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泥鳅属多次性产卵鱼类。在长江流域泥鳅生殖季节在4月下旬，水温达18℃以上时开始繁殖，直至8月，产卵期较长。盛产期在5月下旬至6月下旬。每次产卵花费时间较长，一般需4~7天。繁殖的水温为18~30℃，最适水温为22~28℃。
泥鳅怀卵量因个体大小而有差别，卵径约1毫米，吸水后膨胀达1.3毫米。一般怀卵8000粒左右，少的仅几百粒，多的达十几万粒。体长12~15厘米泥鳅怀卵1万~1.5万粒；体长20厘米泥鳅怀卵达2.4万粒以上。雄泥鳅体长达6厘米时便已性成熟，体长9.4~11厘米雄性泥鳅精巢内约含6亿个精子。成熟个体中往往雌泥鳅比例大。
泥鳅常选择有清水流的浅滩，如水田、池沼、沟港等作为产卵场。发情时常有数尾雄鳅追逐一尾雌鳅，并不断用嘴吸吻雌鳅头、胸部位，最后由一尾雄鳅拦腰环绕挤压雌鳅，雌鳅经如此刺激便激发排卵，雄鳅排精，这一动作能反复多次。产卵活动往往在雨后、夜间或凌晨。产卵后的雌鳅腹鳍后方身体腹部一侧留有一个近圆形的白斑状伤痕，这是由于雄鳅背鳍的肉质小隆起和胸鳍小骨板在雄鳅卷压雌鳅时，使雌鳅腹部受了伤，白斑就是“伤痕”。如果发现雌鳅腹部两侧出现新的白斑，表明已产过卵了，并且白斑越深越大，产卵越多；反之，是产卵不佳。受精卵具弱黏性，黄色，半透明，可黏附在水草、石块上，一般在水温19~24℃时经2天孵出鳅苗。刚孵出的鳅苗约3毫米，身体透明呈痘点状，吻端具黏着器，附着在杂草和其他物体上。约经8小时，色素出现，体表渐转黑色，鳃丝在鳃盖外，成为外鳃。3天后卵黄囊接近消失，开始摄食生长。经20多天，苗长15毫米，此时的形态与成鳅相似，呼吸功能也从鳃呼吸转为兼营肠呼吸。