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本节以巢式病例对照研究为例，介绍其在真实世界研究中，用于临床疗效评价时的设计要点。
1．明确研究目的 研究目的是确定设计步骤的出发点，在研究开始之前，必须明确研究的目的，确定研究所要分析的结局（终点事件）、暴露（干预措施）、协变量等。
2．评估数据库 真实世界研究中的巢式病例对照研究可能是基于现有数据库数据的研究，在研究设计前，充分了解数据库有关特点，包括数据库覆盖的人群特征、已有变量、数据质量等，将为研究设计提供重要基础，保证研究的可行性。比如说：①数据库覆盖人群是否可以代表目标人群。②数据库是否包含了疾病诊断信息。③数据库是否有详细的用药信息。④数据库是否包含研究问题所需要的结局指标，结局指标的测量准确性如何。⑤数据库是否已收集重要的潜在混杂因素的测量等。
3．确定研究队列 巢式病例对照研究必须在研究实施之初确定一个合适的人群作为研究队列，它是实施巢式病例对照研究的起点。队列的确定应符合研究目的的要求，研究的目的对于队列的选择具有决定性的作用，例如Chen WL等人（2019年）作的一项关于中草药减少乙型肝炎病毒感染患者急性肝炎加重的巢式病例对照研究，其研究队列选择的2000年～2013年中国台湾健康保险数据库中的新诊断为乙肝病毒感染的患者。
4．筛选目标疾病患者 真实世界研究大部分是基于数据库开展研究，在这种情况下，无法根据公认的诊断标准对患者进行逐一筛选，常根据疾病诊断编码来定义研究对象，但有的病例资料中之所以出现诊断编码，可能是为了后续进行明确该疾病诊断而开出的检查或初步诊断结果，而不是最终的真正诊断。因此，基于数据库筛选研究对象，需要明确符合目标疾病诊断的指示指标，除诊断编码（如ICD-9或ICD-10编码）外，还需要考虑是否需要构建算法，根据多个变量共同定义目标疾病患者，将金标准检查结果、患者其他就诊情况、指示药品处方等多种信息进行综合分析。此外，应对以上算法进行验证，以提高研究对象筛选的准确度。
5．收集资料和生物标本 研究队列确定后，即开始收集队列内每个成员的基础资料（姓名、年龄、性别、民族、职业、文化程度、婚姻史、住址等），相关暴露资料（根据研究目的，如治疗方案、辨证情况、治疗调整情况等），协变量资料（吸烟、饮酒、慢性病史、并发症史、流产史、社会阶层、饮食习惯、生活嗜好、家族史、身高、体重、腰围、臀围、血压、心率、血糖等），以及队列内每个成员的生物标本（血清、白细胞、或其他组织标本等）并妥善保存，以备将来检查所用。
6．确定观察期限 根据研究目的、出现结局的预期时间、干预措施持续的时间，以及人力、物力、财力等综合决定，确定一个最佳随访期限作为队列随访时间。随访的时间不能过长或过短，过短不能收集到足够的病例，过长则浪费人力物力和时间。比如，中医药擅长治疗慢性病，具有疗程长、起效慢的特点，只有将临床研究的随访时间设置得足够充分，才能真实、客观地反映中医药的疗效及安全性。
7．选择终点指标，确定病例组 在观察期间，发生了临床结局的研究对象组成病例组。巢式病例对照研究终点事件的发生是分组的唯一依据，终点指标的选择对于研究中医药干预与疗效的因果关系意义重大，选择不恰当的终点指标甚至会得出与实际截然相反的结论。所以，终点指标的选择，首先要能体现中医药治疗特色，其次选择临床认可程度高、能够切实反映临床疗效、客观性强、时效性和敏感性较高的指标。对于结局的确定需要采用国际或国内通用的标准，并对病例组和对照组使用同一的判断标准。但是，由于在真实世界研究数据中，关于结局的判断不是通过盲法评价等方法来完成的，无法保证所有结局判断的准确性，因此，建议尽量选择客观存在的终点指标，如院内死亡或基于死亡登记数据库确认的死亡，手术治愈率、严重不良反应发生率等。此外，还应关注结局发生时间的合理性。理论上，目标临床结局的发生时间与治疗实施之间应有足够长的时间间隔（与疾病自然进程相比较），如果在治疗实施后的很短时间内即发生结局，此结局可能与治疗无关，如果没有加以区分的话，可能引入新的偏倚。
8．选择对照组 即在数据库中患有该疾病的患者当中选择一定数量的，尚未发生临床结局的病例，按照年龄、性别等影响因素与结局组进行匹配。确定对照有两种方法，一是从研究队列中未发生临床结局的人中间随机抽取，二是在该队列中选择一定数量尚未发生临床结局的人，按年龄、性别等与该病例进行匹配，从而确立对照（该方法称密度抽样或危险集抽样）。绝大多数巢式病例对照研究中都选用后者作匹配对照。采用匹配对照选择时应注意以下几点：①每个病例匹配对照的数量不定，一般为1～5个。②时间匹配是本研究设计最本质的特征。③在某一个时间点上作为对照的成员，在后来的随访中可能会发展为病例，这不影响巢式对照研究的设计和分析步骤。
9．暴露的测量 在疗效评价的巢式病例对照研究中，暴露情况指的是既往的治疗或干预措施。对于暴露的测定没有一种“万能”的方法。每一项干预措施（如药物、手术、患者教育等）都需要一种独特贴切的暴露确定方法。当干预措施是一次性行为时，如手术或者疫苗接种，其测量只需要确定是否暴露及何时暴露。当干预措施要持续一段时间时，如服用药物或某些持续性干预（如健康教育），其测量需要综合考虑剂量、干预频率和持续时间，以确定暴露的强度。有时，对于药物和行为干预，确定暴露水平还需要考虑药物的分发模式或干预所处的环境。
在真实世界研究中，定义是否服用某药物时，研究者需要根据数据库中的药物编码或药品名称，建立算法，将数据库中以不同形式呈现的药物均给予统一编码；同时考虑是否采用多个变量来共同定义研究干预措施。注意分析数据库中体现的药物是否可以覆盖患者可能暴露的所有药物，考虑不同医院或区域来源的患者是否会通过其他渠道获得研究药物。药物暴露时间是指第一次处方后的天数，天数可以通过处方开具的药片数量、再次填写记录的天数，或者所述的每日服用的片剂数量或预设的指标来计算获得。通常，使用真实数据开展研究的研究者需要明确基于日常处方还是直接通过用药指导来推断服药时间，同时收集可以反映剂量相关信息或在规定时间内回收处方总量的变量，包括：持续时间、累计剂量以及是否为新近暴露，即目前用药者、首次用药者、最近用药者、以及之前用药者。接下来，要评估是否存在停药、交换和沾染等行为。一般情况下，如果两次处方行为之间的时间跨度超过处方药物剂量可以满足的时间跨度和干预宽限期时间跨度，会定义为存在停药行为。需要明确的是，基于已有数据库开展观察性研究，无法避免暴露信息的缺失，从而导致错分偏倚。因此，可以设计不同算法来定义暴露，并针对不同的暴露分类进行敏感性分析。
明确暴露定义时，还需要考虑暴露（即干预措施）导致结局事件所需要的诱导期和潜伏期。诱导期指从暴露（即干预措施）发挥作用到出现所关注结局事件之间的时间段。潜伏期指从结局之间发生到结局事件被确定的时间段。在诱导期和潜伏期，额外接触暴露不会影响结局事件发生的风险。在暴露测量中，这两个阶段都需要被考虑并最终排除。由于区分诱导期和潜伏期非常困难，因此，在实际操作中，可以把诱导期和潜伏期视为一个时间段。在诱导期和潜伏期中所使用的任何药物都不应该纳入暴露定义的范围。
10．资料分析方法 巢式病例对照研究中，暴露和结局之间的联系可以用 OR 值和 OR 值的95%可信区间进行估计。此外，由于病例对照研究无法像RCT那样，通过随机化一劳永逸地平衡所有暴露因素（研究者要评价的干预措施）之外的混杂因素（如人口学资料和生活方式等），因此，有必要采用多因素logistic回归方法来校正混杂，结合临床知识，通过将可能的混杂因素纳入模型，可以得到暴露因素调整后的 OR 值。其中，对于匹配的病例对照研究，采用条件Logistic回归分析暴露与结局的关联。