第四节
近红外技术

近红外光是指波长介于可见光区与中红外光区之间的电磁波，其波长范围为0.8~2.5μm，波数范围为12500~4000cm ^-1 （应义斌、韩东海，2005）。

近红外光谱技术是利用有机化学物质在近红外光谱区的光学特性快速测试样品中的一种或多种化学成分含量的技术。近红外光谱属分子振动光谱，是基频分子振动的倍频和组合频，分子中C—H、N—H、O—H和C-O等基团振动频率的合频和倍频的吸收正好落于近红外区，主要反映含氢基团XH（C、S、O、N）的特征信息，因此近红外光谱技术比较适合于分析与这些基团有直接或间接关系的成分。

传统的油酸分析方法需首先采用索氏法制备油脂，进而进行酯化反应，取样量大，操作繁琐，步骤多、耗时长（2~14h）、费用高，难以用于大量育种材料的快速选择。同时，由于取样量大，易损害种子，影响萌发，因此一般用于较晚世代选择。即使采用改进的气相色谱技术（见本章第一节），只切取种子远胚端少量子叶组织用于分析，不影响种子发芽，从取样到分析完成仍需花费1h左右。

相对传统分析方法，近红外光谱学检测技术具有多成分分析、快速（1min之内）、无损、绿色、廉价的优势，特别适用于育种过程中的大规模筛选（禹山林，2010）。花生单粒和多粒子仁脂肪酸含量近红外定量分析模型可提早选择，加速高油酸育种进程（王传堂，2010）。

由于花生种子颗粒较大且不均匀，通常采用消除固体颗粒不均匀性较好的光谱采集技术，即积分球漫反射方式进行光谱扫描（禹山林等，2010）。近红外模型构建与预测的大致程序如下（任东等，2016）。①校正（calibration）：准备足够数量的代表性样品，进行光谱数据采集；扫描后尽快采用标准方法或常规测试方法获得所关心的组成或性质的数据即参考数据（生化成分测定值称为“化学值”）；通过化学计量学方法建立两者间的数学关系（称为模型）。②验证：得到模型后需对模型进行验证，即将取一定数量的同类样品，根据其近红外光谱，调用模型进行预测，并和标准方法或常规测试方法获得的数据加以比较，通过统计学方法对模型进行评估；模型通过验证后就可用于未知样品的测定。③预测过程与模型完善：获取待测样品近红外光谱，将光谱数据输入模型计算预测值；如预测值超出定标模型参考数据范围，可通过标准方法或常规方法测定相关数值，进一步充实模型。

一、花生油酸、亚油酸近红外定量预测模型

（一）花生种子样品

1．利用实验室台式近红外仪检测 印度Misra等（2000）的研究工作初步证实了近红外透射技术用于花生含油量预测的可行性。

澳大利亚Fox和Cruickshank（2005）依托福斯设备（model 6500，Foss NIRSystems，Silver Spring，MD，USA），采用WinISI V 1.04（ISI，Port Matilda，PA，USA）软件，建立了油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸多粒（约75g种子）定量分析模型（表3-2）。校正集样本数为114个，验证集样本数为28个。

美国Tillman等（2006）依托赛默飞世尔（Thermo Fisher）尼高力近红外设备[ThermoNicolet Industrial Solutions（Fitchburg，WI）Nexus 670 FT-IR scanning monochronometer equipped with a NearIR UpDrift Smart Accessory]，利用ThermoNicolet software TQ Analyst version 6.1.1.356软件，建立了单粒花生油酸、亚油酸近红外模型（表3-3、表3-4）。用该模型对43粒油酸含量提高、亚油酸含量降低的花生种子进行分类，误判率为5%。此处所谓油酸含量提高是指GC测定油酸含量≥740g/kg，NIRS预测油酸含量≥700g/kg；亚油酸含量降低指GC测定亚油酸含量≤80g/kg，NIRS预测亚油酸含量≤120g/kg。

山东省花生研究所杂交育种团队依托德国布鲁克公司（Bruker Optics）傅里叶变换近红外光谱仪（MPA）（图3-11）用60~65℃烘干的60份种子样品建立油酸、亚油酸、棕榈酸的多粒花生近红外定量分析模型（表3-5）。实践中发现，尽管该模型是用烘干样构建的，也基本能够满足自然干燥花生种子油酸、亚油酸含量预测要求。

依托德国布鲁克公司Matrix-I近红外仪（图3-12），基于交叉验证（cross-validation）策略，山东省花生研究所分子育种团队建立了自然干燥种子的单粒和多粒花生油酸、亚油酸的近红外定量分析模型（王传堂，2010；张建成等，2011；Wang等，2014）（表3-6、表3-7）。

依托德国布鲁克公司Matrix-I近红外仪，利用987份花生种子，基于检验集检验（cross-validation）策略，山东省花生研究所分子育种团队建立了自然干燥花生种子的单粒脂肪酸近红外定量分析模型（杨传得等，2015）（表3-8）。

美国Sundaram等（2011）依托福斯设备（Model 6500，FOSS NIRSystems，Silver Springs，MD，USA）利用多元分析软件（Unscrambler Version 9.7 CAMO ASA，USA.）构建了多粒花生种子（100~200g）油酸、亚油酸、棕榈酸近红外反射光谱预测模型（表3-9）。反射光谱模型质量优于吸收光谱。

韩国Lee等（2016）采用花生子仁磨碎样品尝试建立7种脂肪酸的多粒近红外定量分析模型，其中油酸、亚油酸模型质量较好（表3-10）。

美国Sundaram等（2010）用为数不多的样品初步建立了花生荚果油酸、亚油酸近红外定量分析模型，认为可用于高油酸花生的初步筛选。

Chamberlin等（2014）用4个市场型23份花生材料374粒种子以气相色谱结果为参照，分析了Tillman等（2006）模型（NIRS-1）和自建模型（NIRS-2）在单粒花生种子油酸、亚油酸含量检测上的可靠性，得出两者判定高油酸类型单粒花生种子的准确率分别为89.4%和97.4%。

河北省农林科学院粮油作物研究所花生团队依托瑞典波通（Perten）公司生产的DA7200型近红外品质分析仪（图3-13），选用239个不同油酸含量的稳定品系成熟干燥种子作为定标样品构建了油酸含量多粒花生种子近红外模型。建模样品油酸含量为32.6%~82.5%，均值为51.6%，变异系数为35.0%。采用偏最小二乘法PLS和主成分回归PCR对经过预处理的光谱进行分析，并以交互验证的RMSEC和所建模型的R ² 为衡量曲线预测效果的主要参数（表3-11），根据马氏距离、主因子分析图及光谱残差图及浓度残差图等分析结果剔除特异样品。最后，分别选择不同的波段，比较各波段的预测效果，从而确定定标类型。在两定标模型预测效果接近状态时，则需根据其对验证样品的分析结果进行最终取舍。选取40个与建模样品无关的样品组成验证样品集，经标准测试，该样品集的油酸含量为32%~82%，均值为70.7%，表明建模样品油酸百分含量信息包含验证样品集的信息。分别对中样品杯和小样品杯的测试模型进行验证（表3-12），油酸含量的标准测试值与近红外光谱预测值存在较好的相关关系，模型预测效果较好。

中国农业科学院油料作物研究所花生育种团队依托Unity-SpectrastarXL近红外检测仪（图3-14）构建了花生油酸、亚油酸和棕榈酸单粒近红外模型（表3-13）（李建国等，2019）。

2．利用便携式近红外仪检测 实验室台式近红外设备价格高，体积大，不便携带运输。利用中国农业科学院农产品加工研究所油料加工与品质调控创新团队研发的近红外模型和便携式高通量花生品质速测仪（图3-15），可直接在田间地头进行花生品质分析。设备配备有花生单粒检测附件和样品杯，可满足育种和原料收购要求。据介绍，一次扫描可同时测定油亚比、水分、油分、蛋白质等多达28个加工特性指标 。

Yu等（2020）报道，依托便携式和实验室近红外仪，采用高油酸和普通花生材料各75份，用偏最小二乘-判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）法构建的高油酸和非高油酸花生判别模型，区分率可高达100%。

（二）花生油样品

山东省花生研究所分子育种团队取高油酸花生油和普通花生油适量混匀，用于花生油油酸、亚油酸含量近红外模型构建和验证（杨军军等，2021）。

建模所用光谱数据在德国布鲁克光谱仪器公司生产的Matrix-I型傅里叶变换近红外光谱仪上采集。使用移液枪将勾兑好的花生油样品分别转移到方形石英比色皿中，每份样品3 ml，加样时避免产生气泡。将比色皿加盖并用胶带封固后横置于近红外光源上，使与比色皿盖下沿齐平的透光面对准光源，不使用原设备的旋转样品杯并取消旋转功能。扫描谱区范围4000~12000cm ^-1 ，扫描次数64次，分辨率为8cm ^-1 ，开机预热30min后检测样品。每份样品需扫描3次，并且第2次和第3次扫描时要将比色皿旋转一定角度，以得到同一样品的多个光谱（杨军军等，2021）。

采用气相色谱法测定花生油样品油酸含量和亚油酸含量化学值，油酸含量最大、最小值分别为80.48%、46.47%，均值为65.93%，变异系数为16.09%；亚油酸含量最大、最小值分别为33.86%、5.57%，均值为16.73%，变异系数为52.24%。符合建模要求。

利用软件自动优化功能，确定花生油油酸、亚油酸含量最佳光谱预处理方法均为“一阶导数+MSC（多元散射校正）”，花生油油酸含量谱区范围为4600~6100cm ^-1 ，维数为7，模型R ² 为96.85，RMSECV为1.93；花生油亚油酸含量谱区范围为4600~6100cm ^-1 ，维数为6，模型R ² 为97.48，RMSECV为1.47。取前述未参与建模的4份花生油样品对建立的花生油油酸、亚油酸近红外模型进行外部验证（杨军军等，2021）。经配对t测验，油酸、亚油酸含量预测值与化学值偏差均较小，油酸偏差为-0.87%~0.23%，t=0.727<t _0.05 =3.182；亚油酸偏差为-0.18%~0.12%，t=0.702<t _0.05 =3.182。差异均不显著，说明模型预测效果较好（杨军军等，2021）。

花生油油酸、亚油酸含量近红外模型可与本团队之前建立的花生仁芥酸（张欣等，2018a）、油酸、亚油酸（Wang等，2014）、维生素E含量（刘婷等，2018）、含油量、蛋白质含量（Wang等，2014），以及花生油过氧化值、酸价模型（张欣等，2018b）一起用于花生原料和花生油产品的质量控制（杨军军等，2021）。

二、实验室台式近红外仪花生样品测量操作程序

（一）布鲁克公司MPA近红外仪

1．测量前准备工作

（1）样品准备：图3-16左图样品测量杯适用于多粒花生种子样品检测，种子要覆盖杯底，达杯身高度2/3处；图3-16右图装置适用于单粒花生种子测量，样品置于光斑上。

（2）仪器准备：启动电脑及近红外扫描仪，近红外扫描仪预热30min后，根据需求安装杯托及盛放样品的测量杯（单粒没有单独的测量杯）。

（3）参数设置：①双击图标 ，输入口令“OPUS”，单击“登录”使软件运行（图3-17）。

②双击图标 进行参数设置，单击“光学设置”，测量通道选择“Sphere Background”、背景测量通道选择“Sphere Background”（图3-18）。

③单击“检查信号”，听到“滋”一声后可见一个红色的“+”图，单击“保存峰位”（图3-19）。

④单击“基本设置”，再单击“测量背景单通道光谱”（图3-20）。

2．样品检测

（1）单击“光学设置”，测量通道选择“Sphere Macrosample Rotating”（多粒）或“Sphere Macrosample”（单粒）（图3-21）。

（2）单击“高级设置”，更改文件名（即样品名）及保存路径（图3-22）。

（3）单击“基本设置”，再单击“测量样品单通道光谱”（图3-23）。

3．数据保存及使用

（1）扫描光谱图均为自动保存，保存在设置的路径下。

（2）数据分析：主要步骤如下。

①单击“评价”下拉菜单中选择“定量2分析/分析列表”，在“方法”子菜单中，单击“调入方法列表”，在弹出的文件夹中选择适合的方法列表（图3-24）。

②在“光谱”子菜单中，单击“添加光谱”，在弹出的文件夹中选择即将要分析的光谱，单击“打开”（图3-25）。

③在“分析结果”子菜单下，单击“分析”，即可获得预测分析数据（图3-26）。

④所得数据拷贝至Excel中保存，可使用U盘将数据导出。

（二）布鲁克公司MATRIX-I近红外仪

1．测量前的准备

（1）对于花生等固体样品，近红外光不能完全穿透样品，多采用漫反射方式进行光谱扫描，选择大小适宜的样品杯（图3-27），将待测颗粒状花生种子装到样品杯2/3高度处，保证上不漏光，准备测量。

（2）启动电脑及近红外仪，安装杯托及样品杯（图3-28）。测量前，需将近红外仪预热3~4h方可测量，预热完毕后，将样品加入样品杯中进行测量。

2．样品检测操作

（1）启动程序：具体操作如下。

①在Windows桌面点击OPUS图标 进入该程序（图3-29）。

②启动程序后弹出用户登录界面，在用户下拉菜单中选择事先定义好的用户记录，输入“口令”后，点击“登录”按钮（图3-30）。

③进入软件操作界面，弹出如下窗口，点击“OK”按钮（图3-31）。

（2）设置测量参数：具体设置步骤如下。

①进入软件操作界面，点击“测量”下拉菜单选项（图3-32），选中“高级测量选项”键 。

②在“基本设置”子窗口，点击“调入”按钮（图3-33）。

③点击“调入”按钮后，依据即将测量的样品选择对应的模型参数进行导入（图3-34）。

④调入后可在“高级设置”中看到各项参数的具体设置，例如：分辨率、扫描时间、光谱范围等。若各参数无法满足要求，可以在该功能界面修改测量参数（图3-35）。

（3）测量：分单株测量和单粒测量。

①单株测量模式：步骤如下。

a．各参数模型调入完成后，进入用户操作界面（图3-36）进行测量。

b．点击 批量化扫描样品图标，弹出如下工作界面（图3-37）。

c．点击测量按钮后，点击开始图标（图3-38）。

d．进入模式选择界面，选择单株或单粒测量模式（图3-39）。

e．编辑测量株系的名称编号，点击测量按钮进行测量（图3-40）。

f．样品一测量完成（图3-41）。

g．若继续测量，则点击OK按钮，进行下一样品的测量。重复步骤e，得到下一样品测量结果。

②单粒测量模式：具体步骤如下。

a．更换单粒样品杯托（图3-42右）。

b．进入选择界面，选择单粒模式并命名样品名称，点击测量按钮进行测量（图3-43）。其他测量步骤同单株测量模式。

3．数据保存及关机 全部样品测量完毕，点击数据保存 按钮，进行数据结果保存（图3-44），然后关闭软件、计算机及近红外仪开关。

（三）波通公司DA7200型近红外仪

1．测量前的准备

（1）使用波通近红外分析仪测量，在装样时尽量少留缝隙，花生仁与测量杯上边缘平齐，并保证上表面平整（图3-45）。

（2）启动电脑及近红外仪，打开软件，等仪器预热30min后安装杯托和盛放样品的测量杯。如图3-46为小样和中样测量杯上机，不同测量杯需替换配套杯托。

2．样品检测操作

（1）等仪器启动后，在Windows界面里面，点击软件快捷方式“Simplicity for DA7200”。出现如图3-47所示的界面，点击“登录”。

（2）进入软件操作界面，如图3-48，点击“OK”按钮。

（3）选择左上“花生2013小”红色按钮（若样品为中样，则选择“花生2013中”，后续步骤一致），弹出如图3-49工作界面（等待测量基线完成）。

（4）在“样品框”空白处添加样品信息，点击“分析”按钮，在某些项目中，每个样品被要求进行多次分析，当测完第一次时，会弹出一个对话框，上面显示“请为下一次重装样做准备”。此时，软件将要求对样品盘进行重新装样并将其放回到仪器上。点击“分析”按钮，结果如图3-50。

（5）分析下一个样品。当完成一个样品的分析后，用户可以重新装好样品，输入样品编号，再点击“分析”即可。重复步骤4，得到该样品测量结果。

3．数据保存及关机

（1）测量完不需要特意保存，结果是自动保存的。分析项目中使用的数据文件存储在PDA7200目录下：C:\PDA7200\Data\Products。

（2）数据导出：具体操作步骤如下。

①工具→实用功能→导出→预测数据，如图3-51。

②点击要导出的项目名称，点击“确定”，如图3-52。

③将要导出的数据在Marker选项中双击选中，出现“×”图标（图3-53），选择完，点击“Finish”，数据导出成功。

（3）关闭软件、计算机，近红外仪要放热30min后再关闭。

三、高油酸花生近红外自动分选设备

目前，瑞士和美国已有高油酸花生近红外自动分选设备生产。

QSorter Explorer（图3-54）于2014年上市。分选花生子仁的速度为20~30粒/s或1200~1800粒/min 。可同时根据油酸含量、水分、油分、种子长宽、霉变及破损粒、黄曲霉毒素污染高危粒等多项指标进行分选。

美国Davis等（2021）基于该设备建立了油酸含量的近红外模型，并对模型进行了验证（表3-14）。选用不同粒级的高油酸和普通花生子仁，按一定比例人为混合成待测试样，通过该机械进行分选，估算了不同油酸含量阈值下的错判率（图3-55），并研究了抽样种子粒数对高油酸子仁纯度估算的影响。

SEEDMEISTER Mark IIIx（图3-56）每4min种子处理量可达100粒。可根据油酸、亚油酸含量进行测试、分选 。