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冷冻消融（cryoablation）是利用超低温选择性原位灭活肿瘤组织的方法。肿瘤低温冷冻治疗是一种传统的肿瘤治疗方法，人类运用低温技术治疗疾病已有数千年的历史，可以说冷冻疗法是人类最早使用的肿瘤治疗技术之一，它的发展和成熟，极大地推动了临床肿瘤治疗学的进步。冷冻消融治疗肿瘤具有安全、有效、微创、副作用小等特点。在肺癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、胰腺肿瘤、脑肿瘤、肾肿瘤等多种实体肿瘤局部消融治疗中，已经取得较理想的治疗效果，极大地促进了肿瘤微创靶向消融治疗的进步，为肿瘤临床治疗学的发展带来了新的进步。
冷冻治疗有着悠久的历史，最早可以追溯到希波克拉底时期（公元前460—前377年），人们已经利用冷冻来缓解疼痛和抗炎。19世纪，人们开始探索应用局部冷却来控制疼痛和治疗疾病。英国医生JamesArnott被称为“现代冷冻手术之父”，他可能是第一位局部使用极冷来破坏组织的人。1845年，他用含碎冰的盐溶液（温度达到-20℃）治疗晚期乳腺癌、子宫癌以及皮肤癌的患者，他发明了一种用软管连接冰盐水到患处来治疗肿瘤的装置，但是冰盐水混合物并不足以降低组织温度特别是深层组织的温度，19世纪后期，人们开始对液化气体产生了浓厚的兴趣。1877年，法国的Cailletet和瑞士的Pictet发展了为冷却气体扩张隔热的系统。从而导致了液化氧和氮的出现，1892年，Dewar开发了第一个真空瓶以方便储存液态气体。1895—1896年，Carl Von Linde利用焦耳-汤姆逊效应商业化生产液态气体，术语“制冷剂（cryogen）”在这期间开始使用。商业化进程推广了冷冻技术的使用，使冷冻疗法在很多方面取得了进展。1899年，Campbell White报道了临床应用冷冻疗法治疗多种皮肤病的经验，并且，他认识到了液态空气治疗癌症的效率。他认为，将液态空气作为早期治疗方法的上皮瘤可能得到永远治愈。1907年，William Pusey首次临床应用干冰（固体二氧化碳，温度可以达到-78.5℃）治疗皮肤病变（如疣、血管痣、上皮瘤）。他主张应用比液态气体更容易获得的干冰作为冷冻剂。同年，Whitehouse发现液态空气对上皮瘤、红斑狼疮和血管痣尤其有用。他利用冷冻疗法治疗放疗后上皮瘤复发，发现液体空气比重复放疗更成功。他还设计了一个液体空气喷雾瓶，来提供比以前直接用棉绒蘸取液态空气再涂抹患处低得多的最低温度。同年，Bowen和Towle报道了液体空气成功用于血管病变的治疗。1911年，Hall-Edwards首次在 The Lancet 中描述了他的二氧化碳收集器和压缩机模型，并发表专著详细介绍了二氧化碳的使用和收集方法。20世纪30年代，Lortat-Jocobs和Solente使用液体二氧化碳通过各种尺寸的铜尖端来治疗皮肤病变，也治疗妇科病变。1950年，Herman V.Allington首次引入液氮来制冷（-196℃），随后在治疗疣、角化病和不同的非癌性病变中变得流行。1956年，Fay设计了一种金属胶囊，与外部冷灌系统连接，置入大脑内治疗肿瘤和脓肿，他也利用这种技术治疗了乳腺癌的患者。1962年，神经外科专家Irving S Cooper在工程师和冷冻生物学家的帮助下设计出第一根液氮探针，局部温度能够达到-196℃，并用它来对帕金森病等脑病及以前无法手术的癌症进行冷冻治疗。Cooper的冷冻探针推进了冷冻疗法的实践，这导致了人们对冷冻疗法越来越感兴趣。1965年，Douglas Torre开发了一种尖端尺寸和形状不同的液氮喷雾式的冷冻探针。1967年，SetragZacarian设计了一种使用液态氮气的手持式冷冻外科设备，并开始使用“冷冻手术（cryosurgery）”一词。1972年，Flocks报道了经尿道或通过切开会阴部使用液氮探针治疗良性前列腺增生和前列腺癌。随着新型超声探头的发展，1984年，Onik G等研究肝脏冷冻治疗的超声特征，发现冷冻组织和冷冻针具有明显的声学特性，使得冷冻针的放置以及冷冻手术效果的实时术中监测成为可能。1993年，埃及皮肤科医生Ahmed Hani Weshahy发明了一种可以行“病灶内冷冻手术”的冷冻针“Weshahycryoneedles”，这种冷冻针可以穿刺到病灶的内部，对深部病灶进行冷冻治疗，针有成角、弯曲和钩形各种形状。这种针的优点是较以往的冷冻治疗可以达到更深的组织，缺点是仅能通过皮肤表面和针的可见部分之间的接触点周围形成的白色冰球的程度来估计冷冻的深度。1993年，OnikGM等开始开展经直肠超声引导经皮根治性冷冻手术消融前列腺癌。同年，出现了基于物理学焦耳-汤姆逊原理（Joule-Thomson Principle）的低温手术系统——氩氦刀（Cryocare Surgical System）又称氩氦冷冻外科系统（Argon-based cryosurgical system），它使用常温的高压氩气作为冷媒，高压氦气作为热媒使局部达到冷热交替作用，更利于局部组织的损伤。1998年，氩氦刀治疗前列腺癌和肝癌被FDA批准。1999年当这款产品首次进入中国时，由张积仁教授命名为氩氦刀。1999—2000年，以色列开发生产的Argon-based cryosurgical system被CE及美国FDA批准用于临床。2017年，我国自主研发的低温冷冻手术系统（康博刀）获国家食品药品监督管理总局“创新医疗器械特备审批”，以及三类医疗器械产品注册证批准用于多种实体肿瘤的治疗。
本章基于氩氦刀阐述冷冻消融治疗技术。
冷冻消融治疗的工作原理是焦耳-汤姆逊原理（Joule-Thomson Principle），即当气体通过一个狭小的微孔从较高压力区域喷入较低压力区域时，将被节流，大多数气体遭遇节流后温度将下降，如氩气和氧气；而某些体，例如氢气和氦气，温度反而上升。氩氦刀的每个通道分配器控制氩气阀和氦气阀，分配器将2 800psi氩气加压后供给冷刀，在冷刀尖通过一个直径很小的微孔，迫使气压急剧下降到1 500psi，从而使氩气温度下降并形成冰球（冷冻模式），当氦气通过微孔时，气体温度升高成为加热模式。氩氦刀靶向低温手术系统采用美国太空火箭制导和多项欧美专利技术，是世界上第一个兼具超低温和热效应功能的医疗系统。这种多探头、高精确度、快速冷冻急速复温的手术系统代表着国际上20世纪90年代超低温冷冻仪器的先进水平，促进了超低温手术和肿瘤冷冻治疗的发展。它的发明较好地解决了超低温治疗中靶区的精确控制和监控的临床难点，减少了对正常组织的损伤，使肿瘤的超低温靶向冷冻和热疗成为现实。
冷冻会对细胞和生命体产生一定的破坏作用，其机制是非常复杂的，有细胞内/外冰晶形成学说、易溶性结晶形成学说等多种理论，但一般认为主要是由机械效应和溶质效应发挥作用。
生物物质的冷冻过程首先是从纯水结冰开始，冰晶的生长逐步造成电解质的浓缩；随后是低共熔混合物凝固；最后全部变为固体。
机械效应是由细胞内外冰晶生长而产生的机械力量引起的。特别是对于有细胞膜的生命体影响较大。一般冰晶越大，细胞膜越易破裂，从而造成细胞死亡；冰晶小，对细胞膜的机械损伤也较小。缓慢冷冻产生的冰晶较大，快速冷冻产生的冰晶较小；就此而言。快速冷冻对细胞的影响较小。缓慢冷冻容易引起细胞的死亡。
溶质效应是由于水的冻结和冰晶化，使细胞间隙液体逐渐浓缩，细胞外液电解质浓度增加，引起蛋白质变性，从而使细胞死亡；另外细胞外液电解质浓度增加，细胞处于高渗环境中，会导致细胞脱水而死亡。细胞外液电解质浓度越高，上述原因引起的破坏也越厉害，溶质效应在某一温度范围最为明显。这个温度范围在水的冰点和该液体的全部固化温度之间。
细胞冷冻生物学的研究结果提示：组织细胞低温冷冻损伤的过程，大致可以分为三个阶段：
细胞外冰晶形成当冷冻速度较慢，或在冷冻（温度-21～-4℃）初期，细胞外液冷冻，细胞外冰晶形成并逐渐增多，引起细胞外溶质浓度增大，产生高渗环境。由于细胞膜具有一定的屏障作用，此时细胞内液尚未冷冻。为了平衡渗透压，细胞内的水分便通过渗透压梯度作用渗透到细胞外间隙，从而引起细胞内渗透压上升，溶质浓度增加，导致细胞内脱水。失去水分的细胞变得皱缩，细胞膜和细胞器因此而受损。最后，细胞皱缩达到最大程度，细胞内水分不再进入细胞外，而此时由于细胞外冰晶继续形成，细胞外溶质浓度仍然继续增加，从而在细胞膜内外侧产生一浓度梯度。当此浓度梯度达到一定程度时，细胞外液内溶质便进入细胞，从而产生对细胞的机械性作用力，导致细胞内结构相继受损。损伤包括：①由于脱水所致的细胞形状改变损伤细胞膜；②来自细胞外冰结晶压迫所致的细胞膜损伤；③因溶质效应致蛋白质变性和细胞内分子的化学性损伤。
这些损伤很大程度上依赖温度，温度越低，损伤越强。更多的损伤机制与细胞骨架有关，细胞骨架结构依赖于存在于细胞膜蛋白和细胞骨架之间的化学键。温度的降低削弱化学键的活力，而使细胞骨架特别容易受到机械损害。
细胞内冰晶形成由于细胞膜渗透性随温度的降低呈指数降低，所以当冷冻速度极快，或温度进一步降低时，无足够的时间让细胞内水离开细胞以平衡细胞内外渗透压的差异，细胞内水分滞留。超冷冻水有突然聚集及冰冻趋势，会突然形成细胞内冰晶，有证据表明，细胞内冰晶形成往往是致死性的（冰晶越大，破坏越严重）。通常在温度降至-15℃或以下时，细胞外出现不均质性冰核，当温度降至-40℃时，细胞内便形成均质性冰晶，冰晶膨胀，损伤和裂解细胞膜；线粒体和内质网等细胞器，亦会因此而发生不可逆性损伤；还伴随其他一系列细胞病理生理改变，如：Ca 2+ 超载，Ca 2+ -ATP酶活性下降，脂质过氧化反应增强，细胞核碎裂或溶解，血管基底膜肿胀或断裂等，最终导致细胞死亡（图13-2-1）。
解冻和复温也会导致细胞的损伤。复温过程中，可能由于下列两种机制，引起靶细胞进一步损伤：①细胞内小冰晶再结晶或相互融合，形成大冰晶，后者对细胞有更强的破坏作用；②细胞外间隙成为低渗状态，水再进入细胞内，引起细胞肿胀，导致细胞膜破坏，从而使得一些在冷冻期未损伤的细胞在复温过程中被破坏。在冷冻状态下，如果开始复温，在较高的低冰点温度下，冰晶有再次冰晶化的趋向。再次冰晶化将导致细胞外空间的分解，并导致组织细胞的裂解。在消融过程中，随着冰的融化，细胞外的溶液可以部分或完全的成为高渗液，使水分进入细胞，使细胞膜进一步扩张或破裂。当消融的速度很快，某些细胞将在体温的条件下保持高渗，因而导致代谢的破坏和进一步的附加损害。基于这一原理，氩氦刀在氩气冷冻后，采用氦气快速复温融解，进一步保证了消融靶区细胞坏死的治疗效果。
图13-2-1 冷冻致细胞损伤机制
对于血管微循环系统的损伤是冷冻治疗中组织损伤的另一种重要的机制。毛细血管多为单层上皮，血管内皮细胞极易损伤，因此冷冻时微循环系统基本破坏。实验表明在消融短时间之后，冷冻区域的边缘出现水肿，然后冷冻区域的血管内皮细胞出现损伤；毛细血管壁通透性增加；血小板的温度如果低于类脂相位的转变温度，可导致钙离子流入；引发血小板的激活，导致冻结病变区的血小板聚集及血管停滞。最终导致微循环小血管被完全地封闭，失去了血液灌注，最终导致局部贫血和组织坏死。这种组织损伤的机制可以解释为什么在冷冻治疗过程中，某些情况下没有冷冻区域的癌细胞也会死亡。
在复温和冰球融解时，血管迅速舒张，内皮肿胀，氧自由基产生，微粒体及质膜上的脂加氧酶（lipoxygenase）及环加氧酶（cyclooxygenase）激活，催化花生四烯酸代谢等。靶组织细胞损伤方式以缺血再灌注损伤为主（图13-2-2）。
图13-2-2 超低温冷冻-复温致血管微循环损伤机制
Brown等应用激光多普勒血流计，测定冷冻对实验性鼠移植性肝癌红细胞流出量（red cell flux）的影响，发现冷冻后靶组织内血流量瞬间减少，减少时间持续8小时，冷冻24小时后血流量恢复到冷冻前水平（表13-2-1）。这种微循环的受损显然促进了冷冻对靶组织的破坏。
表13-2-1 冷冻对实验性移植性肝癌鼠模型红细胞流出量的影响
1.结果以红细胞流出百分率（平均值±SE）表示
2.A组：移植性肝癌鼠/冷冻；B组：正常肝鼠/冷冻；C组：正常肝鼠/假冷冻；D组：移植性肝癌鼠/假冷冻
3.* p <0.05（Wilcoxon test），与冷冻前比较
实验性肝冷冻显示，微、小动静脉内冰晶持续形成后，微血管扩张，进而发生一系列的结构完整性破坏：血管内皮层破坏，血管壁通透性增加，出现小孔，血管内液外渗以及引起间质水肿；血小板凝集，微血栓形成，最终血流淤滞和闭塞，组织缺血缺氧，在冷冻期残存的细胞可因此而被破坏。由于微、小动脉内血流流速比静脉内快3倍，血流的热交换作用可缓冲冷冻的作用，因此，微、小静脉内这种现象最明显。在初次复温10～20分钟内，冷冻区循环障碍常可逆转，再次冷冻时则循环往往受破坏严重，难以恢复。
部分临床医生在实施肝癌氩氦靶向治疗时发现，对供血主干的瘤体实施氩氦靶向治疗后，其边缘微小病灶也随之消失。病理研究成果证实，治疗后冰晶及微血栓在微静脉及微动脉内形成，小血管冷凝栓塞。这一现象提示我们，在实施肿瘤氩氦靶向治疗时，以彩色多普勒观察肿瘤供瘤血管和血流的变化，以帮助制订靶向治疗计划和指导治疗及疗效评价有一定意义。对氩氦靶向治疗血管栓塞效应的进一步观察和总结将有助于这一技术的发展和提高。
温居一等用氩氦刀冷冻消融治疗T739小鼠LA795肺腺癌皮下移植瘤，冷冻后病灶中心坏死区周围可见一明显的充血带。局部血管充血、栓塞、渗出（图13-2-3）。
必须指出的是，虽然微、小动静脉在复温后4小时内仍难恢复，但大的血管，尤其大的动脉一般不受破坏，即使受损，在其后24小时内一般仍能恢复，这与“热池效应”有关。这在临床治疗中具有实际意义，使得邻近大血管的肿瘤能安全地接受冷冻治疗，这是冷冻优越于其他以高温为基础的消融治疗之处。
亦有研究指出：
坏死和血管效应引起的低氧血症等共同诱导的继发炎症反应，构成了冷冻术的延迟效应，也可以诱导细胞凋亡。冷冻的血管效应，可能也是临床上氩氦刀冷冻消融术后，针道种植转移率及远处转移率较低的一个原因。
图13-2-3 冷冻损伤区血管（HE×400）
目前，有报道证实，凋亡机制亦参与了冷冻所致的细胞损伤。Hollister等用-5℃和-15℃冷冻前列腺癌细胞后，均可观察到DNA的降解，符合凋亡的变化。同时观察到，这一过程可被凋亡抑制剂所阻止，且细胞存活率大大提高。以后，其他不同的模型也报道了类似的发现。Vivien等提出冷冻后组织损伤不仅是由于直接的坏死和微血管的阻塞，还包括炎症浸润和后来的凋亡。温居一等的研究观察到：对T739小鼠LA795肺腺癌皮下移植瘤实施局部冷冻后，TUNEL染色可见凋亡细胞，主要集中分布在冰球周围损伤区带，细胞出现了凋亡特有的形态学变化。冷冻组各时间点凋亡细胞阳性率均显著高于对照组（ p <0.05）。
（1）冷冻损伤的强度：
多数学者认为，细胞死亡的形式决定于损伤的强度。距离冷冻源越远，冷冻率的衰减愈明显。早期研究已证实，使用2mm直径氩氦冷冻探头，冷冻探头中心温度可达-125℃左右。随着距冷冻探头中心距离的增加，冷冻程度逐渐下降，距离氩氦刀探头外壁0.7cm处的组织温度可降低到-40℃左右，而距离1cm处的组织温度为0℃（此处为物理冰球边缘）。并且由于不同组织的物理参数如：血流灌注率、代谢率、组织密度和热导率通常存在差异，有时差异十分显著，加剧了冷冻的不均质性。这就导致了组织温度分布的不同。这种组织温度的变迁使得冷冻消融区周边的一很小区域内，组织细胞没有经历致死温度，对于这一区域细胞生物学行为到目前为止仍未有明确研究结果，但是此区域细胞的损伤情况与肿瘤的原位复发及继发转移有很大关系。现在认为，在这部分由低温向常温过渡的区域内，凋亡机制扮演了一个重要的角色。
（2）不同组织细胞的冷冻敏感性：
细胞对冷冻敏感性的差异也是促使细胞逃避坏死，而最终能够进入凋亡阶段的因素之一。目前的结果显示，不同的细胞、不同的冷冻时间、不同的定位及物种都有可能存在差异。
（3）白细胞的存在：
冷冻后可以使部分细胞立即发生坏死，这些坏死细胞可以诱发迟发的炎症浸润，同时由于组织灌注的降低，导致低氧血症，也可以诱发炎症介质的释放，促使白细胞聚集。处于炎症反应急性期的多形核白细胞可以进一步产生多种细胞因子，包括TNF-α、IL-β和NF-κB，这些可以调控炎症的瀑布反应，介导凋亡。Dollin等最先于体外证明白细胞的存在和低温可以导致凋亡。之后Vivien Schacht等于体内进一步证明，白细胞的聚集与凋亡的时间效应相关。冷冻术后，肿瘤周边可以观察到凋亡，24小时凋亡达高峰，此时白细胞也于肿瘤周边的正常组织中积聚达高峰，他们以为，凋亡明显被白细胞浸润加强。
（4）低氧：
冷冻造成微血管的阻塞，降低功能血管密度（FVD）和红细胞流速（RBCV），组织灌注降低导致随后低氧血症的发生。低氧造成的细胞死亡普遍认为是坏死。然而，既往研究显示低氧造成NF-κB的激活，通过降低bcl-2因子可以造成上皮细胞凋亡。Vivien Schacht等研究亦证明低氧与凋亡存在相关性。
（5）凋亡的时间点：
其研究结果差异较大。在以液氮探针冷冻小鼠顶骨表面组织的试验中，观察到30分钟后，冷冻中心区开始出现明显的界限，2小时后开始细胞坏死。但直到12小时，冷冻周边才发现有细胞出现渐进性凋亡。还有学者以无黑色素性恶性黑色素瘤细胞（A-Mel-3）植入仓鼠背部皮下形成异种移植模型后，将肿瘤组织冷冻到-20℃（冷冻速率为150℃/min），发现肿瘤周边区域，凋亡细胞在冷冻后即开始升高，并于24小时后达最大。Valerie Forest等在人腺癌细胞的小鼠移植模型中，则观察到凋亡从术后2小时26%缓慢升高，在8小时达最高47%。温居一等发现，T739小鼠LA795肺腺癌皮下移植瘤冷冻消融后，冷冻组凋亡细胞于术后3小时即开始增多，术后8～16小时凋亡达高峰（71±6.41%）。
关于凋亡结果的偏差可能的解释是：①凋亡检测手段不同。②坏死和凋亡有时是很难精确区分的。由于凋亡和坏死的特征经常共存，Lamasters提出了“necrapoptosis”这一概念。③可能是不同细胞在凋亡率上的差异。
（1）p53：
当细胞接受刺激时，已经发现抑癌基因 p53 在凋亡中起到一定作用。p53诱导细胞凋亡的机制可能是：①降低细胞内源性Bcl-2蛋白表达和抑制其功能。在恶性肿瘤中p53与Bcl-2蛋白表达呈明显负相关。②提高细胞内Bax蛋白的表达，使Bcl-2、Bax蛋白比例失调而促进细胞凋亡。虽然多种因素可以引起p53表达的改变，但在冷冻野生型及突变型 p53 的细胞后，均可观察到凋亡，且p53的表达量并无明显变化，提示冷冻诱导的凋亡可能并不需要p53的活化。
但 p53 是野生型或突变型似乎可以影响凋亡前体蛋白bak的表达，如冷冻结肠癌HCT116细胞后，Bak的表达在含野生型p53的细胞中上调，而在含突变型 p53 细胞中则是降低。提示Bak在冷冻诱导伴有不同状态 p53 的结直肠癌细胞时调节凋亡的作用仍需进一步明确。而hanai等则于实验中发现，携带 p53 突变株的HT29细胞较正常细胞对于冷冻治疗诱导凋亡反应迅速，并含有一完整的caspase瀑布途径：细胞色素C从线粒体释放到胞质中，继之以caspase-9的活化和PARP的降解。
上述研究表明，虽然p53在冷冻前后表达无明显改变，但仍有可能是通过某种未知的机制参与了凋亡过程。
（2）Bcl-2家族：
Bcl-2蛋白家族是另一类调节细胞凋亡下游途径的主要成分。根据其功能可以分为两大类：抑制凋亡（如：Bcl-2、BCL-XL、Bcl-w、Mc-1）和促进凋亡（如：Bax、Bad、Bid、Bcl-XS、Bak、Bik、Bim、Hrk）。该家族成员的细胞内水平及比值决定了凋亡各环节的效率。
Bcl-2蛋白的过表达可在多种肿瘤中发生，作为一种抑凋亡蛋白已得到普遍认同。Bax是Bc1-2家族成员之一，与Bc1-2作用相反，能促进细胞凋亡。但其是否能单独介导凋亡存在争议。目前认为抑凋亡和促凋亡蛋白的比值是影响细胞凋亡敏感性的重要因素。肺癌组织存在Bcl-2蛋白表达上调和Bax蛋白表达下调。而冷冻后Bcl-2家族蛋白表达则是细胞特异性的。Wen等的试验结果显示，冷冻后Bc1-2蛋白的表达未见明显变化。这与文献报道在冷冻结肠癌细胞时的发现基本一致，提示冷冻诱导肺癌凋亡的途径可能不是通过调节Bcl-2来实现的。而Bax在冷冻后表达上调，在组织中的分布与TUNEL染色结果类似，说明Bax在冷冻促进凋亡的过程中显示了作用。
（3）caspase家族：
PARP是一种核蛋白，其功能与细胞DNA复制、重组、修复、细胞周期调控、细胞分化和细胞凋亡等方面有关。caspase是细胞凋亡机制中重要的效应子之一。目前已发现14种以上caspase家族成员，其中三分之二以上与细胞凋亡有关。caspase级联效应最后激活caspase3，所以caspase3是caspase凋亡途径中终末剪切酶。caspase3激活后剪切成两个片段，激活其底物，并参与激活PARP，引起细胞形态改变及DNA降解，导致细胞凋亡。同时caspase3活性又受到其他凋亡调控因子调节，如p53、bcl-2和bax等。研究证实，caspase蛋白水解PARP是细胞凋亡的早期事件。通过检测PARP剪切片段，证实细胞凋亡事件发生。Wen等的实验结果表明冷冻后冰球周边损伤区带组织冷冻组caspase-3由32kDa剪切为20kDa，而对照组则示未见剪切片段。PARP蛋白从116kDa剪切为85kDa，而对照组相同部位取材则未见PARP剪切，表明冷冻治疗可能通过caspase途径诱导冰球周边损伤区带细胞凋亡。
因为在冷冻后，亚低温区受冷冻影响的细胞会随之发生凋亡。所以在氩氦冷冻消融治疗后，有必要联合放、化疗及其他治疗手段，以进一步促进冷冻周边损伤区带细胞凋亡，进而提高冷冻治疗的效果。
最初考虑冷冻与免疫相关，是在临床上冷冻切除一原发的前列腺肿瘤后，其转移灶有部分消退的表现。于是人们设想有免疫机制参与了这一过程，并提出了冷冻免疫这一概念（cryoimmunologic reaction或cryoimmunology），用以描述冷冻肿瘤术后诱导发生的免疫现象。为了证实这一现象，日本学者将VX2癌细胞在兔背部左右两侧皮下接种，待双侧肿瘤生长至一定大小后，对右侧肿瘤进行冷冻手术，17天后行病理组织学检查，发现被冷冻的右侧肿瘤发生了完全的坏死和脂肪变性，而未被冷冻的左侧肿瘤也有很厚一层淋巴细胞围绕，其中心发生了坏死和液化。这种组织反应部位的淋巴细胞浸润（tumor infiltrating lymphocyte，TIL），即为宿主发生强烈肿瘤免疫的反映。
目前有大量的试验对冷冻免疫展开研究。冷冻术后，激发或抑制免疫功能两方面的报道均有：
（1）正向免疫反应：
Sabel等以BALB/c小鼠建立MT-901荷瘤模型，分别行冷冻及手术切除术，术后再以MT-901或RENCA细胞注射，观察瘤细胞再接种的成功率。结果发现冷冻组小鼠肿瘤生长率（16%）明显低于手术组（86%），并观察到：肿瘤引流区域淋巴结（tumor draining lymph nodes，TDLN）内有明显的肿瘤特异性T细胞免疫应答，NK细胞活动明显活跃；血清内IL-12、IFN-α水平升高；但也同时观察到脾脏内未见肿瘤特异性T细胞应答。Neel和Rittes等以诱发的小鼠乳腺纤维肉瘤为模型，分别采用冷冻及其他不同的处理方法，同时在肿瘤的远隔部位注射肿瘤细胞，观察不同处理组间的反应，结果发现冷冻组肿瘤生长率及大小远低于其他组。Roy等对冷冻和未经冷冻的纤维肉瘤的细胞膜抗原提取分析。电泳结果证实，冷冻后大分子（≥75kDa）抗原成分减少，而小分子蛋白抗原成分（14～24kDa）明显增加。冷冻细胞来源的抗原的免疫原性高于未冷冻细胞来源的抗原。Tsujino M等对Meth-A纤维肉瘤BALB/c鼠冷冻治疗后的脾细胞进行分离。发现冷冻后抗肿瘤免疫的效应细胞主要是巨噬细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）。巨噬细胞在冷冻后第十四天开始增加，IL-1、IFN和PGE2（prostaglandin E2）活性增强。冷冻也可以调控巨噬细胞的Ia抗原表达。Reddy KP等对猴的前列腺冷冻后的免疫反应进行了检测，提示冷冻后猴的细胞免疫反应增强。局部出现淋巴细胞浸润和免疫球蛋白抗体表达。Bagley DH等提示经冷冻处理的肿瘤细胞可以诱导特异性的T淋巴细胞的细胞毒作用。Kimura H等对动物体内外实验观察发现，冷冻处理和治疗的荷瘤动物的免疫功能较未处理及手术治疗的动物的免疫功能明显增高。Lubaroff DM等应用R3327鼠模型对前列腺癌冷冻后的抗肿瘤免疫反应进行研究。冷冻后移植物抗宿主免疫反应增强。冷冻靶区的抗原表达增强。刘剑勇等使用冷冻方法制成肝癌瘤苗，观察到经瘤苗激活的TIL在培养扩增后，对K562细胞的杀伤率均有明显提高，其中以培养扩增30天时为最高。经冷冻方法制成的肝癌瘤苗具有激活TIL杀伤K562细胞的能力。
（2）负向免疫反应：
并不是所有的研究都表明冷冻可以激活体内免疫系统，起到杀灭肿瘤的作用。Hayakawa等发现，原发肿瘤行冷冻治疗后，与手术切除组比较，再接种瘤细胞时，机体对其抵抗作用明显下降，瘤细胞接种成功率及生长、转移率增高。值得注意的是，Hayakawa所用的动物模型，也同样是化学诱发的纤维肉瘤，与Neel和Rittes所用的动物模型非常相似。同样Shibata等也发现小鼠纤维肉瘤施行冷冻术后，可促进转移瘤的生长，他们认为这种抗肿瘤免疫抑制可能与抑制性T细胞有关。
低温冷冻治疗免疫调节作用的可能机制为：
（1）超低温靶向治疗调控机体抗肿瘤细胞免疫反应：
Eskandari等发现，术后2周，冷冻组较对照组（在靠近肿瘤的部位进行冷冻）T细胞活性升高，但在4周时，两组却达到同样水平。由于在对照组也发生了T细胞活性的升高，目前尚不清楚是否冷冻是直接引起T细胞活性升高的因素。而张国强等分别检测10例肺癌患者术前、后不同时期的外周血T淋巴细胞亚群及血清免疫球蛋白的改变。结果表明：冷冻术后CD3 + 、CD4 + 、CD4 + /CD8 + 比值较术前显著增加，而CD8 ＋ T则显著减少。免疫球蛋白也显著增加。彭秋平等于肝癌患者中也观察到了CD3 + 、CD4 + 、CD4 + /CD8 + 类似变化，但CD8 + 细胞较术前则无明显变化。提示氩氦靶向治疗可以促进T淋巴细胞增殖，提高T淋巴细胞和NK细胞表达水平。东南大学附属中大医院吴培对28例接受氩氦刀治疗患者治疗前后T细胞亚群及CD8 + CD28 + T细胞变化进行观察，进一步证实氩氦刀治疗可以提高患者的细胞免疫功能。
Airoldi M等对口腔上皮细胞癌冷冻治疗前和治疗后1～2周，应用口腔上皮细胞癌抗原检测外周血白细胞特异性趋化反应，证实冷冻治疗可以刺激特异性细胞免疫反应。
段蕴铀等则发现：氩氦刀冷冻处理的肺癌细胞可以致敏树突状细胞（DC）。亦发现当联合IL-2时，可提高NK细胞及T淋巴细胞的抗肿瘤活性。目前关于树突状细胞相关冷冻免疫的研究已引起很多学者的兴趣，一项应用冷冻+DC细胞过继免疫治疗肿瘤的国际多中心临床研究正在进行。
（2）超低温靶向治疗调控机体抗肿瘤体液免疫反应：
路作新等体外检测了肺癌患者冷冻治疗前后不同时期，补体依赖抗体介导的细胞毒作用对自身肿瘤细胞的杀伤，并用根治切除肺癌患者做对照。发现术后3周冷冻组补体依赖的抗体介导的细胞毒作用较术前显著增高（ p <0.01），而单纯手术根治组则无差异。提出冷冻肺癌产生的这种特异性免疫杀伤的作用可能与冷冻暴露了肿瘤抗原，进一步刺激机体的免疫系统产生相关的抗体，由补体启动对肿瘤细胞的杀伤作用有关。
周平等通过人的肺癌细胞和自身淋巴细胞的体外混合培养，测定各组淋巴细胞转化率（LTR）及其培养上清液中可溶性白细胞介素2受体（SIL-2R）和白细胞介素6（IL-6）的表达，并用流式细胞仪（FCM）测定各组培养上清液对自身肺癌细胞增殖的影响。结果发现冷冻组LTR及其培养上清液中SIL-2R、IL-6的含量明显高于对照组（ p <0.01），冷冻组培养上清液对自身肺癌细胞的增殖有明显的抑制作用（ p <0.01）。认为冷冻肺癌细胞可促进淋巴细胞活化增殖、细胞因子分泌，激发机体的抗肿瘤免疫反应。
Washington等检测了肝癌患者肿瘤组织和血清肿瘤坏死因子（NF-κB）水平，提示在冷冻治疗后30分钟肝内NF-κB细胞因子明显激活，术后1小时肝内，血清NF-κB水平升高。2小时开始恢复正常。
氩氦靶向治疗肿瘤后，患者IL-2、IL-6、TNF和特异性抗体的水平变化，与冷冻靶区大小和时间的关系，及其对远期疗效的影响等问题，有待于临床深入的研究。
（3）超低温靶向治疗调控肿瘤抗原影响肿瘤的免疫逃避：
超低温和热疗可以调控肿瘤细胞的抗原表达对此已有较多报道。在氩氦靶向治疗肿瘤时，肿瘤组织细胞反复冻融、细胞破裂、细胞膜融解，从而促使细胞内和处于遮蔽状态的抗原释放。肿瘤细胞的坏死，使得肿瘤正常分泌的抗原停止分泌，肿瘤免疫抑制状态解除。国内外许多研究成果均已证明：肿瘤患者血清肿瘤标志物如CEA、AFP、PSA的水平可以反映肿瘤的增殖活性和患者的免疫抑制状态。当患者接受氩氦靶向治疗后1～2周，血清肿瘤标志物水平显著下降，它不仅用于评价和监测氩氦靶向治疗的疗效，而且也可用于评估患者的免疫功能恢复情况。东方肝胆医院钱国军研究证实，中晚期肝癌治疗后AFP、CEA、CA19-9血清水平明显降低。
在癌细胞被冷冻摧毁过程中，最低冷冻温度范围、冷冻率及细胞内冰晶形成的速度、冷冻时间的长短、复温的速度和循环次数等因素起着决定性作用。
（1）冷冻杀伤效应的温度范围：
冷冻温度越低，对靶细胞的破坏越多。王为等对6种口腔癌细胞冷冻的时间效应进行了观察。研究冻融后癌细胞不同时间的生存率改变，不同温度冷冻癌细胞后测定结果显示：-30～0℃细胞无明显损伤，-50～-40℃死亡率明显增加，达到40%～60%、-90～-50℃细胞死亡率未见明显增加。冻融后部分存活细胞的损伤无法修复，细胞死亡率随时间延长而缓慢增加。皮肤实验发现，局部低温范围-1～6℃，对组织及细胞无明显损伤，局部低温范围为-36～-35℃时，细胞可出现一系列冷冻的病理生理改变，导致细胞死亡。液氮系统低温导致细胞损伤的温度一般在零下-60～-50℃。在应用氩氦靶向手术系统进行动物实验时，分别用热电偶连续在坏死损伤区内和坏死损伤区外，即在坏死损伤区边缘上监测温度。证实氩氦靶向手术系统超低温细胞损伤的温度范围是零下-40～-38℃。提高了低温治疗的靶区范围和治疗效果。表13-2-2是文献报道的不同组织细胞的致死温度。
（2）冷冻率：
低温引起细胞内冰晶形成诱导细胞死亡的效应与细胞内冰晶形成的速度密切相关。冷冻越快损伤越大。Endocare的临床基础研究资料提示，细胞在-56～-40℃的范围内细胞内冰晶开始形成，细胞内外渗透压改变，电解质浓聚，细胞变性死亡。实验研究结果发现，当冷冻率为每分钟25℃时，温度从0℃开始下降到-40℃。在-15℃即可观察到一个突然增加的细胞死亡高峰。Chua等认为当冷冻速率很快时，细胞死亡率甚高（细胞内冰晶形成起主要作用）；而当冷冻速率减缓时，细胞死亡相应减少，但当速率进一步减缓时，细胞外冰晶形成起主要作用，细胞死亡又再度增加。因此，在冷冻过程中，探针周围区冷冻速率快，细胞死亡多；离探针稍远处，冷冻速率减缓，则细胞死亡减少；离探针再远处，冷冻速度进一步减缓，细胞死亡又再增加；最终，到冰球边缘处，温度为0℃，细胞死亡又再度减少。
表13-2-2 单次冻融循环对不同组织细胞的致死温度
如何提高冷冻率是低温治疗设备技术研究的关键。冷媒的冷冻率受冷媒流动压力、阻力、传导及回收方式等因素的影响。氩氦靶向治疗系统用气体冷媒取代了液体冷媒，成功地解决了长期困扰冷冻治疗医学发展的关键问题。
（3）冷冻时间和循环次数
1）冷冻时间的作用：
动物试验表明，当细胞冷冻温度达到一定范围后，细胞损伤程度与冷冻持续时间呈正相关。单个细胞冰晶的形成也可能导致一种被称为重结冰晶的现象。在重结冰晶过程中，个别冰晶聚集形成更大的冰晶，最终压迫细胞，导致进一步损伤。体外细胞学试验观察到当癌细胞-40℃冷冻后，细胞死亡率随时间延长而有所增加，8小时达60%～85%，24小时达84%～94%。陈立华等对-70℃深低温冷冻的视网膜色素上皮细胞（RPE）形态及超微结构进行观察，细胞分别冷冻15秒、30秒、45秒、60秒、120秒后，应用相差显微镜、扫描及透射电镜观察可以发现：冷冻使细胞变圆皱缩，细胞间隙加宽，细胞连接断离，细胞膜双层结构改变，部分细胞的细胞膜破裂。并证实冷冻导致RPE细胞间连接断离与冷冻时间有关，冷冻超过60秒可使细胞破裂。应用氩氦靶向手术系统进行动物实验时，分别用热电偶连续在坏死损伤区内和坏死损伤区外及零距离边缘上监测温度。证实氩氦靶向治疗肿瘤时，氩气超低温持续治疗时间以15～20分钟为宜，手术治疗后24～48小时病理检查可以提示细胞不可逆性损伤坏死过程。由于不同组织间的含水量不同，细胞生物学特性的差异，不同器官肿瘤冷冻治疗的最佳时间有一定的差异。
2）多次冷冻-复温循环的作用：
Crycare TM 氩氦靶向手术系统与常规冷冻设备的另一个显著特征是在双次冷冻中，引进了氦气升温系统。使得低温治疗中多次融冻循环成为可能。在多次融冻循环中，第二次冷冻所致损伤的机制与第一次相同，但暴露于脱水及重脱水循环的细胞将明显增加冷冻手术的破坏性作用。Thomas B.Edmunds Jr等对动物肾脏的单次和双次冷冻效应进行了测试，把热电偶连接在一系列距离的位置上［平均至冷冻探针8mm（3～17mm）］，除此之外，热电偶至坏死区边缘［平均3mm（0.6～7.8mm）］或损伤区边缘［平均2.9mm（0.6～7.8mm）］所测得温度作为结果，最低温度与至边缘距离的关系以线性功能为成功模型。以线性回归分析为基础，证实：单次冷冻组织细胞坏死的关键温度是-61.7℃（95%的置信区间是-74.5℃至-48.9℃），双次冷冻组织细胞坏死的关键温度是-41.4℃（95%置信区间是-49.9℃至-33.0℃）。Delwor和Orihuola等报道了成功地进行患者肾的开放性冷冻手术和前列腺冷冻手术。他们进行了双次冷冻一融化循环和单次冷冻/融化循环的比较。术后CT扫描显示急性坏死。组织病理学检查显示由单一探头所致的双次冷冻循环产生的坏死区比单次冷冻明显的增大。双次冷冻中位数13%（8%～20%），而单次冷冻中位数4%（0%～12%）。冷冻手术探头附近可见一致的凝固性坏死。应用热力学第一定律模型，分别评估单个探头单次及双次冷冻产生的坏死区半径。提示：由于双次冷冻，冷冻消融术在较低的温度下完成，因此坏死区的半径大于单次冷冻。这一结果与病理组织学所测的坏死区相一致。
（4）复温方式：
缓慢复温是否比快速复温能取得更好冷冻效果、采取自然复温还是强制复温（探针加温）、复温的温度以多少为宜等问题目前尚无一致看法。一般认为缓慢复温、探针加热复温可增加靶细胞死亡率，但亦有人认为自然复温优于强制复温。
（5）热池效应对冷冻的影响：
低温组织热动力学分析结果提示，冷冻分布区域内组织器官的血管分布，血管直径大小，血流速度等热循环指数可以影响冷冻冰球的形成和分布。动物实验冷冻后病理检查显示，冰球组织的微血管内血栓形成，肿瘤内供瘤血管栓塞血管壁断裂。但冷冻靶区边缘靠近大血管处，由于血液循环的热效应，即血管的热池效应抵抗了冷冻效应。临床医学专家SuzyChosy、Peter Littrup等来华报告的研究资料显示大血管周围的肿瘤组织细胞坏死但血管壁并没有明显损伤，提示了本项治疗的安全性。另一方面也提示我们，靠近大动脉血管边缘的肿瘤，实施氩氦靶向治疗时由于热池效应的存在，靠近大血管的冰球边缘的温度可能已经接近组织坏死温度，可能是肿瘤靶区的坏死边缘，需要在手术中监测。临床治疗时冰球边缘温度受不同组织血流热池效应的影响，如果监测不当可能成为手术残留和复发的常见部位，因而强调冰球边缘超过肿瘤靶1～2cm，是手术中应该注意的重要问题。肿瘤包绕大血管时，在测温探针的监测下，可以实施从周围向中央的冷冻方案。有国外作者提出当动脉血管直径大于4mm时，不会造成对血管的冷冻损伤。由于不同条件下血管的热池效应有所差异，目前的报道多属个案，尚没有准确数据和经验可供选择。临床治疗靠近大血管周围的肿瘤时，需要慎重在严密的监控下进行。
（6）靶组织的冷冻生物学特性：
肿瘤组织间液及含水量的多少，组织细胞类型，纤维结缔组织的密度将影响冷冻的效果，如肺脏为气体交换器官，组织间的气体将影响低温冷效应的传导。冰球在肺脏形成的速度和大小不同于肝脏，肾脏和脑组织。脑组织间液含水量较多，冷冻范围大于其他器官组织。由于脑内重要的神经中枢较多，治疗时应严格进行靶区监测。同时冷冻消融早期的炎症变性坏死过程，可能在早期影响颅内压的变化，治疗应根据不同组织器官特点，进行临床观察。有作者认为由于组织的生物学特性所导致的差异一般在10%以内。低温治疗的基础研究目前尚在探讨和研究不同脏器组织的冷冻变异系数。临床治疗中为了精确地控制冷冻范围，需要特别强调测温探针的使用。尤其在脑肿瘤、肾肿瘤、肝门区肿瘤、胰腺肿瘤、盆腔肿瘤等重要解剖和功能部位的肿瘤的治疗中，需要术前认真做好三维计划，术中精确监测和定位。
目前大部分冷冻消融系统利用“焦耳-汤普森效应”的原理来制冷，并使用“氩气-氦气”的“冷-热”转换系统，即氩气快速降温-140℃至-180℃形成冰球，根据病灶大小选择维持时间，一般3～15分钟；氦气快速升温至30℃左右，维持1～2分钟。
冷冻消融系统的主系统包括装载系统硬件和操作软件的系统主机，一般支持同时连接多个探针。
主控制面板通过标准计算机监视器由键盘鼠标或触摸板控制进行操作，方便输入患者信息和选择、观察、监控治疗参数。使用者通过主控制面板选择温度和时间以实现消融；术中显示每个探针的状态（关闭，冷冻，解冻和黏附）；适时的温度和时间监控。
附件有连接氩气、氦气的连接器；集成超声；USB端口和一个以太网端口；旋转脚轮方便移动等。
冷冻消融系统由工作系统、控制系统、冷冻探针、测温探针、治疗计划系统及其他附属设施等组成。制冷系统为氩气工作系统，启动压力至少为217.9kg/cm 2 ，针尖的温度可在60秒内迅速降至-120℃以下，冷冻功率可通过调节氩气压力输出进行调节，氩气制冷区域局限在探针尖端，刀杆有热绝缘性，可减少穿刺路径的冷损伤；制热系统为氦气工作系统，启动压力一般为152.5kg/cm 2 ，针尖温度60秒升至30℃；治疗计划系统可模拟显示穿刺位置、冰球覆盖范围和治疗效果，方便制订穿刺和消融方案，且能自动模拟冰球形成的范围。
冷冻策略：
1.一个冷-热循环为制冷15～20分钟和制热3～5分钟，在肿瘤氩氦刀冷冻消融治疗过程中一般采取2～3个循环。氩氦刀探针的快速降温和快速复温可加重肿瘤细胞损伤，通过多次循环即可扩大冷冻范围，也可增加冷冻疗效。在冷冻过程中，需要利用影像设备（超声、CT或MRI）针对冰球范围进行实时监测，避免损伤邻近重要结构，必要时可利用水隔离和空气隔离技术进行隔温保护。
2.冷冻消融需要根据病灶形态进行适形布针，达到肿瘤的适形消融。不同型号的冷冻探针可形成不同的冰球范围和形状，如IceSeed直径1.47mm的17G探针，经过2个循环的冷冻后，在胶内形成<-40℃的范围为10.5mm×19mm，<-20℃的范围为19mm×26.5mm，<-0℃的范围为31mm×36mm；IceRod直径1.47mm的17G探针，经过2个循环的冷冻后，在胶内形成<-40℃的范围为16mm×41mm，<-20℃的范围为27mm×50mm，<-0℃的范围为40mm×58mm；同样的条件，IceBulb形成<-40℃的范围为17mm×48mm，<-20℃的范围为28mm×55.5mm，<－0℃的范围为40mm×67mm。
3.多根冷冻探针组合可形成形态不同、范围更大的冷冻区域。在维持功率不变的情况下，多针组合效率更高、冷冻区域更大。在肿瘤消融过程中，可根据病灶的形态、位置及毗邻结构，选择不同型号、不同数量的冷冻探针进行适形冷冻。
确定手术方案后，应向患者说明手术过程及对机体的影响和有关反应。以解除患者对手术的恐惧和不安，说明术前、术中、术后应注意的有关事项，术中应如何配合，建立医患之间的亲密信任关系，树立战胜疾病的信心。并对一些可能发生的并发症简要说明。对家属及单位术前谈话签字要耐心，实事求是地介绍病情，手术的必要性和手术方案，术中、术后可能发生的困难、并发症、危险性甚至死亡等有关问题，使患者对手术有一全面的了解，取得患者及家属的信任和合作，从而避免发生不必要的医疗纠纷。
对于需要择期手术者，给予必要的支持和营养治疗。如纠正低蛋白血症、贫血、水电解质、酸碱失衡、保肝、改善凝血功能等。局部诊断欠明确者，术前应在B超或CT定位下经皮穿刺活检确定诊断。做好家属及患者本人的解释及心理准备工作，客观地评价手术疗效及术中术后可能出现的各种并发症，避免发生医疗纠纷。手术前后12小时禁食。术前应常规手术讨论，严格掌握手术适应证，评估术中困难及术后各种并发症及处理，并制订好手术后整体综合治疗方案。
常规检查胸片、腹部B超、CT或MRI、肝肾功能、传染性标志物、凝血酶原时间、肿瘤标志物、血型、血糖、心电图、血、尿、便三大常规等，以利于对患者伴发疾病有一个全面的了解，完善诊断，并做出相应的评估和处理，以确保手术的安全性。
明确诊断并肯定为手术适应证者，应进行术前讨论，讨论中可以有放射、CT科室医师参与，以充分了解、明确影像资料中所显示的肿瘤及周围组织结构的三维立体解剖关系。初步讨论制订一合理、完整的冷冻手术方案，并制订出术中、术后可能发生并发症的应对措施。在此基础上于术前一天或手术前行CT定位扫描，具体定位方法如下：依据B超、CT及X线影像学所显示的肿瘤大小、形态及与周围脏器、组织结构的关系，经全面比较，仔细测算确定氩氦刀介入瘤体的层面以及在同一层面和不同层面内介入氩氦刀的型号、数量和方位，并最终确定氩氦刀头端进入瘤体内的靶点。如肿瘤较大可用以3mm冷刀为主的多刀组合冷冻方案，周围情况允许时，选用5mm冷刀冷冻效果更好。设计原则要求多刀组合冷冻所形成的冰球应尽可能将瘤组织包容其内。冰球冷冻范围应大于肿瘤边缘1cm（具体参照第四节冷冻消融靶区设计）。肿瘤邻近重要组织结构部位时，应该确定测温探针的位置以监控靶区的界限。确定瘤体消融靶点后，确定体表皮肤穿刺进针点。皮肤穿刺点选择以手术操作方便，易于呼吸监测管理，穿刺针经过正常组织的路径最短为基本原则。靶点与体表进针点所连直线即为穿刺针、氩氦刀进入靶点所经过的路径。路径内应避开神经，主支气管、心包及大血管。所有设计的体表进针点和瘤内的靶点确定后，在CT或B超定位片上分别测量显示出各点的进针方向、进针深度和进针角度。并根据定位的坐标数据，在患者体表上分别测量确定穿刺进针点位置，在进针点皮肤上粘贴一金属或塑料标记，再次经扫描显示标记物所在的方位与设计要求一致时，则标记物所在点即为穿刺进针点。用龙胆紫和碘酒溶液在皮肤上着色做出标记，供术中参考。
CT引导需要与CT室预约，并安排好气体搬运和固定，CT室配合及消毒。超声引导需要检查超声诊断装置，线阵实时超声成像或扇形实时成像仪均可选用。合适的仪器应具有在显示器上能显示出可提供穿刺方向的引导线，并能改变入射角角度使引导标记线达到最佳方位。穿刺探头：专用穿刺探头可分为侧进式和中央槽沟式二类。合适的穿刺探头装有引导器和角度调节装置。普通探头装置一个附加器，同样可应用。穿刺针：可选用套管针，针长18～20cm，外径<2mm。穿刺消毒包可用常规的小手术包。亦可按穿刺需要的规格进行打包，内容应包括：弯盘一个，小方巾8块。棉垫2块，纱布3～4块，巾钳4把，蚊式血管钳1把，小量杯1只，2ml、5ml、10ml、20ml针筒各1副，6号、7号针头各1个，刀片、刀柄各1把，镊子1把，钢皮尺1把，小砂轮1只，橡皮片3～4片，其他视需要而增添。消毒超声耦合剂宜用水溶性高分子材料组成的耦合剂，生理盐水也可应用，含石蜡的耦合剂能侵蚀硅橡胶探头故不宜采用。穿刺探头消毒：一般穿刺探头可用气体熏蒸消毒法；特殊穿刺探头由于体积小密封性能好，可浸泡在1：1 000新洁尔灭、洗必泰溶液或酒精中消毒。用过的探头可用水或酒精纱布擦去污染再行消毒。
由于经皮穿刺冷冻消融治疗需在CT或B超引导下定位，实时监测下进行手术。所以麻醉方式的选择，应注意安全性、有效性，冷冻本身有止痛作用，多数医生采用局部浸润麻醉，基础麻醉加局部浸润麻醉，部分患者可给予辅助性用药，如异丙嗪、哌替啶或地西泮肌注，均可满足手术需要，术中患者无疼痛不适。对于手术中联合使用多刀及巨大肿瘤治疗时也可采用全身麻醉。
为防止麻醉意外发生，术中应备好气管插管、吸痰管、吸引器以备抢救。术中持续吸氧，心电监护。
手术前将冷冻消融针插入装有生理盐水的容器内，启动氩气和氦气系统，观察温度和显示刀尖的冷冻及复温情况。检查确认冷冻消融系统运行正常。患者术中所取体位可根据手术需要采用平卧位、侧卧位或俯卧位。所取体位以能满足手术需要为原则。同时应兼顾呼吸管理、监测方便。
常规消毒手术野，铺无菌大单，检查所选用器械准备情况。0.5%的利多卡因10～40ml于穿刺定位点行局部浸润阻滞麻醉。壁层胸腹膜应予浸润麻醉，以免穿刺时患者有疼痛反应。分别于穿刺点处切开皮肤0.5cm，用止血钳经切口扩张针道所通过的胸、腹壁软组织，以利于扩张管及鞘顺利引入，依据术前CT定位片所提示的进针方向、进针角度、进针深度，在CT导引下将穿刺针缓缓刺入肿瘤设计靶位，直到CT显示穿刺针留置瘤内的方位、深度满意为止。退出针芯，沿穿刺针孔插入导引钢丝，退出穿刺针。根据所选用氩氦刀的型号而选用相同规格的扩张管及导管鞘，并依据所确定的进针深度，精确地将扩张管、导管鞘，通过导引钢丝插入瘤内。退出导引钢丝及扩张管，导管鞘原位保留。沿鞘精确地将氩氦刀缓缓地插入瘤内。固定氩氦刀，根据靶区大小计算出鞘退出的长度（一般为5cm以上）。此时如整个冷冻过程仅需一把刀冷冻，则直接启动氩氦超低温手术系统冷冻。如同时需插入2把以上氩氦刀，则将已插入的氩氦刀暂时冷冻固定（STICK）。再将所需插入的氩氦刀按前述方法逐一插入瘤内设计靶位。检查、校对所插入氩氦刀的进入深度、角度无误，同时启动超低温手术系统所需冷冻的氩氦刀。如此可以确保多刀冷冻的同步性。快速冷冻，屏幕立即显示温度下降的实时动态变化。
冷冻1分钟内，温度下降达-145～-10℃为正常治疗范围，随着冷冻时间的延长，温度逐步下降并恒定在-145～-100℃区间内略有波动。一般冷冻时间为15～20分钟。停止冷冻后，启动加热氦气系统，当温度上升至0～10℃重新启动氩气超低温系统，实行第二循环冷冻，冷冻时间同首次循环。再次启动加热系统，当温度上升至15℃左右，氩氦刀与冰球松动后即可退出氩氦刀。肿瘤较大者，一次冷冻不能全部包容肿瘤组织，根据靶区设计退刀3～3.5cm后，再次冻融二循环，使肿瘤组织完全包容于冰球之内，理论上冰球应大于肿瘤边缘1cm，冷冻效果较理想。否则瘤细胞残留较难避免，将直接影响冷冻效果及预后。冷冻完成后针道内填入明胶海绵条或止血绫，以达止血和填充针道的目的。氩氦刀退出后残留针道多无明显出血。如有少量渗血，压迫数分钟血止即可。无菌纱布覆盖包扎创口。手术后常规行CT或B超扫描可显示肿瘤冷冻组织呈低密度影像改变。并可检查冷冻效果及有出血、气胸等，以利术后及时处理。
在临床治疗中，由于肿瘤的部位、大小、三维立体形态以及周边关系的不同，每一个患者治疗方案也必然不同。因此必须强调适形治疗方案的个体化。每个患者必须有一套完整的手术设计方案。在一些特殊部位进针深度设计要求以毫米计算。手术成功的关键除治疗计划设计的合理、完善外，手术操作者的经验、操作的熟练程度及操作的精确性最为重要。测温探针在一些肿瘤经皮穿刺靶向治疗中可不做常规使用。但在一些特殊部位需严格控制冷冻范围，防止重要脏器冻伤也可以置入测温探针，监测所界定的重要脏器不会冷冻损伤，有效避免术中、术后并发症的发生。其介入方法与氩氦刀介入方法相同。需在术前CT定位确定体表进入点、进入方向、角度及进入深度。术中穿刺也必须在CT导引下实施。测温探针的介入同样需要精确性，否则失去监测意义。
肿瘤组织由于含血量丰富，手术中出血、挤压是造成手术后早期转移的原因之一，因而如何减少手术中出血和坚持无瘤手术操作规程一直为外科医生所关注。氩氦刀靶向治疗系统具有操作简便，超低温冷冻组织速度快、损伤小、不出血等特点。因而国内外已开始报道用于脑膜瘤、脑胶质瘤、肝癌等摘除。有研究资料表明手术切除前对肿瘤组织进行冷冻，可以减少手术中出血，防止术中肿瘤细胞扩散，有利于根治性切除。氩氦刀靶向治疗系统手术中定位准确，术中B超监测方便，对于实体肿瘤手术切除前对肿瘤组织进行超低温冷冻，瘤组织在冷冻状态下被切除是目前较理想的无瘤手术方法。同时有临床报告资料显示，术前对肺肿瘤组织实施冷冻，术后可以明显提高肺癌患者的免疫功能。与没有冷冻切除的对照组相比，患者转移和复发率降低，而存活期延长。其细胞免疫学机制有待深入研究。
肿瘤手术切除已成为目前临床首选治疗方法。然而手术创伤大，目前80%以上的肿瘤患者入院确诊时已失去了常规根治手术治疗的机会。其中常见的原因有：患者肿瘤负荷较大，肿瘤转移，常规切除将影响脏器的正常功能；患者的身体状况或心肺等功能不能承受大的创伤性（开胸，开腹）手术。因而以彻底灭活肿瘤细胞消除肿瘤负荷为目的的微创局部物理消融治疗手段可以为肿瘤临床提供新的选择。在局部治疗中手术疗效确切但损伤大，局部药物注射和介入治疗虽然损伤小但疗效没有微创局部消融疗效好。氩氦靶向治疗系统对患者的创伤小，恢复快，治疗肿瘤多数不会对脏器的正常功能造成严重影响，可以在B超、腹腔镜、胸腔镜的引导下开展微创外科手术治疗，也可以在B超、CT、MRI、X线模拟定位机及X线透视引导下经皮穿刺实施靶向冷冻治疗。2007年北京第14届世界冷冻治疗大会上美国、日本及中国的氩氦刀专家提出：对于2～10cm没有远处和周围淋巴结转移的实体肿瘤多数可以根治性靶向冷冻，即通过氩氦刀超低温冷冻将影像学显示的实体肿瘤完全摧毁，冷冻冰球边界大于肿瘤影像学边界1cm。对于局部无全身广泛转移的原发性肿瘤，较为局限的脏器转移性实体肿瘤，常规手术不能耐受或不愿接受时，氩氦靶向超低温冷冻治疗将成为较理想的治疗手段。
美国Graves教授提出对于小于2.5cm的早期肿瘤也可以进行氩氦刀靶向治疗。由于氩氦靶向超低温冷冻治疗不需要剥除冷冻后的肿瘤组织，手术操作简便，患者术后并发症少，多数不影响其他综合治疗措施的选择。在如何选择肝癌微创手术方式上日本东京KEIO大学Go Wakadayashi和Winorutanabe教授的经验是：首先选择经皮治疗，再选择经腔镜引导或小切口手术中局部治疗；在局部治疗中不同治疗方法适应证不同，微波（MCT）适用于2cm以下的肿瘤；射频（RFA）适用于3～4cm以下的肿瘤；氩氦刀适用于2～10cm范围的肿瘤，并可以进行手术中监测，而且残留率较低，适用于大多数中晚期实体肿瘤的治疗。
（1）根据病灶位置，选择患者体位（仰卧、侧卧或俯卧位），在保证合理穿刺途径情况下，使患者处于舒适体位以配合长时间手术。
（2）由于冷冻消融对血小板消耗较大，且冰球溶解后病灶及邻近正常组织易出血，因此如患者术前凝血功能差，需在术前输注血浆或维生素K等，并在术后进行止血药物应用。
（3）冷冻探针的适形分布对肿瘤治疗的效果以及并发症的预防至关重要。在穿刺过程中，建议采取步进式进针，并进行实时影像学监测扫描观察进针角度和深度，根据肝脏和病灶形变情况进行实时调整，可采用差时冷冻策略进行治疗，消融过程中实时监测冰球涵盖范围。
（4）避免过度消融或消融不足，消融范围需根据患者综合情况决定。3cm以下结节肿瘤消融范围一般达到肿瘤体积110%～120%，较大肿瘤（3～5cm）一般达到100%，巨大肿瘤（大于5cm）可行减瘤手术或分次手术。
（5）邻近重要结构肿瘤病灶可在术前、术中进行三维重建规划消融区域、观察消融范围，明确肿瘤与邻近重要结构的关系。穿刺过程中应避免穿透较大血管、胆管等重要组织结构，造成大出血、胆瘘等严重并发症。当病灶靠近膈肌时活动度较大，须在穿刺前对患者呼吸配合进行指导训练，也可在导航下根据呼吸门控装置引导下穿刺。
（6）冷冻消融治疗前、中、后信息应完整，记录冷冻功率、时间和冰球大小，疗效评判及随访结果应参照国际消融规范化术语标准。
（7）冷冻消融术中应针对患者实施保温措施，如铺垫恒温毯、穿刺点局部使用无菌热水袋等，避免冷休克和局部皮肤冻伤；较大肿瘤冷冻消融术后冰球短时间内难以融化，在搬动患者时需避免幅度过大，造成冰球与正常组织产生撕裂损伤导致大出血。
冷冻消融治疗肿瘤的适应证较广，主要应用于全身各种实体肿瘤。包括肝癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、骨骼的良恶性肿瘤、肾上腺癌、脑膜瘤、胶质瘤、子宫肌瘤、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、乳腺纤维瘤，以及用于癌症止痛治疗等，目前最常用的是肝癌和肺癌。冷冻消融治疗肿瘤技术可用于治疗失去手术时机的晚期癌症；多中心发生，难以完全切除的肿瘤；放化疗效果欠佳的中晚期肿瘤；手术、放疗、化疗等治疗后复发的肿瘤；负荷大，累及大血管、重要器官的肿瘤；高龄、器官功能差、全身状况差难以耐受手术与麻醉的患者；有较重局部症状的中晚期肿瘤等。
目前比较公认的禁忌证为：①弥漫型癌肿；②全身广泛转移伴大量胸腹水者；③肿块定位引导穿刺困难，消融治疗术后可导致严重并发症患者；④明显恶病质，心肺肝肾等重要脏器功能不能承受消融手术或有出凝血功能异常者；⑤中晚期广泛浸润生长的空腔脏器肿瘤，如胃癌、肠癌、食管癌等。
目前外科治疗仍然是临床上大多数肿瘤的首选治疗方法，部分患者虽然肿瘤属于早期，但身体状况无法承受常规手术治疗。大部分患者明确诊断时已属中晚期，由于患者的肿瘤负荷大，病灶多，分布于多个部位；或者因为患者心，肺，肝，肾等脏器功能无法承受手术；因而使70%～80%以上的肿瘤患者入院时已失去了常规手术根治切除的机会。由于氩氦靶向治疗技术的精确控制和靶向摧毁肿瘤的临床疗效，使得一些失去了常规手术根治切除机会的肿瘤患者重新获得微创外科治疗的机会。美国加洲大学戴维斯肿瘤外科Graves教授对于250例中晚期不能承受常规外科切除的肝癌患者，实施手术联合术中氩氦靶向治疗，并与常规外科手术临床治疗组进行对照分析。提示治疗后两组患者的局部复发率，远处转移率和术后生存期无明显差异。石家庄市第一人民医院安永辉等应用氩氦刀治疗中晚期肿瘤250余例，其中非小细胞肺癌66例（常规手术Ⅰ～Ⅱ期肺癌28例；氩氦刀治疗中晚期肺癌Ⅲ～Ⅳ肺癌38例，随访一年有效率，中晚期肺癌氩氦刀治疗组一年存活率为84.38%，而常规开胸手术切除的早期肺癌组则为76.67%。日本东京Keio大学医学院在北京2002国际肿瘤靶向治疗论坛报告氩氦刀治疗中晚期肝癌42例，肿瘤治疗完全消融率达到92.2%，共治疗肝癌病灶85个，治疗后完全消融率达到96.5%。对于第一次治疗后复发的病灶，二次治疗可以100%消融。中国人民解放军总医院第六医学中心段蕴铀、王洪武等应用氩氦刀治疗肿瘤300余例，其中肺癌182例（Ⅰ+Ⅱ24例，Ⅲa 22例，Ⅲb 56例，Ⅳ 80例）；肿瘤直径（3.8±0.3）～（6.3±0.3）cm。对不同临床阶段的肺癌治疗有效率达到75.0%～91.3%。张宗城治疗Ⅲ～Ⅳ期肺癌40例。肿瘤<3cm消融率为90%～100%，治疗CR+PR有效率为80.6%～100%。
宋华志等完成氩氦刀手术700次，其中治疗肝癌203例、肺癌105例、直肠癌术后局部复发18例、腹壁转移癌7例、肝血管瘤8例、四肢血管瘤9例、前列腺增生23例、前列腺癌7例、颈部肿块7例、锁骨上淋巴结转移7例、腮腺癌2例、上颌窦癌9例、宫颈癌5例、肾肿瘤6例、肾囊肿1例、输尿管肿瘤1例、胸腺瘤5例、软组织肉瘤13例、胸壁肿瘤6例、乳腺癌12例、盆腔肿瘤20例、卵巢囊肿1例、子宫肌瘤4例、腹腔肿瘤3例、唇纤维瘤1例、肝囊肿3例、舌癌2例、腹股沟区肿瘤4例、甲状腺肿瘤1例、喉癌1例、筛窦肿瘤1例、肾上腺恶性淋巴瘤1例、胰腺肿瘤8例。治疗的适应证包括实体肿瘤和实体良性增生性疾病，均取得了良好的临床疗效。1999—2003年氩氦靶向肿瘤外科技术迅速在美国300余家医院普及应用，威斯康星大学外科专家提出肝脏肿瘤数目在4个以内均可实施氩氦靶向手术消融治疗。复旦大学附属华山医院肝癌研究所专家提出氩氦靶向手术消融治疗可以作为不能耐受手术切除早期肝癌患者治疗的一种选择。一些作者应用氩氦靶向消融联合外科手术切除，使外科治疗能更大程度上保护脏器组织功能，减少手术创伤，提高了肿瘤外科治疗后患者的生活质量。尽管长期生存率尚待进一步临床观察，但此技术目前已取得显著的临床疗效，并应用于肝癌、胰腺癌、肺癌、颅内肿瘤、妇科癌症、乳腺癌、肾癌、前列腺癌等中晚期肿瘤的外科治疗。目前国内应用美国氩氦靶向手术系统——氩氦刀治疗中晚期肝癌、肺癌、脑肿瘤、胰腺癌、前列腺癌等实体肿瘤，已取得了成功的临床经验。一些医院的治疗效果已经并达到国际先进水平，得到国际同行的承认。
氩氦微创靶向治疗促进了肿瘤微创外科技术的进展。腔镜和内镜技术的发展为微创外科治疗奠定了基础，使传统外科在一些疾病的治疗方面遭到挑战。冷冻探头的插入式和针式演变，使微创外科不仅仅是小切口，而且能达到靶向摧毁肿瘤和最大限度地保存正常组织器官功能。国内外应用腹腔镜引导下氩氦靶向治疗肝癌、胰腺癌、肾癌、盆腔肿瘤，胸腔镜引导下氩氦靶向治疗肺癌均已取得了成功的临床经验。与传统开腹、开胸冷冻治疗相比较，氩氦靶向治疗技术具有损伤小、痛苦小、恢复快、可重复多次治疗等优越性。但术中对肿瘤及冰球的监测不如开放式手术准确，可能导致靶区选择不够准确，在治疗中需要制订周密的手术前计划及进行手术中精确地监测。传统的液氮冷冻，由于冷冻探头较粗，绝缘性差，冷冻测温误差大，冷冻初期在刀头结冰阻碍了超低温向深部组织扩散。因而靶向摧毁的范围小于氩氦靶向治疗系统。由于氩氦超导手术系统探头较细并且可选择范围大，治疗适应证广，在国外目前已得到广泛使用。除位于肝顶部，紧靠横膈、大肠、大胆管的癌肿不适合经皮冷冻治疗外，国内在B超、CT及腔镜引导下经皮穿刺氩氦靶向治疗直径10cm以上的肝癌、肺癌、腹腔及盆腔等肿瘤已获得成功。张世忠、张积仁等首先在国内建立了立体定向引导经皮穿刺氩氦靶向治疗脑肿瘤技术；汪森明、张积仁等首先在国内建立了B超和CT引导经皮穿刺氩氦靶向治疗肝癌技术；武清、张积仁等首先在国内建立了X线，CT引导经皮穿刺氩氦靶向治疗肺癌技术；李简、郑洪拄等首先在国内建立了胸腔镜引导氩氦靶向治疗靶向肺癌技术；宋华志、张玉星等首先在国内建立了B超或CT引导经皮穿刺氩氦靶向治疗直肠癌、肝血管瘤、前列腺增生、宫颈癌等治疗技术；张宗诚等建立了氩氦靶向治疗盆腔肿瘤新技术；安永辉等在国内首先开展了氩氦靶向治疗喉癌、上颌窦肿瘤。经皮氩氦刀靶向治疗；腔镜引导氩氦刀靶向治疗及其小切口术中氩氦刀靶向微创治疗技术日益成熟，将为更多不宜常规外科手术、不愿接受常规手术治疗的肿瘤患者提供有效的治疗手段。部分国内外专家提议氩氦刀微创治疗肿瘤目前应该列入不能手术的中晚期实体肿瘤治疗的第一选择，也有部分国外专家认为氩氦刀微创治疗同样适用于早期不愿意接受手术切除的实体肿瘤患者的治疗。
氩氦微创靶向治疗提高了中晚期肿瘤综合治疗效果。手术放疗、化疗及免疫基因治疗作为肿瘤治疗已取得了很大的进展，但是除手术外，放疗、化疗及免疫基因治疗肿瘤临床效果尚不满意。对于不能承受手术的中晚期肿瘤患者如何快速消除肿瘤负荷，提高生活质量，是近年来物理治疗的研究重点。如射频、微波、激光、超声聚焦、立体适形放疗、组织间植入放疗和插入式X线刀放疗等。氩氦靶向治疗的一个显著临床特点是可以快速摧毁肿瘤组织，在国内已广泛应用于肝癌、肺癌及实体肿瘤的治疗。汪森明等应用经皮穿刺氩氦靶向治疗150例原发性肝癌和肺癌；武清等治疗了250例肝癌和肺癌并用于平滑肌肉瘤，表浅肿瘤的治疗；张玉星、宋华志等治疗各种不同类型肿瘤700余例；王洪武治疗300余例肺癌、肝癌；张宗城、安永辉等治疗300余例实体肿瘤；姜良进等治疗80余例肝癌并首次用于鼻咽癌的治疗；郑宏拄等在胸腔镜引导下治疗肺癌40余例，并首次用于骨肿瘤的治疗。2～10cm的肿瘤多数可一次手术达到局部治疗目的，大于10cm的肿瘤可分次手术治疗或联合放疗、化疗、中医药治疗和免疫基因治疗。东方肝胆外科医院吴孟超院士、钱国军教授采用美国氩氦刀靶向治疗联合术前、术后动脉栓塞化疗治疗中晚期肝癌，加强对亚临床病灶的综合治疗效果，减少局部肿瘤的复发，延长患者的生存期。广州军区武汉总医院采用氩氦靶向治疗联合放射治疗中晚期肺癌、肝癌。氩氦靶向消除肿瘤负荷后，联合放射治疗亚临床病灶，不但缩短了常规放射治疗的疗程，而且降低了放射剂量，扩大了放射治疗的适应证，减少了放疗并发症，提高了患者的生活质量。张世忠、郑宏拄等采用氩氦靶向冷冻等体积摘除巨大脑膜瘤、脑胶质瘤，立体定向引导经颅骨穿孔氩氦刀治疗脑肿瘤30余例，不但缩短了手术时间，而且减少了术中出血和术后复发。邓晓军、李振洪等报告了12例伴有门静脉癌栓及腹水的巨块型原发性肝癌患者，术中氩氦靶向治疗同时，采用肝动脉和门静脉植管化疗，取得了较好的治疗效果。氩氦靶向治疗对患者损伤小，患者术后恢复快，术后放化疗可提高了综合治疗效果。牛立志、徐克诚教授等采用氩氦刀靶向治疗联合中药和生物疗法治疗肺癌开创了肿瘤临床治疗的新模式。我国的多中心临床报告提示，对于由于术中影像学监测和靶区控制不准而造成术中残留的患者，重复氩氦靶向治疗和术后综合治疗尤其重要。大于10cm以上及靶点选择困难部位的肿瘤，多数专家认为氩氦靶向治疗术后动脉灌注或全身化疗更有利于提高疗效。氩氦靶向治疗提高了中晚期肿瘤综合治疗近期效果已得到临床肯定，远期疗效有待进一步多中心临床随访和总结。
（范卫君 张 浩 彭丽静）