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色谱是基于混合物中各组分在体系中两相的物理、化学性能差异而进行分离和分析的方法。当流动相为气体时，称为气相色谱（gas chromatography，GC）；当流动相为液体时，则称为液相色谱（liquid chromatography，LC）（曹艳平等，2017）。
气相色谱、液相色谱和后文中将提到的毛细管电泳技术（capillary electrophoresis，CE）、密度（density）和折射率测定技术均可用于花生子仁脂肪酸含量测定，但都是湿化学（wet chemistry）方法，需试剂、耗材，并消耗一定量的花生样品。
气相色谱法是目前花生及其制品脂肪酸测定上广泛应用的方法。近红外定量预测模型构建常采用气相色谱法进行脂肪酸含量化学值（真值）测定。农业农村部油料及制品质量监督检验测试中心测定花生脂肪酸含量也采用该法（中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会、国家食品药品监督管理总局，2016）。气相色谱法可谓测定花生子仁脂肪酸含量的“金标准”。
花生样品分析前先进行甲酯化，然后利用气相色谱法对脂肪酸甲酯混合物组成进行定性、定量测定。
Philips和Singleton（1978）用气相色谱法检测花生油中游离脂肪酸，需要250mg花生油且预处理过程较复杂。Zeile等（1993）报道了一种只需要15mg花生远胚端子叶组织通过气相色谱分析花生脂肪酸的方法，但需N 2 和80℃水浴，转甲基作用耗时1h以上。Kaveri等（2009）等报道了一种30min快速制备脂肪酸甲酯的新方法，取半粒种子的量，并进行60℃、20min处理，保留的半粒种子萌发会受到影响。范晖（1991）报道了快速酯化处理的方法，至少也需要1g即大约1粒花生。高慧敏和张颖君（2010）对范晖的方法进行了改进，建立了微量（20mg）花生样品甲酯化的方法。山东省花生研究所分子育种团队对此进一步进行了优化，样品用量更少，取5~20mg花生远胚端子叶组织，样品制备耗时35min，气相分析18min，整个分析过程可于1h内完成，可用于单粒花生种子脂肪酸含量的快速测定（气相色谱分离效果见图3-1）（杨传得等，2012；杨传得，2012）。
图3-1 花生子仁8种脂肪酸气相色谱分离效果（杨传得，2012）
1．花生中油脂脂肪酸甲酯化（中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会，2008a；伍新龄等，2015） 花生中油脂脂肪酸甲酯化主要有氢氧化钾甲醇法、三氟化硼-甲醇法、三甲基氢氧化硫法、酯交换法等4种方法。
（1）氢氧化钾-甲醇法：这是油脂中脂肪酸甲酯化的常用方法，即将花生中甘油酯在氢氧化钾-甲醇溶液中皂化。称取约0.2g粉碎的花生样品，加入2 ml 4mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，旋涡混合后，加入1 ml石油醚/乙醚（1:1）溶液，再充分旋涡混匀，30℃反应6h。加入饱和氯化钠水溶液至管口，静置分层后取适量上层石油醚/乙醚层，甲酯化完成。
（2）三氟化硼-甲醇法：该法将花生中甘油酯在氢氧化钠-甲醇溶液中皂化，生成的脂肪酸盐与三氟化硼-甲醇溶液反应生成甲酯。
①仪器和试剂：磨口烧瓶，有效长度200~300mm且具有与磨口烧瓶配合的磨口接头的回流冷凝器，脱脂沸石，自动加液器或移液管，具螺旋塞的玻璃瓶，分液漏斗，旋转蒸发仪，分度值为0.001g的分析天平。0.5mol/L氢氧化钠-甲醇溶液，质量分数12%~15%的三氟化硼-甲醇溶液，色谱纯异辛烷（2，2，4-三甲基戊烷），氢氧化钠饱和水溶液，无水硫酸钠，含氧量低于5mg/kg的氮气，色谱纯己烷或沸程为40~50℃、溴值低于1的石油醚，1g/L溶解于体积分数为60%乙醇中的甲基红。
②检测方法：将花生样品置于烧瓶中，加入适量氢氧化钠-甲醇溶液及沸石，加热回流，再加入适量三氟化硼-甲醇溶液皂化；皂化后混合液中加入异辛烷、氯化钠溶液，静置分层后取上层异辛烷溶液，并加入无水硫酸钠去除水分，甲酯化完成。
（3）三甲基氢氧化硫（TMSH）法：该法是将花生中的甘油酯溶解于甲基叔丁醚中，通过与三甲基氢氧化硫-甲醇溶液进行酯交换来实现甲酯化。
①仪器和试剂：具磨口玻璃塞的试管或螺旋口自动进样瓶、移液管、容量瓶、滤纸、旋转蒸发仪。甲基叔丁醚、三甲基氢氧化硫-甲醇溶液、石油醚、无水硫酸钠。
②检测方法：将花生样品中的甘油酯用石油醚溶解，加入无水硫酸钠干燥，再向溶液中加入三甲基氢氧化硫-甲酵溶液，猛烈振摇，甲酯化完成。
（4）酯交换法：酯交换法是将花生中甘油酯溶解在异辛烷中，加入氢氧化钾溶液通过酯交换甲酯化，反应完全后，用硫酸氢钠中和剩余氢氧化钾，以避免甲酯皂化。
①仪器与试剂：具磨口玻璃塞的试管，移液管或移液器，微量移液管，具螺旋塞玻璃瓶，容量瓶。2mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，异辛烷，硫酸氢钠。
②检测方法：将花生样品中的甘油酯用异辛烷溶解，加入氢氧化钾-甲醇溶液，猛烈振摇，再加入硫酸氢钠，待沉淀完成，得到上层甲酯化溶液。
2．脂肪酸甲酯的气相色谱分析（中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会，2008b） 花生中脂肪酸经甲酯化后，采用气相色谱法进行分析，此方法采用填充柱或者毛细管柱气相色谱法，对脂肪酸甲酯混合物进行定性、定量测定。
（1）仪器
①气相色谱仪
柱箱：柱箱应能将色谱柱的温度加热至260℃以上，并能维持所需温度，当使用熔融石英管时，后一条件是特别重要的，建议采用程序升温。
进样装置：配用填充柱或者毛细管柱。填充柱的管柱所使用的材料应不与被分析物质发生反应，并且长度为1~3m，内径为2~4mm。填充物的载体为酸洗并硅烷化的硅藻土或其他适用的惰性载体，且粒度分布范围狭窄，平均粒度与管柱内径和长度有关，固定相为聚酯型极性固定液，氰基硅酮或符合色谱分离要求的其他固定液，固定相用量为填充物质量的5%~20%。柱的老化，如可能将柱子与检测器脱开，将惰性气体通入新制备的色谱柱，将柱箱逐渐加热至185℃，并在此温度下至少保持16h后，再于195℃的温度下继续通气2h。毛细管柱的管柱所使用的材料应不与被分析物质发生反应，长度为25m，内径为0.2~0.8mm，在涂布固定相前，需对内表面进行适当处理。固定相通常使用聚二甲醇、聚酯或极性的聚硅氧烷，键合柱也适用，涂层要薄，为0.1~0.2μm。柱的安装和老化遵从安装毛细管柱的常用注意事项（如色谱柱在柱箱内的位置，选择并安装接头，柱子末端在进样器和检测器中的位置），柱内通入载气流，令柱箱以3℃ /min的速度程序升温，从环境温度升温至比固定相分解温度极限低10℃的温度，对柱子进行老化，保持此柱箱温度1h至基线稳定，再降至180℃在恒温状态下进行工作。也可购买使用已预先老化的色谱柱。
检测器：以可加热到高于柱温的检测器为宜。
②注射器：最大容量应为10μl，刻度应为0.1μl。
③记录器：如果由记录曲线计算被分析混合物的组分，则需要一台高精度、能与所用仪器相匹配的电子记录器，并具有如下性能：响应时间小于1s，记录纸宽至少20cm，记录纸速在0.4~2.5cm/min之间可调。
④积分仪或计算机：可用电子积分仪或计算机进行快速、准确的计算，积分仪应具有满足线性响应的灵敏度，能较好地校正基线偏移。
（2）检测方法
①试验条件
填充柱：应考虑柱的长度和直径、固定相的性质和数量、柱温、载气流速、分离度、试样用量、分析时间。
毛细管柱：其效率和渗透性意味着各组分之间的分离和分析时间主要依赖柱内的载气流速，因此有必要按照此参数使操作条件达到最佳状态，以满足操作者对提高分离效果或缩短分析时间的不同要求。
理论塔板数和分离度的测定：合理选择柱温、载气流速和进样量，使硬脂酸甲酯峰的最大值大约在溶剂峰出现15min后出现，且峰高达到满标的3/4。
②进样量：用注射器取0.1~2μl的甲酯溶液。
③分析步骤：花生样品气相色谱仪检测采用程序升温，后在恒定温度下继续洗脱直至所有组分洗脱出来。
④标准色谱图和标准曲线绘制：用与试样相同的条件分析参比标准混合物，并测出各脂肪酸甲酯组分的保留时间又称滞留时间或保留距离，在半对数坐标纸上以任意不饱和度作图，所得曲线将显示保留时间或保留距离的对数是碳原子数的函数。在等温条件下，相同不饱和度的直链脂肪酸的曲线应是直线，且这些直线大致上是平行的。应避免存在“隐蔽峰”，即在该处的分离度不足以分离两种组分。
（3）结果计算
①定性分析：按照标准曲线绘制的色谱图上确定样品的甲酯峰。
②定量分析：组成的测定，除特殊情况外，通常使用内部归一化法，即假定试样的所有组分都显示在色谱图上，因此各峰面积的总和即代表100%的组成（完全洗脱）。如果仪器配有积分仪，可使用由此获得的数据；如无积分仪，则可用峰高乘半峰宽测定各峰的面积，此时应考虑记录过程所使用的不同衰减。
③计算方法：脂肪酸组分含量以甲酯的质量分数表示，数值以百分比计。
甲酯质量分数（%）=组分峰面积×100%/各峰面积总和，计算结果保留至小数点后一位或根据需要确定。
④精密度：主要包括重复性和再现性。
重复性：在同一实验室，由同一操作者使用相同设备，按相同的测试方法，并在短时间内对同一被测对象相互独立进行测试获得的两次独立测试结果。对于质量分数大于5%的组分，相对偏差应不大于3%，绝对差值不大于1%；对于质量分数小于等于5%的组分，绝对差值应不大于0.2%。
再现性：在不同实验室，由不同操作者使用不同设备，按相同的测试方法对同一被测对象相互独立进行测试获得的两次独立测试结果。对于质量分数大于5%的组分，相对偏差应不大于10%，绝对差值不大于3%；对于质量分数小于等于5%的组分，绝对差值应不大于0.5%。
1．样品预处理 经优化，处理花生子叶样品为20mg时，最佳稀释倍数为5~10；处理样品为10mg时，最佳稀释倍数为3~5；处理样品为5mg时，最佳稀释倍数为2~5。以下以处理5mg子叶组织为例加以说明。
选取待测花生种子，用洁净的刀片在花生种子远胚端切下直径1~2mm、重量约5mg的子叶薄片（不要种皮），并切成碎末，置于5 ml离心管中，加入脂肪提取液（苯：石油醚=1:1）1 ml，轻轻振荡后静置5min，加入0.5mol/L甲醇钠1.5 ml，振荡混匀，甲酯化10min，加入2 ml饱和氯化钠溶液，混匀后静置分层，待上清透明后吸取100μl上清于进样瓶，加入200μl石油醚（30°~60℃沸程）稀释3倍。稀释后的样品立即进行气相色谱分析。
2．气相色谱分析 气相色谱分析所用仪器为Agilent 7890A，配有火焰离子检测器、积分仪和30m×25mm×0.25μm的DBWAS硅胶毛细管柱。柱温210℃保持9min，然后以20℃/min的速度升温至230℃，保持8min。氮气（载气）、氢气和空气的流速分别为1.3 ml/min、40 ml/min和400 ml/min。进样体积为2μl，分流比为5:1，进样温度为250℃。
本法样品处理耗时少，步骤简单，所需试剂均为常见试剂，成本低，对仪器设备要求不高。因取样量少，不会对花生种子萌发产生不良影响。
与气相色谱不同，高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）测定脂肪酸含量不需甲酯化处理，也没有气相色谱的高温气化，能避免热敏性官能团降解。
为测定包括花生在内的几种植物种子内的脂肪酸，Goyal（2000）采用简便易行、重复性好、成本低、产物稳定的溴苯酰基反应进行脂肪酸衍生化，并使用70%乙腈（acetonitrile）和95%乙腈的二元梯度洗脱，在配有50mm×4.6mm保护柱（guard column）的Alltech Adsorbsphere ® C8反相柱（reverse phase column）（250mm×4.6mm×5μm）上成功分离所得产物（于210nm波长进行紫外吸收检测）。从普通花生种子中检测了亚麻酸（linolenic acid）、亚油酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸（stearic acid）、花生酸（arachidic acid）和芥酸（erucic acid）等7种脂肪酸。
Hein和Isengard（1996）设计了3种反相HPLC（reversed-phase HPLC）方法用于植物油脂肪酸的定性和定量测定。植物油被水解后，无需衍生化处理，即可通过HPLC对获得的游离脂肪酸进行分析。方法Ⅰ检测了花生种子中的6种脂肪酸[亚麻酸、棕榈油酸（palmitoleic acid）、亚油酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸]；方法Ⅲ色谱分离图上的峰没有方法Ⅰ多，但亚油酸、油酸峰比较明显（图3-2）。
郑振佳等（2011）采用柱前衍生-高效液相色谱荧光检测法分析了花生油中的游离脂肪酸。用荧光衍生试剂2-（11H-苯[a]咔唑）乙基对甲苯磺酸酯（BCETS）作为柱前衍生化试剂对油酸、亚油酸、花生一烯酸等9种不饱和脂肪酸和棕榈酸、硬脂酸进行衍生，经梯度洗脱实现了11种游离脂肪酸BCETS衍生物的完全分离，使用外标法定量，建立了同时测定11种脂肪酸绝对含量的方法，并证明此法重复性和再现性较好。此研究共鉴定了花生油中的8种游离脂肪酸。
图3-2 花生油脂肪酸方法Ⅰ（左）和方法Ⅲ（右）液相色谱图（Hein和Isengard，1996）
色谱的优势在于分离，主要靠与标样对比达到对未知物结构的推定，难以得到结构信息；质谱法能提供丰富的结构信息，样品用量少，但质量要求高，预处理复杂。结合两者优势将色谱和质谱联用极具发展和应用前景。用于花生或其制品脂肪酸成分分析可同时进行定性和定量分析。
Gölükcü等（2016）利用气相色谱与质谱联用（GC-MS）技术分析了土耳其花生品种的脂肪酸组成，结果表明这些花生品种含有棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸和山嵛酸等6种脂肪酸，且脂肪酸组成变化较大。
严俊安等（2017）利用GC-MS分析发现，红皮花生和白皮花生中均含有油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸等21种脂肪酸。
李子祥等（2021）用超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱（UPLC/Q—TOF MS/MS）联用仪对花生油甲醇提取液分离检测，分析花生油成分，并通过二级质谱图和标准品确定物质。结果表明：正离子模式下检出86种化合物，鉴定30种物质，其中芥酸、棕榈酰胺、硬酯酰胺、油酸酰胺、11Z-二十二碳二烯酸为已知的花生油成分；在负离子模式下，共检出27种化合物，鉴定15种物质，其中包括花生油中常见的7种脂肪酸（花生酸、α-亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸、花生烯酸）。
近年来发展起来的二维或多维色谱分离技术，结合了多种分离手段，与一维色谱相比能明显提高分辨能力，增加峰容量，可用于复杂样品分析。
Dong等（2015）通过二维液相色谱（two-dimensional liquid chromatography，2D LC）与大气压化学电离质谱（atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry，APCI-MS）联用对高油酸花生油与普通花生油三酰甘油（TAG）脂肪酸组成进行分析、比较，发现该技术能将高油酸油与普通花生油区分开来。高油酸花生油与普通花生油TAG在OOO、OPO和POL含量上存在差异。