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红斑肢痛症是一种常染色体显性遗传病，其特征是热刺激或中度运动时产生烧灼痛。我们描述了一个红斑肢痛症家族中 SCN9A （编码Na V 1.7的基因）的新突变。Na V 1.7产生阈值电流，并在感觉神经元上（包括损伤感受器在内）选择性高表达。我们论证了这种突变使得通道激活趋于超极化，使稳态失活趋于去极化，降低了背根神经节（DRG）神经元的单次动作电位发放和高频放电的阈值。本研究表明，红斑肢痛症是第一种被证明与离子通道功能异常和损伤性神经元放电改变有关的遗传性疼痛病。
已知钠通道在获得性疼痛疾病相关的DRG神经元超兴奋性中发挥作用，但它在遗传性疼痛综合征中的作用尚不清楚。遗传性红斑肢痛症（也称为遗传性红痛病）是一种常染色体显性遗传的痛性神经病变，其特征包括由温热刺激或中度运动引起的四肢灼烧痛。最近有研究人员报道，在遗传性红斑肢痛症患者中发现了编码Na V 1.7钠通道的基因 SCN9A 的两个突变。Na V 1.7通道优先在DRG损伤性感受神经元和交感神经节神经元中富集表达，并在静息电位附近产生“阈值电流”，对发生器电位等小的去极化刺激进行放大，而其他钠通道亚型介导DRG神经元全或无动作电位的大部分电流。我们之前的研究描述的Na V 1.7突变导致通道激活向超极化偏移了13～15 mV，去激活变慢，并增加了通道对小的斜坡去极化刺激的响应。在本研究中，我们研究了Na V 1.7中的第3个突变，该突变与遗传性红斑肢痛症家族的疾病表型分离。我们描述了该突变对通道功能的影响，并首次表明人的钠通道突变可以降低DRG神经元的单次动作电位发放和高频放电的阈值。
在耶鲁大学医学院人类调查委员会批准的一项研究中，一名神经学家在获得患者知情同意后，根据正式的临床标准对17名受影响的受试者、5名未受影响的受试者和3名未受影响的配偶进行了单盲的基因研究，证实该疾病表型。已有研究报道了该家族部分成员的临床表现和与染色体2q31-q32的连锁关系，但之前并没有进行详细的遗传学分析。
从25个家族成员（17个受影响；8个未受影响）的口腔拭子或静脉血中提取纯化基因组DNA。人类多样性对照基因（25名男性，25名女性；白种人）从科里尔研究所（新泽西州卡姆登）获得。利用 SCN9A 的基因组序列（GenBank accession no. NC_000002）设计内含子特异性引物，对Na V 1.7 cDNA的编码和非编码外显子进行扩增。将基因组序列与Na V 1.7 cDNA进行比较，以确定序列变异。在耶鲁大学霍华德休斯医学院/凯克生物技术中心进行测序。使用BLAST（美国国立医学图书馆）和Lasergene（DNAStar，威斯康星州麦迪逊）进行序列分析。
携带TTX-R版本的人Na V 1.7 cDNA（hNa V 1.7R）质粒构建方法见先前的描述。利用QuickChange XL定点突变技术将F1449V突变引入hNa V 1.7R。野生型或F1449V突变型hNa V 1.7R通道与人类β1和β2亚基（Lossin，et al.，2002）共转染到HEK293细胞中，在标准培养条件（5% CO 2 ，37 ℃）下，在含10%胎牛血清的DMEM中通过磷酸钙沉淀生长。
在室温（～21 ℃）下，转染40～72小时后，使用EPC-10放大器和Pulse 8.5（HEKA，德国）和0.8～1.5 MΩ电极[接入电阻（1.6±0.3）MΩ]进行全细胞膜片钳记录。采用80%串联电阻补偿和线性漏减法减小电压误差；采用计算机控制电路消除电容伪影。细胞封接3.5 min后开始记录。电极内液成分：140 mmol/L CsF、1 mmol/L EGTA、10 mmol/L NaCl和10 mmol/L HEPES（pH 7.3）。细胞浴液为140 mmol/L NaCl、3 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl 2 、1 mmol/L CaCl 2 和10 mmol/L HEPES（pH 7.3）。数据分析使用Pulsefit（HEKA）和Origin（Microcal，马萨诸塞州北安普敦）软件。
对野生型C57/BL6小鼠的DRG进行处理以获得神经元，随后用于钠通道和绿色荧光蛋白（GFP）的电转染实验（Amaxa Inc，马里兰州盖瑟斯堡；见Brain Online上的在线补充材料）。转染16～24小时后进行电流钳记录。使用Axopatch 200B放大器，在室温（～21 ℃）下进行转染野生型hNa V 1.7R-GFP或F1449V-GFP后具有高GFP荧光信号的小直径DRG神经元（＜30 μm）的全细胞电流钳记录。将电阻为1～2.5 MΩ的微量移液管充满140 mmol/L KCl、0.5 mmol/L EGTA、5 mmol/L HEPES、3 mmol/L Mg-ATP和3 mmol/L Na-GTP溶液，pH7.3，用葡萄糖调节至315 mOsml/L。外部溶液含有140 mmol/L NaCl，3 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl 2 ，2 mmol/L CaCl 2 ，10 mmol/L HEPES，pH7.3，用葡萄糖调节至320 mOsm/L。在形成密封之前，移液管电位被调整为零；液体连接电位未被校正。在切换到电流钳模式之前，电容瞬变被取消，串联电阻（3～6 MΩ）补偿至70%。使用Clampex 8.1软件从稳定静息电位小于-40 mV的细胞中采集记录道，在5 kHz下过滤，在20 kHz下采样。当需要时，施加稳定的极化电流以设置-60 mV的钳制电位。
该家族谱系包含36个成员（图1）；对16名具有红斑肢痛症表型的受试者（平均年龄37岁，范围3～75岁）进行了临床评估（10名女性，6名男性）。平均发病年龄3岁，4例在婴儿期发病，6岁时全部发病。所有受试者都有典型的红斑肢痛症症状，包括有灼烧痛和红斑发作，发病部位包括手（正反面）和脚（一直到或略靠近脚踝）。10名受试者（63%）报告还涉及其他部位，包括面部、耳朵、肘部和膝盖；1名受试者报告涉及阴道区域。11人（69%）报告每天一次或多次发病；3人（19%）报告每月多次发病。除1名受试者外的所有受试者（94%）都报告说，发病是由热引发的，并被冷改善。但是有1名受试者报告说，极端寒冷也会引起发病。
图1 家族谱系
圆形表示女性，方形表示男性，箭头处表示先证者，黑色表示红斑肢痛症患者。+表示携带有T4393G突变体杂合，-表示没有携带突变体
从先证者和对照受试者的静脉血样本中分离得到基因组DNA，以此作为模板来扩增 SCN9A 已知的所有外显子，并将其序列与Na V 1.7 cDNA进行比对。先证者和对照受试者的模板产生相似的扩增子，并进行纯化和测序。序列分析确定了外显子23（E23）中的T转变为G，对应于参考序列的位置4393（见补充材料）。该突变导致多肽链第1449处的苯丙氨酸（F）被缬氨酸（V）替代，此位点位于连接结构域Ⅲ和Ⅳ的胞外环3的N末端。在所有已知的哺乳动物钠通道中，F1449位点都是高度保守的（图2）。限制性内切酶消化分析（见补充材料）证实，17个患病个体全部存在F1449V突变，而5个未患病的家庭成员、3个未患病的配偶以及100个种族匹配的对照染色体中并不存在F1449V突变。所有家族成员的与疾病相关的T4393G突变由外显子E23的DNA测序所证实。
图2 F1449（箭头处）位于L3（结构域Ⅲ和结构域Ⅳ的连接环），在所有已知的钠通道中高度保守
下划线标注了Na V 1.1到Na V 1.9结构域3的第6个跨膜片段和L3的N末端，包含了F1449V的突变（Na V 1.7m）。星号表示V1293的位点，在骨骼肌疾病先天性副肌强直患者，该位点突变成异亮氨酸。快失活三肽（IFM）也用下划线标出。
野生型hNa V 1.7R和F1449V突变型通道与β1和β2亚基一起在HEK293细胞中瞬时共表达（图3A）。在HEK293细胞上，Na V 1.7表现出的生物物理特性与其在DRG神经元上表现出来的相类似。我们使用从-100 mV的去极化测试脉冲检查通道激活的电压依赖性。突变通道的激活电位比野生型通道低5～10 mV（图3B）。与野生型通道[（-15.2±1.3）mV， n =11； P ＜0.05]相比，突变型通道F1449V的半激活电压（通过与Boltzmann函数拟合估算）显著地偏移到（-22.8±1.3）mV（ n =12），这比先前描述的Na V 1.7突变体的偏移幅度小一些。用Hodgkin-Huxley函数拟合估算的激活时程，在野生型[τ=（482±25）μs]和F1449V突变型通道[τ=（431±17）μs]中没有显著差异。短暂激活通道（于-20 mV刺激0.5 μs）后，通过在不同电位激发尾电流来研究去激活动力学。结果发现，F1449V突变型通道在-100～-40 mV电位范围内的去激活没有改变（图3C），而先前描述的Na V 1.7突变体的去激活变慢。
图3 hNa V 1.7的F1449V突变改变了通道的激活，而对去激活无影响
A：在表达野生型（左）或F1449V突变型通道（右）hNa V 1.7的HEK293细胞上记录的代表性电流轨迹。钳制电位为-100 mV，电流由50 ms，-80～+40 mV的测试脉冲记录。B：经标准化处理的野生型（实心方块； n =11）或F1449V突变型（空心圆； n =12）hNa V 1.7峰电流-电压关系曲线。C：野生型（实心方块； n =8）或F1449V突变型（空心圆； n =7）hNa V 1.7在-40～-100 mV复极化电压下尾电流去激活的时间常数。时间常数通过单指数方程对电流去激活进行拟合得到。误差线代表标准误。
F1449V突变型通道的稳态快失活略微趋于去极化（图4A）。野生型通道（ n =16）使用500 ms预脉冲测量的V 1/2 分别为（-71.3±0.8）mV，而F1449V突变型通道（ n =16； P ＜0.05）为（-67.0±1.4）mV。F1449V突变型通道的稳态慢失活的电压依赖性趋于超极化（图4B）。
在（-50～+40）mV的整个电压范围内，F1449V突变型通道的开放态失活的时间常数小于野生型电流（图4C）。在-10 mV时，野生型通道电流的失活的时间常数为τ=1.4±0.1 ms（ n =7），F1449V突变型通道电流的失活时间常数为τ=（1.0±0.2）ms（ n =8）。在-80、-70和-60 mV时，F1449V突变型通道的关闭态失活的时间常数明显更小（ P ＜0.05），表明其关闭态失活更快（图4D）。F1449V突变型通道的复活（从快失活中恢复）明显快于野生型通道（ P ＜0.05；图5A）。在-70 mV时，野生型通道的复活时间常数（τ=89±14 ms， n =8）比F1449V突变型通道（τ=27±2 ms， n =8）大3倍。
图4 hNa V 1.7的F1449V突变对通道快失活和慢失活的不同影响
A：野生型（实心方块； n =13）或F1449V突变型（空心圆； n =14）hNa V 1.7的稳态失活的比较。在500 ms去极化预刺激之后，用0 mV激发电流。野生型（实心方块）或F1449V突变型（空心圆）hNa V 1.7激活的电压依赖性。使用Boltzmann 方程对图3数据进行拟合得到。B：hNa V 1.7野生型（实心方块； n =4）或F1449V突变型通道（空心圆； n =4）的稳态慢失活比较。慢失活由30 s的预刺激产生，随后使用100 ms，-120 mV的脉冲使得快失活恢复，再用20 ms，0 mV的测试脉冲用来检测残余电流。C：野生型（实心方块； n =7）或F1449V突变型（空心圆； n =8）hNa V 1.7的快失活动力学。电流激发方式如图3A所示，使用单指数方程拟合衰减相来计算失活时间常数。D：野生型（实心方块； n =6）或F1449V突变型（空心圆； n =9）hNa V 1.7的关闭态失活发展的时间常数。细胞钳制于-100 mV，用-90～-50 mV的失活电位预刺激，增加刺激时程，再使用0 mV的测试脉冲检测预刺激后的残余电流，由单指数方程拟合时间曲线获得关闭态失活发展的时间常数。F1449V突变型通道的关闭态失活发展的时间常数比野生型更快。
对于-100～+20 mV的慢（0.2 mV/ms）去极化下诱发的斜坡电流，F1449V突变型通道[（0.4%±0.1%； n =7）]和野生型通道（0.4%±0.1%； n =12）之间没有显著差异（图5B）。相反，与野生型通道相比，红斑肢痛症相关的I848T和L858H 突变引起hNa V 1.7的斜坡电流明显更大。
图5 F1449V突变型通道从失活态复活的动力学比野生型通道快
A：野生型（实心方块； n =8）或F1449V突变型（空心圆； n =8）hNa V 1.7从失活态复活的时间常数与电压的关系。通过20 ms，+20 mV预刺激失活所有电流，然后使用复活电位（-140～-60 mV），并不断地增加复活时程，再用0 mV的测试脉冲测试。时间曲线经单指数函数拟合后，得到时间常数。最大的脉冲频率是0.5 Hz。B：野生型或F1449V突变型hNa V 1.7通道的代表性斜坡电流轨迹。斜坡电流由500 ms，从-100～0 mV的斜坡去极化激发。先前的研究发现，I848T突变型通道的斜坡电流幅度增加，而F1449V突变型通道并非如此。
由于电压依赖性的改变可以降低动作电位的发放阈值，我们在小直径（＜30 μm）DRG神经元中（其中包括伤害感受器）表达野生型或F1449V突变型通道。转染F1449V（-51.3±1.6 mV； n =19）突变型通道和野生型通道（-49.0±1.3 mV； n =16）的DRG神经元的静息电位相类似（ P ＞0.05）。为了消除细胞之间的差异，细胞被钳制在-60 mV。
Na V 1.7在DRG神经元电信号发生的早期很重要。Na V 1.7能够产生梯度去极化，这可能会增加阈下输入，从而使DRG神经元达到Na V 1.8的激活阈值（Na V 1.8的激活阈值更高些），进而使Na V 1.8开放并爆发全或无的动作电位。图6A、B和E显示了F1449V突变对神经元放电阈值的影响。图6A显示了表达野生型hNa V 1.7的DRG神经元放电的代表性轨迹。采用50～65 pA注射电流诱发阈下反应，使细胞产生轻微去极化，但不会使膜电位达到-19 mV（一旦达到将触发动作电位的发放）。全或无动作电位的产生需要大于130 pA的刺激（此即该神经元的电流阈值）。相比之下，图6B显示了表达F1449V的一个DRG神经元的代表性反应，其在较低的电流阈值（60 pA）下就能产生动作电位。与野生型通道（124.1±7.4 pA； n =16）相比，F1449V突变型通道的电流阈值（产生全或无动作电位所需的电流）（93.1±12.0 pA； n =19， P ＜0.05）显著降低（图6E）。然而，发放全或无动作电位的起始电压在表达野生型（-21.4±0.9 mV； n =16）或F1449V突变型通道（-22.5±1.4 mV； n =19）的细胞中，并没有显著差异（ P ＞0.5）。
约50%未经任何处理的小直径DRG神经元，在持续刺激下会重复放电。与之相似，大多数表达野生型Na V 1.7（16个神经元中有11个；69%）或F1449V突变型通道（19个神经元中有12个；63%）的神经元可以产生重复放电（图6C和D）。图6C显示了一个表达野生型通道的代表性神经元的放电情况，该神经元在950 ms，150 pA的刺激下产生了2个动作电位。相比之下，相同的150 pA的去极化刺激诱发表达F1449V突变型通道的神经元的高频放电（图6D）。100 pA电流诱发表达野生型通道神经元的放电频率为1.24±0.58 Hz（ n =11），而表达F1449V突变型通道的神经元的放电频率显著增加到5.34±1.21 Hz（ n =12； P ＜0.01）。在表达野生型和F1449V突变型通道的神经元注射150 pA电流诱发的放电频率分别为3.03±0.75 Hz（ n =9）和6.48±1.41 Hz（ n =12； P ＜0.05）（图6F）。因此，表达F1449V突变型通道的细胞除了发放动作电位的电流阈值较低，其在不同刺激强度下的放电频率也较高。
图6 将F1449V突变型通道表达于小直径DRG神经元上，使动作电位产生和重复放电的电流阈值降低
通过注入去极化电流激发动作电位，细胞膜电位钳制于-60 mV。A：表达野生型Na V 1.7的细胞对50～65 pA注入电流的阈下反应和由130 pA（该细胞的电流阈值）和155 pA注入电流产生的全或无动作电位的代表性轨迹。B：相比之下，表达F1449V突变型通道的细胞注入60 pA可以激发动作电位，表明其电流阈值更低。A和B中，神经元发放全或无的动作电位起始的电压（虚线处）并无差异。C和D在同一个刺激强度下，表达F1449V突变型通道的细胞动作电位的发放频率高于表达野生型通道的细胞。C：表达野生型hNa V 1.7的神经元（与A图为同一个神经元）在150 pA，950 ms刺激下发放2个动作电位。而表达F1449V突变型通道的神经元（与B图为同一个神经元）在同样的刺激下，激发了高频放电。E：与表达野生型Na V 1.7的细胞（ n =16）相比，表达F1449V突变型通道的细胞（ n =19）表现出显著降低的电流阈值（* P ＜0.05）。F：与表达野生型Na V 1.7的细胞（ n =11，9）相比，在100 pA或150 pA电流刺激下，表达F1449V突变型通道的细胞（ n =12）的发放频率显著增加（* P ＜0.05；** P ＜0.01）。
本研究阐明了在患有遗传性红斑肢痛症家族中，钠通道Na V 1.7的基因发生了突变（1449位的苯丙氨酸被缬氨酸替换，即F1449V）。这一单个氨基酸残基的替换改变了hNa V 1.7的生物生理学特性，降低了DRG神经元放电和高频放电的阈值。F1449位于结构域Ⅲ和结构域Ⅳ之间的胞内连接环L3上，L3有11个氨基酸残基，其N-末端连接到快失活门IFM（异亮氨酸-苯丙氨酸-蛋氨酸）基序上。F1449V突变导致通道激活的电压依赖性产生约8 mV的超极化偏移，小于先前描述的红斑肢痛症hNa V 1.7突变体I848T和L858H发生的13～15 mV的偏移。F1449V突变也会在快失活产生约4 mV的去极化偏移，可能会增加近静息电位的可激活通道的比例。F1449V突变型通道的激活和稳态失活之间的重叠增加，也可能增强窗口电流。这些变化都可能降低表达突变型通道的DRG伤害性感受神经元的发放阈值。电流钳记录显示，表达突变型通道的DRG神经元对梯度刺激的单次动作电位发放和高频放电的阈值较低。
F1449V突变也改变了hNa V 1.7通道的一些性质，增强的慢失活和加快的关闭态失活的速率可能会降低细胞的兴奋性。由于更慢的关闭态失活可产生更大的斜坡电流，F1449V突变可能会使斜坡电流减小。确实，红斑肢痛症相关的突变I848T和L858H会显著增加hNa V 1.7的斜坡电流，与之不同的是，F1449V突变型通道与野生型相比，其斜坡电流并无变化。
在已知的所有钠通道亚型中，结构域Ⅲ/S6和Ⅲ-Ⅳ的连接序列是高度保守的。该区域对通道的快失活至关重要，也和其他的与细胞兴奋性相关的遗传性疾病相关。与强直性肌病有关的骨骼肌钠通道（Na V 1.4）的某些突变位点，恰好就位于上述区域内。与hNa V 1.7的V1444的位置相对应（距离F1449的N端方向5个氨基酸残基），Na V 1.4 的V1293I的突变导致了有轻微症状差异的先天性副肌强直。hNa V 1.4中V1293I突变的功能改变与hNa V 1.7中F1449V突变的功能改变相类似。即两种突变均使通道激活向超极化方向移动，使通道失活向去极化方向移动，并加速通道失活后的复活进程。在肌肉兴奋性的模式中，V1293I的替代突变降低了动作电位产生的阈值并导致肌强直，而激活曲线偏移-6 mV是导致这种兴奋性增强的主要因素。然而，由Na V 1.4-V1293I突变产生的肌强直通常是由寒冷引发，而在大多数F1449V突变的红痛病患者中，降温反而可以减轻疼痛。
电流钳记录显示，在表达突变F1449V突变型通道的DRG神经元中，单个动作电位发放的电流阈值较低，对梯度刺激诱发的放电频率也较高。因此，尽管与先前描述的Na V 1.7的突变体相比，F1449V突变型通道表现出相对较小的激活电位偏移、未延长的去激活以及未增强的斜坡电流。F1449V的替代突变仍使DRG神经元产生功能获得性改变，与家族性红斑肌痛症为常染色体显性遗传相一致，并且我们发现患病的家庭成员是基因突变的杂合子。然而，电压记录中的拐点，即全或无动作电位的上升的起始电压（大约-20 mV），在表达野生型和F1449V通道的神经元中基本上是相同的。这可能反映了Na V 1.7作为“阈值通道”的作用，即它在更为超极化的电位下激活，从而将小的、慢的、低于动作电位阈值的去极化输入进行放大。事实上，DRG神经元动作电位的上升相的大部分钠电流由Na V 1.8所介导，而Na V 1.8的激活阈值接近于-20 mV。
本研究的结果表明，遗传性疼痛综合征（特指遗传性红斑肢痛症）中，钠通道的突变可以降低感觉神经元的放电阈值，并产生异常的重复放电。之前有两个研究发现，利多卡因和美西律治疗可以部分缓解红斑肢痛症患者的疼痛。另有一项针对4名患者的研究报道称，口服美西律治疗对疼痛的缓解至少可持续2年。本文对钠通道突变的鉴定及其在红斑肢痛症的病理生理学中的作用的研究结果，提示合理运用钠通道阻断剂对治疗遗传性红斑肢痛症可能有效。
我们要感谢R. Blackman、S. Liu和X. Peng，他们提供了卓越的技术支持，还要感谢参与此项研究的家庭成员。这项工作得到了退伍军人事务部医学研究处和康复研究处的支持，并得到了国家多发性硬化学会、红痛病协会、美国瘫痪退伍军人和联合脊柱协会的资助。F.M.H.获得了Paul Beeson医师学者奖（美国老龄研究联合会）的支持。T.R.C.得到了印第安纳大学医学院的生物医学研究资助。
Sulayman D. Dib-Hajj：耶鲁大学医学院神经病学系与神经科学与再生研究中心，纽黑文，康涅狄格州；康涅狄格州医疗系统退伍军人管理局，康复研究中心，西黑文，康涅狄格州
Anthony M. Rush：耶鲁大学医学院神经病学系与神经科学与再生研究中心，纽黑文，康涅狄格州；康涅狄格州医疗系统退伍军人管理局，康复研究中心，西黑文，康涅狄格州
Theodore R. Cummins：印第安纳大学医学院药理学和毒理学系，斯塔克神经科学研究所，印第安纳波利斯，印第安纳州
F. M. Hisama：耶鲁大学医学院神经病学系，纽黑文
S. Novella：耶鲁大学医学院神经病学系，纽黑文
L. Tyrrell：耶鲁大学医学院神经病学系与神经科学与再生研究中心，纽黑文，康涅狄格州；康涅狄格州医疗系统退伍军人管理局，康复研究中心，西黑文，康涅狄格州
L. Marshall：耶鲁大学医学院神经病学系，纽黑文
Stephen G. Waxman：耶鲁大学医学院神经病学系与神经科学与再生研究中心，纽黑文，康涅狄格州；康涅狄格州医疗系统退伍军人管理局，康复研究中心，西黑文，康涅狄格州
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