单胞菌脓毒症的病死率。
（2）被动免疫：经研究证实，被动免疫可以对PEA攻击动物起到保护作用。产生的抗体与PEA的B亚单位结合，使PEA失去与细胞受体结合的可能，从而起到免疫治疗作用。Galloway研制出抗PEA的单克隆抗体，用于烧伤感染大鼠，可延长其存活时间。应用PEA抗毒素治疗，虽能中和菌体外毒素但菌体仍存活，因此，联合应用抗内、外毒素的抗体效果会更好，这样既中和外毒素又起到调理作用，促进吞噬细胞功能，杀死菌体。
不同铜绿假单胞菌菌株产生的PEA存在着结构上的差异，因此，制备通用型的免疫制剂仍有一定困难，有待于今后解决。
临床流行病学资料表明，革兰阳性菌脓毒症的发病率逐年上升，究其原因，可能与以下因素有关：①大量抗菌药物治疗主要是针对革兰阴性菌，从而使得革兰阳性致病菌感染机会增多；②长时间血管内导管的应用越来越多；③手术移植物的广泛应用（如人造关节、瓣膜、血管等）；④革兰阳性菌感染病原菌的变迁；⑤抗菌药物耐药性在革兰阳性致病菌中的播散［如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐青霉素肺炎链球菌、耐万古霉素粪肠球菌］。流行病学资料显示，革兰阳性菌感染中金葡菌发病率位居首位，是严重烧（创）伤创面感染等危重症的重要病原菌。据保加利亚一烧伤中心的资料证实，无论是烧伤创面还是血标本中金葡菌检出率均居首位（分别为31.4%和35.0%），且MRSA耐药率逐年增高。上海瑞金医院从159例烧伤患者创面分离获得菌株601株，其中金葡菌最多见（271株，45.1%），MRSA耐药率高达79.1%。上海长海医院分析95例烧伤合并血源性感染时发现，金葡菌占29.2%，是导致全身性感染的重要病原菌。
金葡菌可以产生多种外毒素，主要包括中毒性休克综合征毒素、肠毒素、溶血毒素和红疹毒素等，它们作用于体内多种组织和脏器，诱发一系列病理生理异常改变。
中毒性休克综合征（TSS）系由金葡菌感染后引起的严重多系统疾病，其临床特征为急性高热、皮疹、呕吐、腹泻、低血压及多器官损害等。Todd等首先报道了TSS病例，并进行了有关临床与生化方面的研究。TSS不仅在年轻月经期妇女中发生，而且非月经期的妇女、男性及儿童也可发病。自20世纪80年代以来的文献报道中，在烧伤、皮肤移植、外科手术发生感染后也能并发TSS。现已明确，TSST-1与TSS发病密切相关，是引起TSS的最主要致病因子。
TSST-1是一种多肽蛋白质，大部分由金葡菌噬菌体Ⅰ群产生，相对分子质量约22 000，含有194个氨基酸残基。氨基酸序列分析显示，TSST-1氨基酸序列与相关毒素如金葡菌B、C型肠毒素及链球菌致热性外毒素A几乎没有同源性序列。血清学分析证实，携带有产TSST-1葡萄球菌的人群中仅5%发病，多数人仍健康。TSST-1的抗体随年龄而增加，30%的2岁儿童开始出现毒素抗体，20岁以上抗体滴度上升较快，97%的40岁以上成人抗体滴度大于1∶100，表明多数健康成人都接触过产生TSST-1的菌群，并对其产生了免疫力。据报道，TSS菌株产生TSST-1显著高于非TSS菌株，且产TSST-1葡萄球菌与TSS的发病之间存在显著相关性。
烧伤TSS多出现在伤后l周内，多发生于烧伤4%～40%TBSA的患者，且在创面覆盖包扎后发病。覆盖包扎物的类型不定，有纱布、异种（猪）皮或同种异体皮等。包扎用的敷料及覆盖物极像一个葡萄球菌的培养基。烧伤TSS患者大多数发生于10岁以下儿童。烧伤TSS患者TSST-1的检出率占60%，剩余TSST-1阴性患者很可能体内有其他毒性物质。有资料证实，除TSST-1以外，其他细菌或金葡菌产物也可引起TSS。此后，有学者发现一例烧伤面积12%的儿童，因葡萄球菌肠毒素B引起TSS；另有报道，烧伤后β-溶血性A族链球菌亦可引起TSS。
TSST-1具有广泛的生物学活性，主要包括致热性、增加宿主对内毒素的敏感性、免疫抑制、降低网状内皮系统清除功能、有丝分裂原性等。①致热性：TSST-1可直接诱导发热反应，发热程度与毒素剂量呈正相关，并且因给药途径不同而有所差异。目前认为，TSST-1一方面可透过血脑屏障直接作用于下丘脑引起发热；另一方面它还能够刺激单核细胞产生IL-1等内源性致热物质而间接起作用。②提高宿主对内毒素的敏感性：TSST-1可显著提高宿主及细胞对内毒素攻击的敏感性，与内毒素发生致死性协同效应，这是该毒素最重要的特性之一。健康家兔单独接受TSST-1仅表现为发热反应，即使剂量高达100µg/kg亦不能产生致死效应，提示该毒素本身致死性作用并不强。但如果同时给予较低剂量的内毒素与TSST-1，动物即可出现典型的TSS症状和体征，表现为呼吸、循环、肝、肾及消化道等多系统器官功能严重障碍，导致动物死亡。与之相似，对感染巴斯德菌的动物再进行TSST-1攻击也可产生较强的内毒素增敏作用。体外试验亦证明，TSST-1预处理大鼠肾小管细胞，能明显提高细胞对内毒素的敏感性。③免疫抑制：有资料表明，培养物中含有低剂量TSST-1即可抑制鼠IgM抗体对绵羊细胞的补体结合应答反应，纳克水平毒素则可显著抑制免疫球蛋白的合成，且内毒素可加重这一反应。一般认为，上述作用系TSST-1特异性地结合到T淋巴细胞上，尤其是促进Ts细胞被激活所致。④降低网状内皮系统清除能力：静脉注射TSST-1和内毒素能明显降低家兔网状内皮系统清除胶质的能力，并可能抑制宿主对内源性内毒素等物质的吞噬、清除，进而造成内毒素的蓄积，增强机体对TSST-1的敏感性。⑤有丝分裂性：采用［ 3 H］-胸腺嘧啶掺入DNA的方法证明TSST-1为一种非特异性促有丝分裂原，可以刺激T淋巴细胞增殖，但对B细胞作用甚微。其作用机制可能为毒素诱导单核-巨噬细胞产生IL-1，并进一步刺激T细胞合成IL-2，从而促使T淋巴细胞的分化增殖。⑥其他作用：TSST-1在体外能结合单核细胞、内皮细胞等，刺激它们产生多种内源性炎症介质，如TNF-α、IL-1等。此外，该毒素还可以抑制白细胞的趋化性、介导延迟皮肤超敏反应等。
大量研究表明，TSST-1是TSS的重要细菌致病性产物，且流行病学、微生物和动物模型的研究有力地证明它在TSS发病中的重要地位。例如，给家兔和狒狒注射提纯的TSST-1能引起与人类TSS相同的症状，生化指标改变及形态学损害亦与临床患者TSS相似，主要表现为发热、低血压及全身多个器官（心、肝、肺、肾、胃肠道等）的广泛损害。采用抗TSST-1抗体被动免疫的动物对产TSST-1金葡菌的致死性有较强的防护作用。临床资料证实，从典型患者分离的金葡菌绝大多数可检出TSST-1，且TSS常发生于血清中缺乏特异性抗毒素抗体的人群，进一步说明该毒素在TSS发病中的意义。但需要强调的是，TSST-1并非引起TSS的唯一毒素，TSS全部症状和体征可能系多种毒素共同作用的结果，其中许多重要方面由细菌内毒素所介导。此外，其他毒素如金葡菌肠毒素A、B等亦可诱发TSS样脓毒症和全身多脏器损害。有人发现，给动物连续皮下注射肠毒素A，能引起发热、充血、MODS甚至死亡，且这一反应比注射TSST-1要强数倍。因此，TSS是一种多因子作用的并发症，除TSST-1以外，其他细菌或金葡菌产物均可以引起该综合征。
由于金葡菌致病因素复杂、耐药性不断增强，特别是中介型抗万古霉素金葡菌的出现，金葡菌感染所致脓毒症及MODS的防治已成为现代烧伤外科和危重病医学面临的棘手难题之一。我们调查了近8年间从创面分离病原菌的分布情况，其中金葡菌分离率从1995年的17.7%（居第3位）上升为1999年的29.3%（居第1位）、2003年的44.4%，并呈现进一步升高的趋势。此外，278例次静脉内置管的严重烧伤患者，7例次发生导管脓毒症（5例死亡），其分离病原菌中金葡菌占50%以上。由此可见，金葡菌是烧伤感染中最常见的菌种之一，其中MRSA耐药性强，易引起脓毒症和MODS等致死性并发症。
细菌学研究表明，可溶性外毒素的产生是革兰阳性菌感染的重要标志之一，其中金葡菌肠毒素因其“超抗原”特性以及在中毒性休克综合征、MODS发病中的特殊意义而备受关注。业已明确，金葡菌的肠毒素和TSST-1均属“超抗原”毒素，具有强大的抗原刺激能力，T淋巴细胞为其主要的靶细胞。与普通抗原不同，肠毒素和TSST-1与主要组织相容性复合物Ⅱ类分子（MHC Ⅱ）结合的部位在抗原结合槽以外的区域，因此可不经加工直接与T淋巴细胞抗原受体的β链Ⅴ区（TCR Ⅴ β）结合。由于TCR Ⅴ β区核苷酸序列非常保守，同一个体内的许多T细胞可具有相同的Ⅴβ成分，因此单一的超抗原极低浓度（1～10ng/mL）即可激活大量T淋巴细胞（可达全部T细胞的5%～10%，甚至40%）（图6-2）。而活化的T细胞可释放TNF-α、IFN-γ等细胞因子，最终导致脓毒症甚至脓毒性休克的发生。
图6-2 普通抗原与超抗原活化T淋巴细胞比较
流行病学调查显示，从笔者医院烧伤患者及医务人员手和鼻腔中分离131株金葡菌中，获产毒株120株，产毒率高达91.6%（表6-8），而且以同时产生多种类型毒素者居多［同时产肠毒素B、C（SEB、SEC）者最为常见］，其中90%以上为耐药菌株（表6-9）。另检测100株金葡菌肠毒素产生情况，结果表明总产毒率为68%。其中60株MRSA全部产一种或一种以上肠毒素，而40株非MRSA产毒率仅为20%。上述结果初步提示，产肠毒素金葡菌普遍存在于烧伤患者的创面、呼吸道，且MRSA较非MRSA有更强的毒力和致病性，对烧伤后并发金葡菌感染构成潜在的威胁。
表6-8 131株金葡菌肠毒素产生率
表6-9 医院分离的12株产两型肠毒素金葡菌的分布
迄今为止，关于金葡菌肠毒素在脓毒症及MODS发病中的变化特点及其作用机制尚缺乏足够的了解。导致这一领域进展缓慢的原因之一是缺乏敏感、快速的金葡菌感染检测手段。目前临床上常规的细菌培养与鉴定方法只能说明是否为金葡菌感染，而金葡菌产毒试验也仅是观察细菌在体外的产毒情况，并不能反映其在体内的生物活性及致病特点，且该方法耗时较长，致使金葡菌感染的早期诊断非常困难，误诊的情况时有发生。因此，建立敏感、快速的金葡菌肠毒素检测方法用来直接监测外毒素在体内的变化特点，将有助于金葡菌感染所致脓毒症及MODS的早期识别与诊断，并可望对金葡菌肠毒素发病机制和临床意义的认识获得新进展。
我们率先采用改良双单抗夹心BA-ELISA方法检测动物血浆及组织匀浆中SEB水平，利用单克隆抗体的特异性和生物素-亲和素系统的放大原理，使该方法的检测灵敏度显著升高，可达0.078µg/L，检测范围为0.078～20.0µg/L，血浆中SEB的回收率为88.7%～106.2%。建立该方法为进一步研究SEB在体内的生物学效应奠定了技术基础。为此，我们采用大鼠20%TBSA Ⅲ度烫伤合并金葡菌攻击所致严重脓毒症模型，探讨了SEB在脓毒症和多器官功能损害中的变化规律及致病机制。结果显示，烧伤后金葡菌感染动物血浆SEB水平迅速升高，并于6h达峰值，其后迅速下降，但至24h仍明显高于伤前值；而心、肝、肺、肾等组织中SEB含量持续上升，其中24h升高幅度最为明显。与其他组织相比，金葡菌严重脓毒症时肝、肾组织中SEB含量明显高于其他脏器，表明肝、肾可能是SEB蓄积的主要场所。由于SEB可经肾小球自由滤过，并被近端小管细胞完全重吸收，因此肾在肠毒素清除中的作用可能尤为重要。给家兔静脉注射标记的肠毒素后，循环中肠毒素迅速清除，并分布到肝、肾、肺、脾等组织，其中肾含量最高，进一步证实肾是肠毒素蓄积和排泄的最重要场所之一。值得说明的是，烫伤合并金葡菌感染可导致动物局部组织内毒素水平亦明显升高，且动物心、肝、肺、肾组织中内毒素水平与血浆SEB含量呈明显正相关，提示金葡菌攻击组织内毒素的升高与SEB的毒性作用有关。而采用抗SEB单抗进行干预后不仅小肠黏膜的损伤程度有所减轻，组织中内毒素水平亦有不同程度的降低。由此可见，SEB的毒性作用可加剧小肠黏膜屏障功能受损、肠道通透性增加，进而肠源性内毒素移位并蓄积于局部组织。
研究表明，SEB作为“超抗原”具有很强的丝裂原性，极低浓度即可致T细胞大量活化、促炎细胞因子产生显著增加，对金葡菌脓毒症和MODS的病理生理过程可能具有重要的促进作用。我们的资料证实，SEB对家兔肝等多个器官的功能具有直接损害效应。为了探讨SEB在烧伤脓毒症所致MODS中的作用，我们选取心、肝、肺、肾、肠等重要器官，分析了SEB与器官功能改变的关系。结果显示，单纯烧伤打击后24h，动物心、肝、肺、肾功能明显异常，但反映小肠黏膜完整性的小肠组织二胺氧化酶活性无明显改变。烧伤合并金葡菌攻击后动物肝、肾和心功能损害进一步加剧，肺组织中性粒细胞聚集明显增加；同时，小肠组织二胺氧化酶活性呈持续下降趋势，提示小肠黏膜的完整性亦严重受损。病理形态学检查证实，烧伤后金葡菌感染动物心、肝、肺、肾、肠等组织均可见不同程度的炎细胞浸润和坏死性病变，其中肺改变尤为显著。进一步分析发现，早期给予抗SEB单克隆抗体可有效降低血浆及组织中SEB水平，同时肝、肾、心功能指标不同程度降低，小肠组织二胺氧化酶活性基本恢复至伤前范围。值得注意的是，抗SEB单克隆抗体干预组动物早期病死率明显降低。上述结果表明，随着组织中SEB含量的降低，动物相应器官功能和预后亦在一定程度上得以改善，从而证实了SEB在MODS中具有重要作用。由此可见，烧伤合并金葡菌攻击造成动物多器官功能的损害进一步恶化，其改变与脏器组织中SEB含量持续升高密切相关。
业已明确，T淋巴细胞的大量活化是肠毒素所致脓毒症与MODS的重要特征之一。而IFN-γ是活化T淋巴细胞产生的一种强有力的免疫调节因子，在调节单核-巨噬细胞和内皮细胞功能方面作用显著，故推测它在金葡菌脓毒症及MODS的病理生理过程中可能具有重要意义。我们的实验结果显示，烧伤合并金葡菌攻击后0.5h，肝、肺等组织中IFN-γ mRNA表达明显增强，至24h仍处于较高水平。与之相似，伤后组织和血浆中IFN-γ含量亦迅速升高。相关分析表明，肺组织IFN-γ水平与肺SEB的含量呈显著正相关，但内毒素的改变与之无相关性。同时，早期给予抗SEB单克隆抗体可显著抑制血浆及肺组织中IFN-γ的产生，从而证实SEB可能参与了IFN-γ的诱生过程。上述结果表明，烧伤后金葡菌攻击可导致不同组织中IFN-γ基因及蛋白质表达广泛上调，其改变与组织SEB的直接刺激作用有关。进一步分析可见，烧伤后金葡菌感染动物肝、肺、肾组织中IFN-γ含量与相应脏器中TNF-α浓度呈高度正相关，同时肺IFN-γ含量与局部组织中NO水平亦呈正相关关系。表明IFN-γ可通过上调TNF-α和NO等介质的诱生在金葡菌感染所致MODS中具有促进作用，抗SEB单克隆抗体干预对动物脏器功能的保护效应与其在一定程度上抑制IFN-γ的产生有关。
以往研究提示，IFN-γ作为重要的免疫调节因子在细菌感染过程中对机体具有保护和损害的双重作用。Zhao等利用IFN-γ受体缺陷小鼠实验证实，在金葡菌感染所致脓毒症早期，IFN-γ可通过激活巨噬细胞和中性粒细胞、增强其杀菌活性对机体产生保护效应。但在金葡菌感染的晚期，由于IFN-γ诱导了巨噬细胞内TNF-α、IL-6等炎症介质的大量合成与释放，其对机体的损害作用则更为突出。此外，IFN-γ还可上调巨噬细胞等抗原呈递细胞表面的MHC Ⅱ分子表达，从而对金葡菌肠毒素和TSST-1诱导的T细胞依赖性休克具有重要的促进作用（图6-3）。据报道，在SEB攻击的小鼠体内IFN-γ水平明显升高，并与NO的过度产生密切相关。利用抗IFN-γ特异性抗体进行早期拮抗可有效抑制NO的产生，同时动物病死率亦明显降低，进一步证实了IFN-γ对机体的损伤效应。我们的实验结果亦显示，烫伤合并金葡菌攻击后动物肝、肺、肾组织中IFN-γ水平与相应脏器中TNF-α的浓度呈高度正相关，同时肺IFN-γ水平与肺组织中生物蝶呤和NO水平亦呈显著正相关，表明IFN-γ可能通过上调TNF-α和NO等炎症介质的产生参与金葡菌脓毒症的病理生理过程。
图6-3 IFN-γ作为重要的免疫调节因子在金葡菌感染过程中对机体的保护和损害双重作用
在上述工作的基础上，我们进一步探讨了烫伤后金葡菌脓毒症时相关信号通路的活化机制及交会作用（cross-talk）。实验采用大鼠20%TBSA Ⅲ度烫伤合并金葡菌攻击所致脓毒症模型，观察Janus激酶／信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）信号通路在革兰阳性菌脓毒症病理过程中的活化情况，并着重探讨抑制该通路对金葡菌脓毒症发生、发展的影响，同时观察抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子（NF）-κB信号通路对JAK2/STAT3信号通路活化的影响，用以了解脓毒症时信号通路的交互作用。实验结果证实：①烫伤合并金葡菌攻击后，组织中多种细胞因子的基因与蛋白表达明显升高，其改变与血清ALT、AST、Cr、BUN等器官功能指标相关。提示金葡菌脓毒症时局部组织致炎／抗炎细胞因子的大量生成可能在一定程度上参与了动物多器官功能损害的病理过程。②烫伤后金葡菌攻击早期动物肝、肺、肾等组织中STAT3迅速活化，其改变可能与金葡菌SEB的直接刺激作用密切相关。③早期注射JAK2激酶特异性抑制剂AG490和STAT3磷酸化抑制剂雷帕霉素（rapamycin, RPM），动物肝、肺、肾组织中STAT3的活化均不同程度地减轻，局部组织中细胞因子基因及其蛋白表达均有不同程度地降低，肝功能指标有所改善。说明直接抑制JAK2/STAT3的活化能减轻脓毒症动物局部组织的炎症反应，进而对机体多脏器功能具有一定的保护作用。④金葡菌脓毒症时抑制NF-κB信号通路，能在一定程度上抑制JAK/STAT通路的活化，说明金葡菌脓毒症时NF-κB与JAK/STAT通路间可能存在着交会作用，而核转录因子STAT可能是信号通路网络中一个重要交会点。应用MAPK抑制剂AG126早期干预未能抑制STAT3的活化，提示在金葡菌脓毒症时动物体内MAPK通路与STAT3交互作用可能较弱。
在JAK/STAT通路的激活机制较为明确后，其反馈调控机制进一步成为研究的热点。目前已发现有多种机制参与了对JAK/STAT途径的调控，特别引人注目的是近年来发现一族被称为细胞信号转导抑制因子（suppressors of cytokine signaling, SOCS）的蛋白质，它们作为JAK/STAT的特异性内源抑制物参与了对JAK/STAT信号传递的“负反馈”调节过程，在维持机体免疫自稳中可能发挥了重要作用。我们的实验结果显示，严重腹腔感染所致脓毒症动物肝、肾、肺等重要生命器官SOCS1和SOCS3的基因表达均明显上调，分别于术后6h达峰值，并且这一改变与细菌毒素及其介导的TNF-α等炎症介质刺激作用密切相关。这些资料均提示，内毒素可能参与了体内SOCSs的诱生过程。另一组实验中，我们采用大鼠烫伤合并金葡菌攻击致脓毒症模型，进一步探讨脓毒症大鼠体内SOCS基因表达的改变及其与细胞因子“消涨”之间的相互关系。结果显示，烫伤合并金葡菌感染后，大鼠肝、肺组织IFN-γ生成均显著增加，同时，动物肺组织SOCS1、SOCS2和SOCS3的基因表达明显上调，其中SOCS2和SOCS3 mRNA表达改变较为迅速，伤后0.5h即明显高于对照组；与之相比，肝组织SOCS1 mRNA表达的改变较为缓慢（伤后2h才明显高于对照组），但24h仍维持于较高水平。金葡菌肠毒素B单克隆抗体早期干预后，随着肺IFN-γ生成的减少，肺组织SOCS1、SOCS2和SOCS3的基因表达亦明显降低。结果表明，烫伤后金葡菌感染可诱导体内SOCS表达上调，其改变与IFN-γ等细胞因子的“消涨”密切相关，提示它们可能参与了金葡菌脓毒症时体内免疫炎症反应平衡的调控过程。
由此可见，在金葡菌感染诱发脓毒症和MODS病理过程中，肠毒素、内毒素及其介导的细胞因子在信号转导水平相互调节、相互促进，可能是协同效应的发生机制之一。值得指出的是，SOCS不仅是JAK/STAT途径的有效抑制因子，而且还可在一定程度上抑制MAPK、激活蛋白（AP）-1和活化T细胞核因子（NF-AT）等激酶及核因子的活化，说明由JAK/STAT诱导生成的SOCS还可能参与了对其他信号转导途径的调控过程。由此可见，SOCS不仅对JAK/STAT途径具有“负反馈”抑制作用，还有可能是多条信号转导通路的“负反馈交会点”（negative cross-talk）。因此，深入探讨JAK/STAT途径在体内的生物学效应及其与SOCS相互作用可能会为脓毒症的防治提供新的线索。
总之，鉴于烧（创）伤后并发金葡菌脓毒症的严重性和复杂性，很有必要加强其发病机制和防治新措施的研究，特别应当重视金葡菌外毒素的作用及其临床意义的探讨，进一步弄清金葡菌外毒素的变化规律、组织分布特点、协同效应及其与脓毒症和多器官损害的关系，对其诱发失控炎症反应和免疫功能异常的分子机制进行深入的研究，从而为烧（创）伤后金葡菌感染所致脓毒症及MODS的防治奠定基础。
溶血毒素（staphylolysin）是一种外毒素，不耐热，经电泳分析分为α、β、γ及δ4种，其中以α-毒素为主。α-毒素对哺乳动物及人的红细胞有溶血作用，可损伤血小板；也能使平滑肌痉挛，小血管收缩，造成局部缺血和坏死，为此损伤创面在α-毒素作用下，肉芽组织可发生坏死，因而使表浅创面逐渐加深。
金葡菌红疹毒素由噬菌体Ⅱ群的金葡菌产生，儿童易感染该毒素，引起正常皮肤出现猩红热样皮疹。由于大部分金葡菌都含有该毒素，并且儿童体内又缺少相应的抗体，所以发病率较高。
烧（创）伤后造成感染的病原菌种类繁多，产生外毒素的细菌达十多种，除铜绿假单胞菌及金葡菌最多见外，也可有其他产生外毒素的细菌，例如破伤风杆菌及A族链球菌。烧伤后合并破伤风时有报道，目前因烧伤后常规预防注射破伤风抗毒素，故破伤风的发病率已经非常低了。
A族链球菌的许多菌株在体内、外均可产生链球菌致热外毒素（streptococcal pyrogenic exotoxin，SPE），其产生与A族链球菌携带温和噬菌体有关。SPE根据血清学检验可分为A、B、C 3个不同的型。研究表明，SPE-A与金葡菌肠毒素B、C等基因序列具有同源性，因而这些毒素分子可能有相似的活性位点结构。
目前认为化脓性链球菌和金葡菌毒素均属于细菌性超抗原，其显著的生物学特征是能非特异性地活化T细胞增殖，并促进其释放TNF-α、IFN-γ、IL-2等细胞因子。超抗原除可激活T细胞外，还可诱导T细胞的耐受，从而导致人体免疫调节的紊乱，提高机体对感染的易感性。由于极微量的超抗原就可以非特异性激活大量T细胞，因而微小的病灶即可以引起过量的细胞因子产生，进一步造成机体明显的多系统损害。
前面提及的TSS也是一种与超抗原密切相关的感染性疾病。近年来，又报道了一种链球菌感染引起的毒性休克样综合征（toxic shock-like syndrome，TSLS），其表现与TSS相似，主要特征为低血压及多器官损伤。有关研究显示，TSLS链球菌大多数能产生SPE-A、SPE-B，小部分能产生SPE-C，这样有一种或多种链球菌超抗原与TSLS发病相关，而且SPE-B与链球菌蛋白酶致病作用有关，推测可能是造成机体广泛组织损伤的重要原因之一。另据报道，25例A群链球菌感染者出现TSLS占44%。免疫印迹分析证实分离的菌株产生链球菌SPE-A、SPE-B、SPE-F等，且不同临床征象的患者分离出的菌株产生的毒素数量无明显差异。TSLS患者血清中TNF-α、IL-6水平分别比无咽-扁桃体炎对照组、菌血症但未并发休克者显著升高，说明链球菌感染后至少有3种超抗原参与TSLS的发病过程，其机制可能与超抗原激发过量细胞因子产生有关。
SPE诱发链球菌感染及脓毒症的确切机制尚不甚清楚，许多人认为与其超抗原特性有关，即SPE可通过与T细胞的相互作用，导致过量细胞因子的释放与宿主的损伤，在临床上表现为脓毒症、休克甚至MODS。此外，SPE广泛的生物学活性及其致病作用在诱发脓毒并发症中具有重要意义，包括致热性、增强宿主对内毒素及链球菌溶血毒素O的敏感性、细胞毒性及多种组织损害、增加血脑屏障和血管通透性、抑制网状内皮系统的吞噬和清除功能等。
TSST-1的某些单克隆抗体可保护动物免受TSST-1引起的肝、肾功能损害，大幅度降低动物病死率。目前，肠毒素和TSST-1的抗血清及多种针对TCR和MHCⅡ分子的单克隆抗体已相继问世，可有效阻断T细胞的活化，促进抗体介导的毒素快速清除（图6-4）。
图6-4 肠毒素和TSST-1特异性抗体对金葡菌感染的干预途径
MHC Ⅱ分子为肠毒素和TSST-1诱导T细胞活化、增殖的重要辅助因子，因此阻断肠毒素、TSST-1与MHC Ⅱ分子的结合有可能成为金葡菌脓毒症免疫防治的有效手段之一。体外试验表明，单一的MHC Ⅱ分子的单克隆抗体即可有效阻断各种肠毒素诱导T淋巴细胞活化的生物学效应。
SR31747A为一种新型的免疫调节剂，与淋巴细胞和单核-巨噬细胞表面的σ受体具有高度亲和力。该复合物与细胞表面的σ受体结合后可刺激淋巴细胞和单核-巨噬细胞合成与释放抗炎细胞因子IL-10，从而有效抑制SEB诱导的淋巴细胞增殖反应。同时，其还能抑制IL-2、IL-4和TNF-α等炎症介质的合成与释放。
机体的一些内源性细胞因子也能够抑制金葡菌诱导的T细胞增殖反应，在一定程度上防止致死性休克的发生。有人利用脓毒性休克小鼠模型发现，SEB攻击前18h给小鼠腹腔注射抗IL-6抗体，可使动物病死率由55%升至90%；而用IL-6或IL-11预处理则可使病死率显著降低50%左右，且这种保护作用呈剂量依赖性。另据报道，IL-12对SEB诱导的致死性休克具有明显的保护作用。此外，CD28基因缺陷小鼠可完全耐受TSST-1引起的致死性中毒性休克综合征，该种小鼠经TSST-1刺激后不能产生TNF-α，而IFN-γ的产生亦下降90%左右。
（姚咏明 李红云 盛志勇）