第二节
毛细管电泳

毛细管电泳是以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道，以样品电荷、极性、大小、亲和行为、相分配特性、等电点等多种特性为根据的液相微分离分析技术，有多种分离模式，其中毛细管区带电泳、胶束毛细管电动色谱常用于脂肪酸分离，是近年来发展最快的分析方法之一。毛细管电泳有多种检测器，脂肪酸检测中常用检测器是紫外检测器和激光诱导荧光检测器。目前，毛细管电泳技术正在向各种技术联用方向发展，其中毛细管-质谱联用技术发展最快，表面增强拉曼光谱、发光二极管诱导荧光、质谱成像等技术也有应用。这些新检测方法和技术的采用，使毛细管电泳技术在脂肪酸检测中展现出很好的应用前景（赵雷等，2014）。

Bannore等（2008）试验首次证明毛细管电泳可鉴定单粒花生种子游离脂肪酸油酸和亚油酸的含量，并用于花生育种。据称该技术只需0.1mg花生子叶组织就可以进行检测（Chamberlin等，2011）。

Chamberlin等（2011）利用三大类型（弗吉尼亚型、兰娜型和西班牙型）33份花生单粒种子，分别通过气相色谱法和毛细管电泳法测定油亚比，发现两种方法测定结果高度相关（r=0.96， p <0.0001），其准确度（accuracy）、灵敏度（sensitivity）和耗时相当（sample processing time）（从提取至得到分析结果均需5~6h），两种方法在高油亚比类型花生种子判定上完全一致。Chamberlin等（2014）用四大类型（弗吉尼亚型、兰娜型、西班牙型和瓦伦西亚型）23份花生材料374粒种子以气相色谱结果为参照，分析了毛细管电泳在单粒花生种子油酸、亚油酸含量检测上的可靠性，得出通过毛细管电泳判定高油酸类型单粒花生种子的准确率为99.5%。

毛细管电泳要求将样品油脂提取出来，进行预处理后上样。Chamberlin等（2014）采用毛细管电泳定量测定花生中油酸、亚油酸的步骤如下。

所有游离脂肪酸标准品（standard FFA）和花生样品的毛细管电泳分析在配备有光电二极管阵列检测器和0~30kV高压电源的P/ACE MDQ（Beckman Instruments，Inc.，Fullerton，CA，USA）上进行。在配置有P/ACE MDQ 32Karat软件版本8.0的IBM个人计算机上收集数据。用于分离的毛细管柱为Polymicro Technologies（Phoenix，AZ，USA）未处理的熔融石英毛细管（50μm I.D.，363~359μm O.D.），总长和有效长度分别为60.2cm和50cm。实验在28kV恒定电压下进行，温度保持在20℃。采用压力进样方式：0.5psi（1psi=6895Pa）×3s。用腺苷5'-单磷酸（adenosine 5'-monophosphate，AMP）作为背景紫外吸收剂，在254nm波长下进行间接紫外检测。新的毛细管柱用手动注射器用以下溶液（液体）连续冲洗一定时间：1mol/L氢氧化钠溶液10min，水3min，0.1mol/L盐酸溶液10min，水3min，最后用电泳电解质冲洗5min。每天实验开始时都要使用P\ACE MDQ仪器设置按以上步骤对毛细管进行连续洗涤，并在每个洗涤步骤对小瓶施加65psi的压力。进样前，用新鲜制备的运行电解质溶液（running electrolyte solution）[含40m mol/L Tris、2.5mmol/L AMP和7mmol/Lα-CD（α-环糊精）的NMF-二 烷-水（NMF-dioxane-water）（5:3:2，v/v）混合物]在运行电压（即28kV）下进行毛细管平衡20~30min。取适量游离脂肪酸标准品，以NMF-二 烷（4:1，v/v）为溶剂配制5mmol/L的脂肪酸标准储存液（stock solution）。

用运行电解液稀释储存液配制脂肪酸标准溶液。为定量花生油样品中的油酸和亚油酸，选择性质相似、在花生油中通常不存在或仅以痕量存在的十九烷酸（nonadecanoic acid）（C19:0）作为内标（internal standard）建立标准校准曲线（standard calibration curve）。用于校准的两种游离脂肪酸油酸（C18:1）和亚油酸（C18:2）标准溶液浓度为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L和1.4mmol/L，而游离脂肪酸C19:0内标浓度为0.5mmol/L。内标首先溶解在二 烷中，然后再加入NMF。使用前所有储存液、标准溶液和脂肪酸提取物均保存在-80℃。油酸和亚油酸定量是通过将样品中脂肪酸的峰高与校准曲线0.2~1.4mmol/L范围内脂肪酸标准的峰高进行比较来实现的。在上述浓度范围内，求得油酸、亚油酸校准曲线分别为 y= 2.232 x+ 0.1和 y= 2.286 x ，R ² 分别为0.9985和0.9961。

取纯化后的花生游离脂肪酸1μl或2μl，在最终运行缓冲液中稀释50倍或100倍，涡旋4~5s，每份样品中均加入游离脂肪酸内标C19:0（0.5mmol/L），然后加压进样。在连续进样之间用流动电解质以65psi的压力冲洗毛细管2min。进水池（inlet reservoir）运行电解质每天更换数次，出水池（outlet reservoir）电解质每天更换一次，周末和夜间将毛细管储存在水中。

图3-3为两个花生品种油酸、亚油酸和棕榈酸毛细管电泳图谱。