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泥鳅属温水性底层鱼类，多栖息在静水或缓流水的池塘、沟渠、湖泊、稻田等浅水水域中，有时喜欢钻入泥中，所以栖息环境往往有较厚的软泥，一般不到水体的上、中层活动。较适水环境一般为中性和偏酸性。泥鳅在水的底层生活，它对环境的适应能力非常强，既能在水中游泳，又能钻到底泥里。它昼伏夜出，白天钻到底泥里休息，晚上出来在水底寻找食物。由于长期生活在黑暗的环境中，它的视力极度退化，变成了“瞎子”。但是，它的感觉却很灵敏，泥鳅的感觉主要是触觉，靠触须来寻找食物。另外，它的侧线系统也很发达和灵敏，可以依照它们来感觉水的变化，逃避敌害。有的时候，泥鳅傻呆呆地伏在水底，一动不动，即使人走近了，它也没有反应，好像一伸手就能抓起来，可是当人一伸手刚触及水面时，它就马上感觉到了，并且迅速地溜走。另外，也能为避开不利环境而逃逸。
泥鳅对缺氧的耐受力很强，比一般鱼类更耐低氧，离水不易死亡，水体中溶氧低于0.16毫克/升时仍能存活，这是因为泥鳅不仅能用鳃呼吸，还能利用皮肤和肠进行呼吸。泥鳅肠壁很薄，具有丰富的血管网，能够进行气体交换，具辅助呼吸功能，所以又称为“肠呼吸”。肠呼吸是泥鳅特有的呼吸方式，当水温上升或水中缺氧时，泥鳅垂直游窜到水面吞吸空气，在肠内进行气体交换，然后废气从肛门排出。人工养殖时，投饵摄食后泥鳅肠呼吸的次数会增加。据报道，泥鳅耗氧量的1/3是由肠呼吸取得的。由于皮肤和肠都能进行呼吸，所以，泥鳅的呼吸没有稳定的频率，慢的每分钟只有几次，快时能超过100次。
泥鳅生长的水温范围是15~30℃，最适水温是18~28℃。当水温降到6℃或升到33℃以上时，或遇枯水期，泥鳅便潜入泥层下10~30厘米处，停止活动进行休眠。水温高于30℃，而泥鳅又无泥可钻时，表现为烦躁不安，特别是由北方引入南方的泥鳅，此时开始死亡。泥鳅在休眠期，只要泥层中稍有水分，就能维持生命。一旦水温达到适宜温度时或者说条件适宜时，泥鳅便又会复出活动摄食。
泥鳅很善于逃跑，春、夏季节雨水较多，当池水涨满或者池壁被水冲出缝隙时，泥鳅会在一夜之间全部逃走，尤其是在水位上涨时会从泥鳅池的进出水口逃走。因此，养泥鳅时务必加强防逃的管理。检查进出水口防逃设施是否有堵塞现象，是否完好，要及时排水，防止池水溢出，造成泥鳅逃逸。
泥鳅一般白天潜伏水底，傍晚后活动觅食，不喜强光。人工养殖时往往集中在遮阴处，或是躲藏在巢穴之中。