遗传性痛性神经病变相关的Na _V 1.7突变型钠通道的电生理学特征

Theodore R. Cummins，Sulayman D. Dib-Hajj，Stephen G. Waxman

摘要

红斑肢痛症是一种显性遗传的痛性神经病变，其特征是皮肤发红和四肢有间歇性的灼烧感。尽管该病发生的生理基础还不为人知，但是近期在遗传性红斑肢痛症患者身上鉴定出Na _V 1.7的2种突变体。Na _V 1.7是一种主要表达于背根神经节（DRG）和交感神经节神经元上的钠通道，产生河鲀毒素敏感（TTX-S）的快失活电流。Na _V 1.7倾向于表达在小直径DRG上，其中的大部分神经元都是损伤性感受神经元。Na _V 1.7的特点是从失活态复活和关闭态失活都较慢，这使得它们对小的、阈下去极化刺激相对敏感。在本研究中，我们的研究结果显示了这些Na _V 1.7突变型通道的激活趋于超极化和缓慢去激活。我们的研究结果也显示了这些突变型Na _V 1.7对慢的、小的去极化刺激激发的电流幅度增加。这些观察第一次说明钠通道功能的改变与遗传性痛性神经病变相关，并提示这些赋予了初级感觉神经元和交感神经元超兴奋性的生理改变，导致了遗传性红斑肢痛症症状的产生。

背景

位于DRG的感觉神经元表达多种电压门控钠通道的亚型，包括Na _V 1.7、Na _V 1.8及Na _V 1.9，这些钠通道对于调控神经元兴奋性非常重要。Na _V 1.7选择性地表达于DRG和交感神经节，并在小直径DRG神经元中富集表达，这些神经元包括损伤性感受神经元。体外表达的Na _V 1.7会产生一种快失活的TTX-S电流，这一电流呈现缓慢复活和缓慢关闭态失活的特征，这一特性又使通道可以对小而慢的去极化产生反应。

现在我们已经非常清楚地知道，钠通道亚型的基因表达失调（如Na _V 1.3）会导致DRG感觉神经元中钠电流的改变，并引起神经病理性疼痛。最近，有研究显示，角叉菜胶诱导大鼠足底炎症后，Na _V 1.7在DRG神经元上的表达上调。Na _V 1.7的动态调节特性提示，该通道在导致炎症痛的神经元超兴奋性中起到了作用。

与钠通道的表达失调相比，至今还没有钠通道突变导致疼痛的报道。家族性遗传性红斑肢痛症是一种罕见的遗传性痛性神经病变，该病症的主要症状是灼烧痛和四肢发红。Layer（2001）提出了一个假说，即敏化的C纤维和轴突反射导致了这些症状的发生。人类2号染色体上有一段富含钠通道基因的DNA片段，该片段被认为与遗传性红斑肢痛症相关。随后，Yang等2004年的研究显示，Na _V 1.7上2个独立的突变与遗传性红斑肢痛症的发病有关，这两个替换突变分别是Na _V 1.7通道848位的异亮氨酸替换成苏氨酸（I848T）以及858位的亮氨酸替换成组氨酸（L858H）。

在本研究中，我们研究了I848T和L858H突变对hNa _V 1.7生理特性的影响，这两个突变都导致了突变体通道半激活电压趋于超极化，同时伴随更大的斜坡电流。我们的数据与Na _V 1.7在红斑肢痛症相关DRG神经元超兴奋性中Na _V 1.7的作用相吻合。

材料与方法

质粒

如先前描述的那样，我们构建了携带有人类Na _V 1.7 cDNA的质粒。Na _V 1.7上TTX-S的关键残基色氨酸突变成丝氨酸，使得该通道对TTX变得不敏感（Na _V 1.7 _R ）。使用Quick Change XL site-directed mutagenesis Kit，根据公司建议设计的两对突变引物，将I848T和L858H突变位点分别引入Na _V 1.7 _R 。

转染

使用磷酸钙沉淀法，将hNa _V 1.7通道和人类β1、β2亚基共转染人胚肾细胞（HEK293）。HEK293细胞使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在标准组织培养环境里培养（5%二氧化碳，37 ℃）。将磷酸钙和DNA的混合物加入细胞培养液中，持续孵育3小时，随后用新鲜培养基洗涤。在转染后的40～72小时记录钠电流。

全细胞膜片钳记录

在室温（约21 ℃）条件下，均采用EPC-10放大器和Pulse程序（v8.5；HEKA Elektronik，Lambrecht/Pfalz，德国）进行全细胞膜片钳记录。使用Sutter Instruments P-97拉制仪（诺瓦托，加利福尼亚）将1.7 mm VWR Scientific毛细玻璃管（西彻斯特，宾夕法尼亚）拉制成抛光电极，电极平均电阻为（1.4±0.4）MΩ（均数±标准； n =85）。串联电阻补偿80%以减小电压误差，用计算机控制的膜片钳放大器电路补偿电容伪迹。所有膜片钳记录均使用线性漏减，全细胞条件建立后3 min开始记录，膜电流滤波频率为5 kHz，采样频率为20 kHz。电极内液成分（单位：mmol/L）为140 CsF、1 EGTA、10 NaCl和10 HEPES，配制成pH值为7.3的溶液。标准浴液成分（单位：mmol/L）为140 NaCl、3 KCl、1 MgCl ₂ 、1 CaCl ₂ 和10 HEPES，配制成pH为7.3的溶液。使用Pulsefit（HEKA Elektronik）和Origin（Microcal Softwart，北安普敦，马萨诸塞）进行数据分析，使用Shapiro-Wkiks检验评估统计数据集是否正态分布。

如无特别说明，我们均使用非配对 t 检验计算统计学差异（ P ＜0.05），结果以均数±标准误的形式表示，图上的误差线代表标准误。

结果

将野生型（WT）hNa _V 1.7 _R 和I848T、L858H两个突变通道与hβ1、hβ2亚基瞬时共同转染HEK293细胞。图1A展示了具有代表性的全细胞电流，表达WT（318±43 pA/pF， n =29）和I848T（350±37 pA/pF， n =27）的细胞峰电流密度没有差异，而表达L858H（174±30 pA/pF， n =27）的细胞电流密度显著减小。我们使用一系列从-100 mV开始阶跃式刺激的去极化方波测试脉冲，来检测通道激活的电压依赖性，与WT通道相比，突变通道的激活电位向超极化方向偏移了10～15 mV（图1B）。与WT电流[（-24.6±1.1）mV， n =29]相比突变通道I848T和L858H电流的半激活电位（用玻尔兹曼方程拟合数据估算）向超极化方向显著偏移I848T为（-38.4±1.0）mV， n= 27；L858H为（-37.9±0.9）mV， n =27。尽管I848T和L858H突变型通道的半激活电压没有差异，但L858H的激活阈值比I848T更低，低约5 mV。

去激活动力学反映了WT通道和突变型通道从开放态到关闭态的变化，可以通过短暂激活通道后（-20 mV，0.5 ms）引出的尾电流来检测。骨骼肌钠通道去激活的改变是先天性副肌强直（paramyotonia congenita）的病理生理学基础。I848T和L858H电流表现出了更慢的去激活动力学（图1C）。突变通道去激活的时间常数（用单指数函数拟合得到）在-100～-40 mV的电压范围内都表现得更慢。有趣的是，在所有去激活电位测试中，L858H比I848T突变体去激活的效应更大。举例来说，在-50 mV电位下，I848T和L858H的去激活时间常数相较WT通道分别增加了大约3倍和10倍（图1D）。

快失活时间常数可以衡量通道的开放态与失活变化，可以使用 m ³ h Hodgkin-Huxley方程拟合电流数据估算。在-40～-20 mV电压范围内，突变体通道的快失活时间常数比WT通道更小（图2A）。然而，在更加去极化的电位下，这些通道的时间常数并没有差异。

与激活电压依赖性的巨大差异相比，WT和I848T、L858H的稳态快失活电压依赖性之间没有差异（图2B）。WT和突变体通道的半快失活电位（通过500 ms预脉冲测定）没有显著差异[WT：（-73.6±1.1）mV， n =20；I848T：（-75.8±1.1）mV， n =19；L858H：（-76.1±1.2）mV， n =17]。在超极化电位处（-120～-80 mV之间），L858H通道的稳态快失活曲线偏离于其他通道，这可能是由于慢失活的差异引起的。

高钾性周期性瘫痪（hyperkalemic periodic paralysis）与骨骼肌钠通道的慢失活缺陷有关，因此，我们检测了hNa _V 1.7稳态慢失活的电压依赖性。使用30秒预刺激，随后给予-120 mV的复活脉冲100 ms，使得通道快失活被复活，之后使用20 ms、0 mV的测试脉冲来测定可激发电流的部分。我们观察到WT、I848T、L858H电流的慢失活特性存在明显差异（图2C）。令人惊讶的是，L858H突变大大增强了hNa _V 1.7的慢失活，这种慢失活的增强可能是L858H通道电流在稳态快失活方案下超极化电位处失活增强的原因（图2B）。相反，I848T突变使hNa _V 1.7的慢失活受损。在0 mV，仅有（67±6）%的I848T通道处于慢失活状态（ n =8）（由图2C中可激发电流的部分测得），相比之下，野生型通道（ n =8）和L858H通道（ n =7）分别有（84±4）%和超过（97±2）%的通道处于慢失活状态。对于两个突变体通道，其在0 mV处于慢失活状态的比例与野生型相比差异显著。因此，从红斑肢痛症患者鉴定出的这两个Na _V 1.7突变体对hNa _V 1.7的慢失活具有不同的影响。

最后，我们对使用缓慢的斜坡去极化刺激激发的hNa _V 1.7电流进行了检测。与野生型通道相比，缓慢的斜坡去极化刺激（0.2 mV/ms，-100～+20 mV）在I848T和L858H通道明显激发出了更大的电流。I848T通道、L858H通道和野生型通道的斜坡电流（表现为其占峰电流的比例）分别是（1.8±0.2）%（ n =19）、（2.6±0.3）%（ n =16）和（0.6±0.1）%（ n =16）。表达I848T和L858H通道的细胞斜坡电流出现在-70～-40 mV之间（图3），因此其有助于阈下去极化和动作电位。

讨论

膜电位去极化时，细胞膜上的钠离子通透性增强，从而引起动作电位的发生，这是由电压门控钠离子通道所介导的。尽管钠通道表达失调促进神经病理性疼痛的病理生理过程，但直到Yang等人鉴定出红斑肢痛症患者Na _V 1.7的两个突变体之前，人们并没有把引起人类和动物一系列疾病的钠通道α亚基突变体与痛性神经病变联系起来。在本研究中，我们鉴定了这两个Na _V 1.7突变体I848T和L858H的功能改变。I848T和L858H的突变位点位于通道结构域Ⅱ的S4-S5片段之间的连接区域（DⅡ S4-S5）。生物物理学分析结果发现，这两个突变体与野生型hNa _V 1.7相比有一些不同：两种突变都使得通道激活的电压依赖性明显趋于超极化；两种突变使hNa _V 1.7的去激活也显著减慢，其中L858H突变体的去激活减慢更为显著；两种突变也都显著增加了hNa _V 1.7通道在-70～-40 mV之间由慢去极化激发的斜坡电流，而感觉神经元的静息电位就处于-70～-40 mV的范围内。hNa _V 1.7通道功能的这些改变，可能会促进表达hNa _V 1.7的DRG感觉神经元的兴奋性增加，并可能引起遗传性红斑肢痛症患者的异常疼痛。

I848T和L858H突变使hNa _V 1.7激活的电压依赖性向超极化偏移约15 mV，如此幅度的偏移可能会降低感觉神经元发放动作电位的阈值，并引起神经元兴奋性的增加。两种突变也显著减慢了hNa _V 1.7的去激活速率。有假说认为，骨骼肌钠通道（Na _V 1.4）的去激活受损，导致了先天性副肌强直患者肌肉的异常兴奋性（主要表现为肌强直）。许多引起肌强直的Na _V 1.4突变减慢了通道的快失活和去激活的速率，计算机模拟结果显示，这两者同时改变可以引起动作电位复极化后失稳定，从而导致肌强直。与Na _V 1.4的这些突变不同，hNa _V 1.7的I848T和L858H并不改变通道的快失活速率，因此，hNa _V 1.7的此类突变可能不会使得通道的复极化失稳定。

与野生型通道相比，缓慢的斜坡去极化刺激在突变体hNa _V 1.7通道激发的电流显著增大。激活的电压依赖性趋于超极化（图1B），加之失活的电压依赖性并没有发生变化（图2B），由此导致突变体通道失活和激活曲线的重叠部分增加，因而产生更大的斜坡电流。去激活的受损意味着通道从开放态到关闭态转化的改变，也可能增加斜坡电流的幅值。在较低的电位（低于-45 mV）下，通道的关闭速率远大于失活速率，因此，在这些电位范围内，通道的开放更可能是被去激活所终止的，而不是被失活所终止。Vandenberg等人的研究提示，钠通道的去激活速率限制了钠通道在负电位下开放和再次开放的能力。因此，在负电位下，去激活速率的减慢势必增加通道开放的数量和开放的次数，并增加斜坡电流的幅值。事实上，我们的研究与上述假说是相一致的，L858H突变型通道表现出最慢的去激活动力学特性与最大的斜坡电流幅值。因为斜坡电流的激活电位处于-70～-40 mV之间，非常接近于DRG神经元的静息电位，所以表达突变体通道的神经元在很小的去极化刺激下能够诱发出更大的斜坡电流，从而增强了神经元的兴奋性。Na _V 1.7通道主要在小直径的感觉神经元（主要是损伤性感受神经元）上表达，提示了该通道的激活、去激活和斜坡电流幅值的变化，导致了携带I848T和L858H突变体的红斑肢痛症患者的疼痛症状。

hNa _V 1.7和hNa _V 1.4结构域Ⅱ S4-S5连接片段的氨基酸序列是相同的，将所有钠通道进行序列比对发现，这一结构非常保守（数据未显示）。DⅡ S4-S5连接片段的保守性提示，该片段在钠通道的不同亚型中具有相似的功能。红斑肢痛症的I848T突变体与发作性肌无力患者hNa _V 1.4的I693T突变体相对应。高钾性周期性瘫痪是另一种肌肉疾病，特征是发作性无力，导致高钾性周期性瘫痪的是hNa _V 1.4另一种突变体T704M。hNa _V 1.7的L858对应于hNa _V 1.4的L703，紧邻于T704。因此，hNa _V 1.7和hNa _V 1.4的DⅡ S4-S5突变与遗传性神经肌肉疾病有关，这提示了该连接片段决定了钠通道的生物物理特性，包括激活和去激活的电压依赖性等。

先前，研究人员将hNa _V 1.4在HEK293细胞上表达，已经鉴定出I693T和T740M突变造成的通道功能改变，这与I848T突变对hNa _V 1.7功能的影响类似，所有这些突变都使得通道激活的电压依赖性趋于超极化。hNa _V 1.4的突变使得通道持续性电流增加（很有可能是由于激活的电压依赖性趋于超极化，导致窗口电流增加），导致肌肉去极化5～10 mV，使钠通道失活并降低了肌肉激发动作电位的能力，从而引起肌无力症状。I693T和T704M突变也显著抑制hNa _V 1.4的慢失活，这被认为导致了肌无力的症状。然而，I848T的突变抑制了hNa _V 1.7的慢失活，而L858H的突变增强了hNa _V 1.7的慢失活。由于两个突变都与遗传性红斑肢痛症有关，这一差异可以解释为通道的慢失活对该病的病理生理学或许不是特别重要。另一种解释是，由于I848T和L858H突变对通道慢失活影响的差异，会导致遗传性红斑肢痛症患者的症状可能有细微的差异。

考虑到Na _V 1.4的I693T突变体与肌无力有关，那么Na _V 1.7的I848T突变如何与疼痛敏感性增加相关联呢？有一个解释是，成熟的肌肉细胞仅仅表达Na _V 1.4通道，而DRG感觉神经元表达特点各异的各种钠通道亚型。例如，Na _V 1.8通道在许多（并非全部）DRG感觉神经元上高表达，相比于Na _V 1.4和Na _V 1.7等其他钠通道，Na _V 1.8通道的失活电位非常高，并在动作电位的发放中至关重要。如果Na _V 1.7-I848T突变如同与肌无力相关的Na _V 1.4突变一样，使得感觉神经元去极化5～10 mV，Na _V 1.8通道也仍能被激活。结果是，相同幅度的去极化一方面减弱了肌肉产生动作电位的能力，另一方面却能使表达Na _V 1.8的神经元兴奋性增加（因为这些细胞更接近Na _V 1.8电流的激活阈值）。因此，尽管Na _V 1.7和Na _V 1.4中相同位点的突变对通道性质具有相似影响，但是由于DRG感觉神经元表达了多种通道（包括肌肉中不表达的Na _V 1.8），它们可能对细胞兴奋性产生截然不同的作用，进而引起完全不同的神经系统疾病。

与损伤性感受神经元相比，非损伤性感受神经元并不表达Na _V 1.8。因此，Na _V 1.7的突变对损伤性感受神经元和非损伤性感受神经元的兴奋性的影响可能也不同。另外，尽管在HEK293细胞和DRG神经元上表达的Na _V 1.7电流性质相似，但是仍然存在突变型和野生型Na _V 1.7在DRG神经元上受到差异调控的可能性，这也可能导致疾病表型的不同。例如，在我们的研究中，HEK293细胞上共表达了β1和β2亚基，但DRG神经元上还表达了其他β亚基（例如β3亚基），其对通道特性也有影响。Na _V 1.4和Na _V 1.7电流具有不同的特性，β亚基对它们的调节作用也有差别，这也会导致不同的疾病表型。

我们的结果表明，钠通道相似的突变可能引起疾病表型的巨大差异，并暗示这种差异可能归因于DRG神经元上突变型钠通道与其他钠通道亚型（或钠通道亚基）的共表达。

本文提供了第一个hNa _V 1.7突变型通道的电生理特性发生改变的实例，表明钠通道的功能在遗传性疼痛综合征中失调。这暗示，以钠通道为靶点的治疗可能是治疗这种疾病的有效策略。

致谢

这项工作得到了退伍军人事务部医学研究处和康复研究处以及国家多发性硬化学会的部分资助。神经科学与再生研究中心是美国瘫痪退伍军人和耶鲁大学联合脊柱协会的合作项目。Theodore R. Cummins得到了印第安纳大学医学院的生物医学研究的资助。

关于本文作者

Theodore R. Cummins：印第安纳大学医学院药理学和毒理学系，斯塔克神经科学研究所，印第安纳波利斯，印第安纳州

Sulayman D. Dib-Hajj：耶鲁大学医学院神经病学系，神经科学与再生研究中心，纽黑文，康涅狄格州；康涅狄格州医疗系统退伍军人管理局，康复研究中心，西黑文，康涅狄格州

Stephen G. Waxman：耶鲁大学医学院神经病学系，神经科学与再生研究中心，纽黑文，康涅狄格州；康涅狄格州医疗系统退伍军人管理局，康复研究中心，西黑文，康涅狄格州

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