第八节
芯片上的实验室、微/纳米免疫检测系统、微阵列芯片

本书“免疫检测产品技术”部分（该部分未译，有兴趣的读者可参考原书——译者注）介绍了市场上许多不同的商业化的免疫检测系统，所使用的仪器尺寸包括从落地式的实验室分析仪到紧凑的床旁检测（POC）设备。最早的POCT测试是基于玻片凝集法用于检测人绒毛膜促性腺激素（Santomauro and Sciarra，1967），此后POCT的应用范围不断扩大（Kasahara and Ashihara，1997；Price，1998；Rasooly，2006；Sia and Kricka，2008；Gervais等，2011a）。虽然传统的POCT系统是独立且体积相对较小，但是不需要放大就可以很容易地看到其试剂和反应容器。然而，在过去的十多年间，许多微量免疫检测方法已经在科研实验室得到了证实，且相当一部分产品已经上市，并有力地带动相应设备的市场化。虽然有些微量免疫检测方法具有纳米级的元素，但真正的纳米流控免疫检测方法还处于早期研发阶段，它们在技术上和商业上是否可行仍有待观察。

检测系统微型化的主要目的有以下几点：

● 经济——减少生物材料的消耗和降低生产过程成本。

● 环保——减少固体和液体废弃物和包装的生物危害。

● 简化——整合所有免疫检测步骤（包括样本制备、分析、数据处理和结果呈现等），这对于POCT至关重要。

● 便携——方便现场检测，比如资源匮乏的地区或场所。

● 通量——能同时检测多种不同的分析物，比如蛋白组学研究。

● 速度——由于扩散距离短，反应速度更快。

随着检测微型化概念的进一步发展，分析仪器也可能被重新设计，与测试单元融为一体，从而实现完全的一次性免疫诊断测试。与传统的大型检测仪器相比，微芯片分析仪有很多优势，但也有不足（表2-8-1）。

把复杂的分析功能集成到小型设备的想法是基于 微全分析系统（micro total analysis systems， μTAS） 的概念，这个概念最初是由Manz及其同事于20世纪90年代早期提出（Manz等，1990，1993）。该概念的目标是将尽可能多的实验步骤包括加样、样本处理、分离、检测、数据分析等集成到紧凑的“ 芯片实验室（lab - on - a - chip，LOC） ”设备中。将这些设备与免疫传感器区分开来是它能整合分离的步骤，从而避免与多分析物检测和干扰相关的典型传感器问题（Harrison等，1992，1993）。尽管侧向层流检测被认为是LOC的一种，但这里不予讨论（相关内容见第二部分第三节“侧向层流免疫检测系统”）。

基于LOC设备所需要的 微芯片（microchips） 是小型化的组件，大小一般为100nm至1mm。通常，这些芯片从外观上看是二维的，且制造成一些列的层。 微流控（microfluidic） 微芯片（也称为 流控微芯片（fluidic microchips） ）主要是由狭窄通道连接的反应池组成，样本和反应液沿着这些通道运输。不同的检测阶段在芯片的不同部位运行。内部容积取决于特定结构的横截面和几何结构，但通常在纳升到微升范围内。

生物电子（bioelectronics） 芯片在生物分子（抗体、抗原或信号生成分子）与非生物材料之间有一个连接，该连接会将信号从生物分子传递或调制到设备上，该设备可以将电子信号放大。芯片内置电气组件与流体组件。电气组件（比如电极）位于芯片内部如微室，控制微室内液体或其中成分（Ronkainen等，2010）。芯片通常组装在电路板上，通过电路板连接芯片内各电子元件，并插入到控制显示器上。

微阵列芯片（microarray） 最初是将试剂有规律地固定在小且平整的硅片、玻片或塑料片的表面（Schena，1999，2000），阵列是通过在芯片表面进行点样、冲压或者直接原位合成试剂而形成，根据芯片上试剂的位置不同可进行识别。另一种基于微球的微阵列芯片是将试剂偶联在微米大小的微球上，每组微球具有不同的光学特性，检测的过程中可以进行单个识别。微阵列试剂包括互补脱氧核糖核酸（cDNA）、寡核苷酸、适配体、抗体、亲合体、抗原、寡肽和组织切片。不同的芯片其微点（microspots）的大小、密度和数量可以差别很大。点的大小一般在100µm以下，日常使用的芯片每平方厘米包含有数百个点。

早期微流控系统的 微加工（microfabrication） 是基于对玻片或硅片等物质的蚀刻，然后进行热封以产生密闭的通道（Madou，2011）。其免疫检测的应用集中在带有电泳分离步骤的均相免疫反应模式。在过去的十多年中，芯片加工技术取得显著进步，已转变为通过注塑或压花然后层压的聚合芯片。（Becker and Locascio，2002；Liu，2007；Becker and Gaertner，2008）这些基于复制的方法使低成本微流体变成了现实，正如一次性POC免疫诊断所需要的一样。制作该芯片典型的材料包括聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯（有机玻璃）和环烯烃共聚物（Nanes等，2010）。聚二甲硅氧烷（PDMS）芯片广泛应用于研究领域，因为它们可以通过一个简单的铸造工艺制造，并且表面可以功能化以满足免疫检测的要求（McDonald等，2000；Sia and Whitesides，2003；Zhou等，2010）。值得注意的是，热塑性材料注塑和PDMS铸造可以扩展到纳米级（Attia等，2009）。

就连那些被认为具有非凡创新能力的免疫检测的科学家和工程师们也不可避免地会被纳米技术所吸引。由于免疫检测实际上是分子反应，免疫检测可微型化以节约成本并提高检测容量。 纳米技术（nanotechnology） 指的是在原子、分子以及小于100nm的大分子水平进行的操作技术。虽然免疫检测跟分子反应有关，但是只有检测系统的结构、加工或控制达到了纳米水平才算是纳米技术。这包括由纳米组件或者 纳米粒子（nanoparticles ，小于100nm）组装的更大的结构。

微流控中液体驱动有两种方式，一种是通过毛细管作用被动填充，一种是利用压力差、电场作用、旋转离心力或者动态改变表面湿度来驱动。与微流控相比， 纳流控（nanofluidic） 需要纳米级别驱动液体流动的新方法以克服表面张力（Sparreboom等，2010；Eijkel and van den Berg，2005）。虽然已经出现许多纳米级的分析系统，但免疫诊断设备目前还很难见到（Sparreboom等，2009；Napoli等，2010）。

为了理解微/纳米级免疫检测的优点和挑战，需要先了解一些基本理论。微/纳米级免疫检测跟传统的免疫检测有很多不同。

一、微型化的基本原理

大型分析系统与微型分析系统有许多根本上的区别（Janasek等，2006；Gad-el-Hak，2006；Kirby，2010），这些变化主要影响液流和被取样的分析物分子数量，也就是检测能力问题。本节主要是侧重于微米级分析系统，也会涉及纳米级系统。

（一）黏度和表面张力

表面张力（surface tension） 源自液体表面的分子间引力。水的表面张力强是由于相邻水分子的氢键作用力。在含水的液态生物样本中，如血液、尿液和痰液，还有其他的分子间引力会产生更高的表面张力导致 黏度（viscosity） 增加。

即使在厘米水平，表面张力也能影响样本和试剂在反应容器中的分布，如微量反应板。随着物体尺寸的减少，物体的体积和惯性按尺寸的三次方减少，而表面张力只是按线性减少。因此，在微米和纳米水平，表面张力是主要的作用力，对于表面性能的控制至关重要。

湿润（wetting） 是指一个固体表面与液体（润湿相）接触的能力。 湿润程度（或湿润性，wettability） 是由表面黏附力（自由能）和润湿相内的凝聚力（表面张力）之间的平衡所决定。润湿相倾向于在固体表面扩散，多孔固体倾向于吸收润湿相。在免疫检测中，液体通道对水溶液具有高湿润性是非常重要的。湿润性是通过测量一滴水溶液滴在塑料、玻璃或金属等固体材料上形成的 接触角（contact angle） 来确定的。

表面张力可以通过使用吸引液滴的亲水表面来修正。有许多方法可以增加检测设备中使用的塑料材料的湿润性，包括电晕放电和等离子体处理。化学表面处理方法包括清洁、底漆、涂层和蚀刻。温度升高会降低表面张力（及黏度），但是因为蛋白在高温下会变性，所以在免疫检测方面价值有限。也可以在样本或者流动基质中添加表面活性剂使注塑的模制塑料等疏水性表面能够被润湿。然而，表面活性剂对免疫检测结合可能存在干扰。

（二）毛细管流

毛细管流（capillary flow） 是利用高表面积与体积比介质的表面张力效应，介质包括多孔材料（如硝酸纤维素膜试纸条）和封闭的微结构表面（如基于微芯片的免疫诊断）（Eijkel and van den Berg，2006）。水分子被这些介质内的亲水表面所吸引，导致窄管内前缘的水向前移动，甚至可以克服重力的影响。当水分子对管壁的黏附力强于水分子之间的凝聚力时，毛细作用就会发生。由于表面张力，水分子之间的吸引力也会导致前面的水分子牵引着后面附近的水分子向前运动。毛细管力作用于液体和通道壁的接触周界，因此有助于微型化。这是因为在尺度缩小时，周长相对于通道横截面积将变得更大。正如Lucas-Washburn方程所示，在微通道的毛细管填充过程中，弯月面是在填充通道段的流体阻力线性增加的基础上，以时间的平方根成正比进行的（Delamarche等，2005）。然而，在恒定截面通道中，这种被动填充速度减慢的问题可以通过改变设备的几何结构和/或表面疏水性，从而可以有效的生成“可编程”的被动式微流控线路来克服。

（三）电渗流

对于电动微型免疫检测系统来说， 电渗流（electroosmotic flow，EOF） 是一种简便的流体驱动方法。EOF是基于带电表面（如玻璃、硅或等离子体处理的塑料上的微通道）形成的离子层而产生。这里，样本成分形成了与静态的带电表面所带电荷相反的可移动的离子层。在电场的作用下，离子层会朝着带相反电荷的电极方向迁移。对于微型系统，则会在通道中产生大量的液体流动。EOF可以方便地通过电场控制微芯片周围的液流，但它所需要的带电表面在注塑成型的塑料微流体较难以获得。

（四）减少样品体积对于低浓度样本的影响

样本中分析物的浓度是恒定的，与样本体积无关。当样本体积减小的时候，样本中分子数量会减少。免疫检测分析物的浓度通常在微摩尔、纳摩尔或皮摩尔级水平。

从表2-8-2可以看出，这对免疫检测的规模有一个基本限制。如果样本体积是1fl，那么它的规格也就是1µm ³ ，这比一个真正纳米元件的体积大了10倍。然而，如果样本的浓度是1nmol/L，那么很有可能1fl样本中没有一个分析物分子。

低样本体积对低浓度样本测定的影响在定性和定量上是不一样的。如果能够开发出理论上理想的免疫检测方法，其检测效率是100%（能检测到样本中的每一个分子），且信噪比大于1 000，那么在上述的例子中，可以基于小于200fl的样本体积设计定性检测方法。然而，对于定量检测来说，为了将误差控制在1%以内，分析物的分子数量必须为10 000个（因为标准差大约等于分子数量的平方根），那么样本体积必须为17pl。

为了解决纳米设备中样本体积的问题，一个办法就是提供足够的样本量，以便增加与捕获抗体或抗原作用的分子数量（Eijkel，2007）。时间积分流通系统将抗体或抗原固定在表面，去捕获分析物并集中在一个点上。可是，不论是竞争性还是非竞争性免疫检测，样品体积应该通过固定加样体积或系统设计要求来确定。当然环境分析物免疫测定是个例外（见“环境分析物免疫测定”（该部分未译，有兴趣的读者可参考原书——译者注））。

（五）减少样本体积对反应动力学的影响

免疫检测微型化的一个优点是减少了分子移动距离。分子扩散需要的时间与扩散距离的平方成正比，跟分子自身的扩散系数成反比。分子的扩散系数主要是由分子大小决定的。

在液相检测法中，所有的分子在溶液中自由运动。除非样本被过度稀释，否则样本量不会影响抗原抗体的结合。但是随着检测方法的发展，越来越注重非均相的固相免疫分析，这种方法需要分离洗涤步骤。在固相免疫检测中，主要的反应物是被固定的。这就减缓了反应速度，因为只有液相中的反应物可以自由移动。由于微型反应体系体积特别小，反应物的扩散时间也就缩短了，因此可以增加反应速率从而减少反应到达平衡的时间，从而减少总的分析时间。

另一个增强反应动力学的方法是使样本通过检测器时保持一段时间以确保能够检测到，或用电场将分子吸附到表面。在设计流通系统时，最小化包被有捕获抗体的反应池的直径很重要（Hofmann等，2002）。用电场吸引生物分子到敏感表面的方法包括电热效应（Sigurdson等，2005；Feldman等，2007）和介电电泳（Yasukawa等，2007；Hart等，2010），更详细的内容参见近期的综述（Wang，2006；Ronkainen等，2010）。

（六）纳米级分析系统

需要注意的是，上述许多构思在纳米分析系统中仍需要进一步改善。常规分析系统的原理在纳米级似乎不适用，此外还存在一个“可检测性”问题，就是检测的分子数目太少不具有代表性。这可能是至今仍缺乏真正意义上的纳米级免疫检测系统的部分原因。然而，应该指出的是，大多数纳米研究仍处于起步阶段，“可检测性”的问题能够通过仅仅一维纳米尺度的系统或通过信号随时间累积的时间积分系统来解决（Eijkel，2007）。

二、微/纳米级免疫检测设计

（一）检测模式

目前常用的两种免疫检测模式是 竞争性（competitive） 免疫检测和 直接免疫检测（immun ometric） （通常也称为非竞争性免疫检测）（见第二部分第一节“竞争性和非竞争性免疫测定（包括ELISA）的原理”）。竞争性免疫检测的根本局限是分析物的浓度在零和非常低的水平时，信号相当强，造成低信噪比，牺牲了灵敏度。由于微/纳米级免疫检测产生的信号水平极低，所以优先使用直接免疫检测法来最大化信噪比。

为了提高非均相免疫检测方法性能，有效地去除未结合的标记分子至关重要，也就是说只有将所有未结合的标记物全部洗涤后，极低浓度的与标记物结合的分析物才能被准确地测出来。微流控免疫诊断设备可以整合主动洗涤步骤，但是对于常规的自动分析仪的被动洗涤，要将分离效率提高到＞99.99%是非常困难的（见第三部分第三节“固相和其他分离系统”）。

环境分析物检测作为非均相分析中的一种，它有两点独到的优势。首先它不需要加样，捕获抗体只对抗体区附近的分析物“采样”。其次这种检测模式包括很小的抗体埋点靶，这些点通常直径小于100µm，间距小于50µm，使它适于在微水平和免疫检测阵列上制造生产（见“环境分析物免疫测定”（该部分未译，有兴趣的读者可参考原书——译者注））。

在均相免疫检测中，检测抗体和分析物均处于液相中。虽然大多数均相免疫检测方法往往比非均相检测灵敏度低，但它的优势在于不需要洗涤分离步骤去除未结合的标记检测抗体（见第二部分第二节“均相免疫测定”）。

电动（electrokinetic） 检测的分离系统包括亲和电泳和电色谱检测（Hou and Herr，2008），电动分离检测可进一步分为以下几类：① 预亲和（affinity preparative） ：在分离之前或分离期间发生的基于亲和力的结合；② 预平衡亲和检测（pre equilibrated affinity assays） ：在芯片分离步骤之前，亲和试剂和样品预先混合至平衡；③ 芯片平衡亲和检测（on - chip equilibrated affinity assays） ：亲和试剂和样本在分离通道内动态混合至平衡。预亲和可以用于免疫富集或免疫耗竭（Breadmore，2007），这有助于降低检测限并能扩大免疫诊断检测的动态范围，特别是在对复杂的临床样品进行检测时（Mondal and Gupta，2006）。以LOC为基础的微流控系统非常适用于芯片平衡亲和检测，因其可以将多个步骤整合到单一芯片上，并可以选择多步骤同时进行。经过免疫提取、标记、电洗脱以及2min的电泳分离后，同时检测血液、唾液和尿液中的4种激素的技术已有应用（Wellner and Kalish，2008）。免疫亲和样品制备甚至能对皮肤活检样本中的12种炎性标志物同时进行检测，主要是通过电泳分离所有标志物，再与荧光标记的检测抗体结合（Phillips and Wellner，2007）。其他基于电动分离的微流控免疫诊断系统包括检测血浆中抗感染药的设备（Phillips and Wellner，2006）、监测胰岛素分泌的四通道检测系统（Dishinger and Kennedy，2007）以及同时定量检测经50s电泳分离后的血清中4种肿瘤标志物的仪器（Yang等，2010）。

Yager及其同事已开发出基于扩散系数的免疫检测方法，其通过扩散系数的变化将结合与未结合的检测抗体区分开。美国华盛顿州雷德蒙德市的Micronics公司已经研制出一种竞争性均相免疫检测方法，在玻璃-聚酯薄膜-玻璃的杂交芯片上嵌入一个T形传感器，芯片包含两个流体入口，分别经过两个通道后汇合成一个100µm×1 200µm（深×宽）的反应槽，然后连接到流体出口（Kamholz等，1999；Hatch等，2001）。在层流条件下，两种流体（抗体试剂和掺有荧光标记抗原的样本）平行流动，它们只能通过扩散来混合。抗原向平行流体的扩散受平行流体中的抗体结合比例的限制。样本中抗原和标记抗原竞争结合抗体流中抗体的结合位点，这是抗原定量的基础。这种检测的优点是可以检测稀释的全血而无须去除红细胞。该方法检测全血中苯妥英钠需要不到1min（10～400倍稀释），能够检测到低至0.43nM的苯妥英钠（Hatch等，2001）。

（二）一次性POC与可读性检测卡

免疫检测设计需考虑的一个重要因素是针对不同应用需求设计免疫诊断方法。理想的POC免疫诊断设备组成如图2-8-1所示。

大多数POC装置都是可读性检测卡（如Alere TRIAGE ^® 系列），同时也有纯粹的一次性POC，这些主要面向家庭测试和医疗资源贫乏的地区（如BayerA1CNow+ ^® ），表2-8-3概述了不同检测仪器的主要区别。

一次性测试仪应用的关键问题在于无法使用外部设备（如泵）来主动驱动液体的流动。目前主要着眼于发展基于毛细管填充微流体回路的被动驱动检测设备，但是在进行非均相检测时，就可能需要面对难以洗去未结合检测抗体的难题。对于被动驱动系统来说，需要使用过量的样本去洗涤未结合的抗体。以下介绍免疫诊断设备对定标、校准、信号生成和检测的影响。

（三）抗体

与常规免疫检测一样，微量免疫检测需要抗体具有适当的特异性，且还需要具有高的亲和力（ K _eq ＞10 ¹⁰ ）。单克隆抗体能够提供最高浓度的活性抗体（这对微/纳米级检测仪器是非常有利的），但大多数单克隆抗体缺乏像多克隆抗体一样的高亲和力。理想的抗体应该是具有高亲和力的单克隆抗体。对抗体互补决定簇区域的氨基酸序列进行选择性修饰，产生新的噬菌体DNA序列，再利用噬菌体展示技术从大的噬菌体文库中筛选出高亲和力的单克隆抗体（通常 K _eq 是10 ⁷ ～10 ⁹ ）。通过这种方法可获得亲和力 K _eq ≥10 ¹¹ 的单克隆抗体（见第三部分第一节“抗体”）。

（四）捕获抗体固定

在非均相免疫检测中，可以将试剂固定在微流控结构内的微球上（Tarn and Pamme，2011）。这种捕获抗体的固化不仅增加了表面积-体积比，还能够减少分析物的扩散距离，提高分子间相互作用。典型的珠子材料包括聚苯乙烯/乳胶（Ohashi等，2009；Yuan等，2009；Ihara等，2010）和玻璃（Tsukagoshi等，2005）。

磁珠具有的额外优势，就是无须设置物理限制屏障。磁珠能够被磁力吸附，在需要的时候通过关闭磁场而释放磁珠（Pamme，2006）。因此，各种各样的基于磁珠的免疫检测应用于微流控中并不为奇（Hayest等，2001；Choi等，2002；Petkus等，2006；Mulvaney等，2007；Do and Ahn，2008；Peyman等，2009；Chen等，2011）。

然而更常见的是，先将免疫试剂包被于微流控结构的内表面，再将抗原或抗体固化于其上。固化方法包括物理吸附、 自组装单层膜（self assembled monolayers，SAMs） 、溶胶-凝胶法和共价偶联（Shankaran and Miura，2007）。常见的化学物质包括葡聚糖、蛋白A或蛋白G和生物素-链霉抗生物素蛋白。一个重要的区别是功能基团的方向，因为这能影响固化抗体的活性。通过抗体的微接触打印技术，能够在微通道产生定向功能化的自组装单层膜（Foley等，2005）。

另一种方法是直接将抗体固定于致敏的表面，如 表面等离激元共振（surface plasmon resonance，SPR） 或 表面增强拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS） 。同样可将抗体固定于电极或 场效应晶体管（field effect transistor，FETs） 上进行电化学检测，或固定于 石英晶体微天平（quartz crystal microbalance，QCM） 上，或悬臂上进行机电检测，详见本节后述的“芯片检测方法”部分。

（五）标准化和校准

与常规免疫检测相同，定量微量免疫检测在标准化和校准上充满了挑战（见第三部分第五节“标准化和校准”）。与临床分析仪一样，基于微芯片的免疫诊断采用可溯源的国际标准制物质来确认其准确性。微加工技术能够在微芯片上生产出相同的反应通道和反应孔，因此如果校准品和样本同批检测，则可以直接通过参考校准曲线来估算样本浓度。在微量检测中，反应动力学更快，这使得反应可以在更短的时间内达到平衡。这种快速达到平衡的检测方法能够允许样本和校准物之间的微小差异，且在极微量检测中，更容易在各样本间快速达到平衡温度。

理论上具有近线性剂量-反应曲线的非竞争性免疫检测法所需要的校准品可能不超过两个，而特异性强、呈线性剂量-反应的试验可仅使用一个标准品。对于可读性检测卡系统，操作人员可根据已知浓度的分析物的响应选择（重新）校准，这在一次性POC免疫诊断上是难以实现的。这种情况下，可以使用厂家提供的定标曲线，它是以电子文档存储在检测设备上的，但随着时间的推移，该定标曲线的准确度会发生下降，且无法补偿和调整，因此厂家要求在有效期内使用。

由于以缓冲液为基质的校准品和血液样本之间的表面张力差异，其基质效应在微通道内可能会被放大，通过稀释样品可降低其影响，但这需要人工操作，并减少了样本中分子的数量，可能会降低检测灵敏度。对于一次性免疫诊断检测，微芯片里的缓冲液会发生蒸发，但又难以补充，这也限制了该方法的有效期。

（六）信号生成

在免疫检测中，由于分析物浓度非常低时，产生的信号很弱，在微量免疫检测中信号会更弱，因此必须使用高特异性和高活性的标记物。为了实现高信噪比，必须消除噪声源。后面我们将在不同的章节中详细讨论免疫测定中信号发生系统（见第三部分第二节“信号产生及检测系统”），这里我们将具体讨论微量免疫检测信号生成面临的挑战及解决方案。

在传统的免疫诊断检测中， 酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA） 因其通过酶促反应放大信号而被广泛使用。一般情况下，ELISA使用 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） 作为标记物，催化发色底物的 3，3′，5，5′ - 四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，TMB） 显色而放大信号。然而在微量条件下，能够检测的光路波长是有限的，这也部分解释了为什么在微量免疫检测中更多倾向于使用化学发光法进行检测，因为它只需要一个检测器就可实现。

信号放大也可以通过银增强的纳米颗粒标记来实现（Nam等，2003）。具有高扩散性的金标纳米颗粒在复合物形成后通过银颗粒沉积被催化放大。形成的银包被标记物有很高的灵敏度，可以被普通的相机或扫描仪检测，同时也有助于POC诊断（Chin等，2011）。

然而，绝大多数微量免疫诊断方法仍然依赖于荧光标记，免疫夹心法中最常见的是标记二抗。与使用单一染料分子相比，携带大量染料分子的微球由于能发射更强的荧光更为可取。最近，在激发光和发射光之间具有较大斯托克斯位移的荧光微球已成为可用于集成一次性免疫诊断装置的光谱过滤材料。例如，包含一系列染料的TransFluoSpheres™聚苯乙烯微球能产生高达200nm的斯托克斯位移特别有应用价值，已应用于具有集成正面荧光检测的免疫诊断芯片中（Ryu等，2011）。

目前，利用光学检测的微芯片免疫诊断方法中信号增强措施主要聚焦于使用纳米技术源探针（Myers and Lee，2008；Azzazy等，2006）。 量子点（quantum dots，Q - dots） 尤其受人关注，因其发射光窄且可调节，非常适合于多通道检测（Lee等，2007）。这些半导体颗粒通常被植入高分子微球里，目前已经应用于同时检测HIV、HBV和HCV的微芯片中（Klostranec等，2007）。目前，Q-dot的成本较高，功能化和稳定性仍然存在问题，限制了其在POC诊断中的应用。

一个有趣的Q-dots信号产生替代物是含有陶瓷纳米微球的稀土金属，可充当上转换荧光（Yan等，2006）。这种荧光在红外区被吸收，并以可见光谱发射，产生了有效的反斯托克斯位移。这避免了体液中的背景自发荧光，从而提高了定量诊断应用中的信噪比。

对于非光学检测方法，可以充分利用微量分析系统中增加的表面积与体积比的技术，尤其是对于致敏表面作为生成信号的设备，就像在电化学和机电检测系统中一样。下一节将回顾现有的光学和非光学检测的解决方案及其在微量分析系统中的应用。

（七）芯片检测方法

基于微芯片的分析设备受（Jiang等，2011）到体积小和光程短的限制（Myers and Lee，2008）。此外，还要求这些设备低成本和便于携带，以便应用于POC检测，但又不能影响灵敏度和精密度（Weigl等，2008）。以下概述如何解决以上的挑战，表2-8-4列举了光学和非光学芯片检测的方法。

根据朗伯-比尔定律，微芯片中光程长度的减少会对 吸光度（asorbance） 检测产生不利的影响。研究人员已经研发出许多巧妙的解决方案，如通过使用反射镜或透镜来增加光路长度以检测大体积样本（Myers and Lee，2008）。相反，Lee及其同事在芯片ELISA方法中，在基于 光盘（CD） 的检测系统上，使用深6mm的检测池和偶联硅光电二极管的450/630nm波长LED光源，检测HRP标记催化TMB显色，根据其颜色深浅对乙型肝炎进行检测（Lee等，2009a）。Maier及其同事在增强共振吸收ELISA中使用标记的金纳米颗粒对食品过敏原进行检测（Maier等，2008），其目测半定量的检测限可以达到1ng/ml，如果使用读数仪器，检测限会更高。

荧光（fluorescence） 检测在芯片免疫检测中得到了广泛的发展。早期的工作主要集中于 激光诱导荧光（laser - induced fluorescence，LIF） ，这种高能激光聚焦在一个小区域，它的窄发射光谱有利于区分激发光和发射光（Chiem and Harrison，1997；Jiang等，2000）。带有荧光扫描检测的多通道微流控免疫检测也已经被开发出来（Cheng等，2001）。最近，一种基于LIF对唾液中牙周疾病标志物进行检测的口腔免疫诊断集成便携式仪器已经问世，其灵敏度可达到纳摩尔至皮摩尔水平（Herr等，2007）。McDevitt和他的同事利用Q-dots独特的光谱特性，将传统的用于HIV患者CD4 ⁺ T细胞计数的台式落射荧光显微镜功能简化为一种手持诊断设备（Jokerst等，2008）。美国桑迪亚国家实验室开发了一种小型并整合有LIF功能的免疫诊断系统，它能够同时检测一组生物毒素，其敏感性可达皮摩尔水平（Meagher等，2008）。该系统集成了电子元件，并使光学元件小型化，这些光学元件包括二极管激光器、反射镜、透镜、滤光器和 光电倍增管（photomultiplier tube，PMT） 。作为迈向完全一次性荧光检测系统的第一步尝试，Ryu和他的同事开发了一种基于无机LEDs和有机光电二极管的综合免疫诊断检测系统，据报道该系统对心肌标志物肌红蛋白和 肌酸激酶MB（creatine kinase MB，CK - MB） 同工酶的敏感性能达到ng/ml（Ryu等，2011）。

Baba及其同事最近展示了一种具有荧光偏振检测的均相微芯片茶碱检测法（Tachi等，2009）。该方法的原理是，当荧光标记物与分析物结合后会发生旋转运动，并有荧光偏振的变化。这种变化可使用激光、 电荷耦合器件（charge coupled device，CCD） 相机和固定并可旋转的偏振器进行量化。最近，一种新型 超临界角荧光（supercritical angle fluorescence，SAF） 免疫检测概念已在一次性高分子试管中得到应用和验证，该方法可以检测皮摩尔水平白细胞介素-2（Ruckstuhl等，2011）。SAF只发生在透明基质的表面，因此可以用来区分表面结合和基体效应，从而避免了类似ELISA的繁琐洗涤步骤。

为了克服荧光检测中激发光和发射光光谱重叠方面的一些局限性，可以利用长寿命的 磷光（phosphorescence） 采用时间-门控方法进行检测，其激发光为脉冲形式，可在脉冲结束后检测发射光。然而这种方法需要复杂的锁定检测电子器件，这可能是其尚未应用于POC免疫诊断检测中的原因。最近一种基于上转换荧光（见第三部分第二节“信号产生及检测系统”）的独立方法已应用于检测鼠疫耶尔森菌，这种小巧、便携的扫描装置在980nm处由二极管激发激发光，PMT检测541nm处的发射光（Yan等，2006）。

化学发光（chemiluminescence） 是一种常用的免疫诊断检测技术，由于不需要光学激发设备，其对一体化的一次性仪器更具有吸引力。在早期检测模型小鼠IgG的研究中，在毛细管电泳微芯片上使用标准鲁米诺/过氧化物系统对HRP标记的IgG二抗进行免疫检测（Mangru and Harrison，1998）。镶嵌在检测区背面的铝镜提供了一个可以提高发射光的收集效率的反射面，使小鼠IgG的线性范围达到0～60µg/ml。最近，化学发光检测已经扩展到用于生物制剂检测的10通道毛细管流式夹心免疫检测法（Yacoub-George等，2007）。该方法使用微型蠕动泵驱动流体进入10个平行安装于毛细管中的微芯片内，在多阳极-光电倍增管阵列上进行HRP为标记物的化学发光检测。一种基于磁珠并集成气动微泵、微阀和微混合器的微芯片已应用于血清中C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）的免疫检测（Yang等，2009）。这种化学发光检测通过芯片外光度计对吖啶酯标记的抗体进行检测，使CRP检测限达到0.012 5mg/L。在多通道注塑成型的环烯烃芯片上使用HRP/鲁米诺化学发光并用台式成像系统读数，通过间接免疫测定法，测定血清CRP的检测限为0.1mg/L（Bhattacharyya and Klapperich，2007）。更有趣的是，对板载即时胶片模块进行测试发现，与参考胶片相比，它更适合在定性POC仪器中使用。Pamula及其同事已经将磁免疫测定法在数字微流体平台应用于胰岛素和白细胞介素-6的测定（Sista等，2008b）。该平台使用标记的HRP与PS-Atto底物反应，利用PMT进行读数。

热透镜显微镜（thermal lens microscope，TLM） 检测采用双激光束来测量非荧光分子的光热效应，通常采用胶体金进行标记。在之前的研究中，TLM已经有效地应用于对人分泌型免疫球蛋白A和 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA） 的免疫检测中（Sato等，2000，2001）。将捕获抗体包被于聚苯乙烯微球，封闭在100µm×250µm（深×宽）的玻璃通道中，孵育10min后检测CEA，检测限可达0.03ng/ml。Kitamori和他的同事将高敏TLM应用于开放式夹心ELISA芯片中，检测人血清骨钙素（Ihara等，2010）。该方法使用658nm激发光、785nm检测光和一个光电二极管，检测骨钙素灵敏度能达到1.0µg/L，其能力与板式ELISA相当。

在 表面增强拉曼散射（surface - enhanced Raman scattering，SERS） 光谱学中，当分子靠近被局部电磁场增强的金属表面时，拉曼光谱的分子指纹信号会增强。在Natan及其同事的早期研究中，将核心为拉曼活性金或银、 表面包被玻璃的分析纳米颗粒（glass - coated analytetagged nanoparticles，GANs） 应用于表面结合免疫检测法（夹心法）（Mulvaney等，2003）。他们使用激光作为激发光，利用CCD检测散射光。Lee和其同事最近研究了在多晶硅涂层的玻璃薄片上无标记测定腺嘌呤的方法（Cho等，2009）。他们在顶部圆柱形线电极和底板金电极之间（SERS活性区域）施加电场，使带电分析物在电场中泳动，积聚在相反电极的检测区域。如果使用集成的拉曼系统检测，这种电动预富集可以使检测灵敏度提高8个数量级，所以SERS在低浓度诊断检测中有很大的发展前景。

表面等离激元共振（surface plasmon resonance，SPR） 可以无须标记直接检测表面的免疫复合物，详见本部分第九节“表面等离激元共振在结合位点、动力学和浓度分析中的应用”。值得注意的是，基于SPR的Biacore™系统已商业化，并广泛应用于免疫检测平台（见本节后述“商业化微流控免疫诊断”部分）。这里，我们仅讨论SPR在微流控免疫诊断设备上的应用。在之前的研究中，SPR与微流体单元联合使用并与传感器表面接触，实时测量单克隆抗体-抗原反应的动力变化。抗体或抗原被固定在一个附着在传感器表面的葡聚糖基质中，可以通过SPR监测抗原抗体的反应过程（Karlsson等，1991）。在过去的20年中，这种对复杂样本中低分子量分析物进行检测的高灵敏度、可靠的检测方法已经取得了相当大的进步，特别是在传感表面稳定性和仪器小型化方面（Shankaran等，2007；Shankaran and Miura，2007）。Lee和他的同事研制出了二维SPR成像检测的自动化 聚二甲基硅氧烷（PDMS） 芯片，它基于Kretschmann结构，带有微泵和阀门，已应用于免疫检测阵列中（Lee等，2007）。考虑到SPR测量的温度敏感性，该系统还集成了由微加热器和温度传感器组成的温度控制模块，使IgG的初步检测限达到0.67nM。作为POC应用的重要一步，Davis和他的同事已经开发了一种由9V电池供电的完全独立手持SPR设备（Feltis等，2008）。为了证明该系统的有效性，他们在固定了抗蓖麻毒素抗体的塑料圆柱形感应孔中10min内检测到200ng/ml蓖麻毒素，与Yager和他的同事研究类似。Yager和他的同事已经建立了一个基于发光二极管、图像检测器、集成数字信号处理器和被动温度控制的小型 SPR成像（SPRi） 仪器（Chinowsky等，2007）。这种设计理念也同样被用于竞争性免疫检测法测定苯妥英钠。

尽管上述光学检测方法用处非常广泛，且直接受益于传统临床实验室检测方法的转换及相关光学标记化合物的发展，但是其所需的硬件通常非常昂贵，难以小型化，并且光学读数装置的性能易受微量检测方式的影响。如前所述，将光学检测集成在芯片上检测的方法已经克服了上述一些不足，但更简单的小型化检测技术仍有很大的发展空间。电化学检测提供了一种可行的替代方法，虽然电化学检测方法在多分析物检测时的干扰以及电极污染和稳定性方面有一定的局限性。下面我们将回顾电化学检测技术的现状，并在其他章节提供更多细节（见“免疫生物传感器”（该部分未译，有兴趣的读者可参考原书——译者注））。

在早期的研究中，pH敏感的 光寻址电位传感器（light addressable potentiometric sensors） 被用来监测细胞膜上捕获的免疫复合物中结合的尿素酶标记的交联物发生酶促反应时的pH变化（Briggs and Panfili，1991；Owicki等，1994）。Bakker和他的同事近来已将电位检测用于纳米颗粒的免疫夹心法检测中（Chumbimuni-Torres等，2006）。当标记金纳米颗粒与检测抗体结合并被银催化沉积后，使用Ag ⁺ 选择性电极对银溶解进行电位检测，50µl样本中IgG的检测限达到12.5pmol。Wang等（2001）报道，当碱性磷酸酶标记抗体与柱上的抗原结合后，分离去除游离的抗体，酶标记物与4-氨基苯磷酸酯底物发生酶促反应，催化底物生成4-氨基苯酚，引起电流变化，芯片通过检测电流的变化而实现对产物的检测。Yoo等（2009）报道，在玻璃微芯片50µm×20µm（深×宽）的反应通道中检测小鼠IgG，其检测限能达到1.7amol。基于微流控的酶联电流检测的PDMS微芯片已应用于检测尿液的马尿酸，其检测范围达到0～40mg/ml。Whitesides及其同事已经在 微流控纸基电化学仪器（microfluidic paper - based electrochemical devices，mPEDs） 上利用电流时间曲线法测定葡萄糖和方波阳极溶出伏安法检测重金属离子（Nie等，2010）。这种简单的低成本装置包括两个内置碳电极作为工作电极和反电极，并有一个内置Ag/AgCl电极作为伪参比电极，其本质上与基于免疫检测方法的分析是兼容的。最近有一种用纳米金标记并在微梳型电极上进行的 电导（conductometric） 免疫（夹心）检测血清中 乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg） 的方法，其检测限可达0.01ng/ml（Liu等，2009）。作为上述电化学方法的延展，在微流控免疫检测中使用 互补金属氧化物半导体（complementary metal oxide semiconductor，CMOS） 传感器进行 电容（capacitive） 检测也有报道（Ghafar-Zadeh等，2009）。

Lieber及其同事将FETs与胺和氧化的 硅纳米线（silicon nanowires，SiNWs） 用在源极和漏极之间，研制出了高灵敏度的实时免疫传感器（Cui等，2001）。通过监测抗生物素-生物素化的SiNWs的结合，已证明了其理念的可行性，但是由于NSB和生物淤积，迄今为止检测体液样本中的生物标志物仍然困难。Fahmy及其同事最近通过研发一种微流控芯片克服了这一问题，该芯片从血液样本中捕获多种标志物，然后基于FET的硅纳米带检测器对清洗后释放到纯缓冲液中的标志物进行感应检测（Stern等，2010）。它可以在不到20min内通过无标记的免疫夹心法检测出全血样本中两种肿瘤标志物，证明了该方法是有效的。

机电检测方法是基于传感表面的结合诱导变化，这种变化可通过电气方法进行测量。 石英晶体微天平（quartz crystal microbalance，QCM） 测量原理基于表面结合诱导正、负电极之间的石英晶片振荡变化。虽然这种方法本质上是无须标记的，但添加如金纳米颗粒后可以提高检测灵敏度。Tothill及其同事已将这种方法用于测定75%人血清中的肿瘤标志物，前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）的检测灵敏度可达到0.29ng/ml（Uludag and Tothill，2010）。QCM应用于POC免疫诊断的主要缺点是其对基质黏度的敏感性，因此需要在芯片上使用质控。 悬臂（cantilever） 法测量的是抗原抗体分子识别时产生的表面应力（Hwang等，2009；Waggoner and Craighead，2007），其检测CK和肌红蛋白的检测限＜20µg/ml（Arntz等，2003）。Cho和他的同事已经能用这种方法检测皮摩尔水平的尿PSA（Cho等，2005）。最近，Craighead研究组使用纳米粒子的质量标记免疫测定法将血清PSA的灵敏度提高到1～100fM（Waggoner等，2010）。硅光子微环谐振器已应用于200fM水平血清CRP的检测，其检测范围含6个数量级（Luchansky等，2011）。

三、微流控检测的免疫诊断标志物

在过去10年左右的时间里，大量的免疫诊断实验已可以通过微芯片完成，见表2-8-5。分析物的数量同样也在增加，现在几乎已经覆盖了临床实验室中检测的所有疾病标志物。其中最令人关注的是心脏标志物、传染病和肿瘤标志物。心脏标志物的研究集中在肌红蛋白、CK-MB、肌钙蛋白I、CRP和B型钠尿肽（B-type natriuretic peptide，BNP）的检测（Mohammed and Desmulliez，2011）。传染病检测主要包括用于HIV监测的CD4 ⁺ T淋巴细胞计数、登革热、甲型流感、丙型肝炎、疟疾和结核病（Yager等，2006；Chin等，2011）。迄今为止，通常以低浓度存在的肿瘤标志物的研究包括PSA、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、肝癌标志物甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）和CEA。各种新标记物的快速增加显示了先进技术的活力，预示着基于微流控的免疫诊断技术的良好前景。现有的基于微流控的商业检测系统见表2-8-6。

四、微流控免疫诊断技术的应用

POC免疫诊断检测提供更适用和更高效的护理服务（见第五部分第三节“即时检测”）。对于医护人员来说，可以使检测分散和更有效地利用资源，同时患者也从个性化治疗、现场诊断和早治疗中受益，并在疾病管理结果方面有益。然而，要成为一种经济、适用、普遍的诊断工具，POC检测需是定量的、高通量测量一组分析物，为便携式或手持的，并且成本足够低，可以一次性使用。

迄今为止，大多数 非处方（OTC） 的POC测试仍然是以多孔硝酸纤维素膜为基质进行试剂沉积和流体横向流动的形式进行的（详见本部分第三节“侧向层流免疫检测系统”部分）。然而，这些侧向层流系统仅限于进行定性或半定量分析。另外，复杂的可读性检测卡系统可以对一组分析物进行定量测试，如Alere公司的TRIAGE ^® 系列心肌标志物检测板（详见“TRIAGE”（此部分未译，有兴趣的读者可参考原书——译者注））。这些系统充分利用了微流控技术的强大功能，能够同时检测一批相关分析物，并被集成到一个小型低成本的一次性微流控检测板上，而精细的数据读取和数据处理功能储存于可重复使用的读卡器中。

然而，要访问更多的远程POC应用程序，如家用检测，仍然需要开发类似于侧向层流测试这样的小型手持诊断设备，其分析能力应与可读性检测卡系统一致，甚至完全与临床实验室分析仪相当。本节回顾了在实现这一宏伟目标过程中，微流控技术发展的各个关键节点。目前POC的应用仍然面临一些问题，包括被动流体的质量控制、降低检测成本，以及将上述功能集成到一个诊断设备，并适用于非专业用户和医疗条件匮乏的地区，如发展中国家。

（一）流体控制

大多数传统实验室用微流控系统均依赖于流体控制驱动。典型的驱动方式是对微芯片入口施以正压来促进微流体回路的填充，在这种方法中常使用高精度注射泵。其他驱动方式包括使用集成微泵或者在微芯片出口处真空抽吸。另外，还可以利用带电玻璃或硅表面上的电渗作用，但这种方法需要使用高压电源。由于上述微流体控制方法都需要额外的辅助设备，限制了其在POC领域的应用。因此，为突破当前的局限，人们开展了广泛的研究以寻找更好的流体控制方法，包括基于CD驱动的离心体系、数字化微流控和基于毛细管的被动填充系统，以及它们在免疫诊断POCT中的应用。在以下内容中，我们将介绍这些新型的流体控制方法，并总结当前的技术状态，重点阐述其在免疫诊断POCT中的适用性。

在实验室用微流控系统向轻便手持式POC装置的过渡过程中，人们开发了离心式微流体平台。在这一平台中，CD驱动器用来通过离心力、欧拉力和科里奥利力来控制微流控盘中的液体流动。在生物磁盘平台上，多个流体单元操控程序与液流驱动、液面接触及结果检测连接在一起，形成一个低成本的半便携式平台。目前，该理念已成功应用于基于ELISA的血清和全血心脏标志物的免疫学检测，并且适用于吸光度、化学发光和荧光检测。也有其他研究组将基于CD的流体控制应用于多重免疫测定和全血中乙型肝炎的ELISA检测，见图2-8-2。

不同于被动毛细管吸附填充体系，基于离心方法产生的这种小型半便携式装置不受血黏度和表面张力的影响，能提供稳健的液流操控。但该方法目前尚存在成本、可靠性和难以实现高灵敏度读取等方面的不足。

在数字化微流控中，样本在绝缘体包裹的电极阵列上作为离散液滴进行操作。通过不断地给电极施加一系列电位，电荷将在电极表面蓄积并动态地改变其湿润度，进而对液滴进行分配、移动、融合、混合和分裂液滴。为防止蒸发、交叉污染和减少通道表面的非特异性结合，这些液滴通常悬浮在不相溶的油中。开放式单板配置系统可在同时兼容驱动电极和接地电极的单层基板上处理液滴。然而，POC免疫诊断最常使用的是封闭的双板系统以方便装置操控和减少液体蒸发。尽管Srinivasan早在2004年就首次证明了数字化微流体与体液（包括全血）的兼容性，但数字化微流控在免疫诊断中的应用最近才出现。Pamula研究组开发了一种可用于检测胰岛素和白细胞介素的微滴磁珠免疫检测法，见图2-8-3。

在这一方法中，样本与偶联捕获抗体的磁珠、检测抗体和封闭蛋白质进行数字化混合；然后，形成的抗原抗体复合物随后用磁铁吸附，经洗涤和重悬后，利用碱性磷酸酶化学发光系统进行检测。这一数字化微流控平台亦已应用于全血中肌钙蛋白I的测定，该检测可在8min内完成。基于其优越的液流控制性能，该体系可实现40个循环的PCR检测，这在其他研究组中也得到了证实。

数字化微流控的主要优点有：使用模块化和可扩展的印制电路板来替代复杂的通道网络；固态兼容（如需进行全血检测时）及上样量灵活。总的来说，该技术解决了便携、经济的POC免疫诊断平台中难以兼容的复杂的液流控制问题。然而，数字化微流控仍处于起步阶段，非特异性结合和绝缘体电极表面积垢等问题依然存在。

Delamarche及其在IBM的同事开发了一种基于毛细管力填充的硅毛细管系统的自主被动微芯片流体控制系统。该整合微流控体系包括充液港、微通道和被动“毛细管泵”出口。“毛细管泵”出口包含多个分支通道以增加表面积并促进流体蒸发，这有助于基于毛细管作用的液流填充。交互式流体控制可通过冷却Peltier元件控制液流蒸发速率来实现。用于免疫检测的生物功能化修饰在一个附着于硅毛细管的独立PDMS聚二甲硅氧烷底物上进行。该研究组证实该体系能在次微升体积中检测出皮摩尔级别的细胞因子TNF-α。早期的检测是手工依次把分析物和检测抗体加入进样口，该研究组随后专注于全自动一步法免疫检测的研发。最终实现了通过一个包含有样本收集器、延迟阀、阻流器、反应室和硅毛细管的无源装置，在5min内完成5µl血清样本中CRP的检测，且检出限可达1ng/ml。在最新研发出来的多功能六通道一步法免疫检测平台，还可以调节和优化样本流速、上样体积及检测抗体的浓度。而众多研究团队的研究表明，样本流速和检测抗体的浓度及分布是芯片式免疫检测获得高灵敏度的关键。在被动式硅毛细管平台中，可以通过可控的试剂积分器对试剂进行程序式分配来优化试剂的投放。

尽管上述被动式一步法硅毛细管系统兼顾了性能卓越、成本低和操作简便的优点，但它们需要一个加湿器以确保流速稳定，这限制了其在POC中的应用。

（二）经济落后地区的微流控

目前，人们正致力于提升资源配置相对匮乏的发展中国家的免疫诊断能力。根据世界卫生组织的规定并遵循ASSURED标准，为有需要的地区提供经济适用、敏感性高、特异性好、操作简便、稳定、无设备要求以及便于运输或携带的理想诊断测试。而微流控具备上述技术要求，有望在实现这一目标中发挥重要作用。

最近一项从传统的 芯片实验室（LOC） 技术转向纸上芯片实验室系统的研究，部分解决了资源贫乏地区免疫诊断测试的大部分要求。如上所述，基于微芯片的微流控可以为POC免疫诊断提供各种复杂的解决方案，但不一定成本低或无需辅助设备。另一方面，侧向层流装置虽然易于操作、成本低且独立包装使用，但不能定量。纸上实验室技术是通过在纸这种低成本的一次性介质刻画图案，形成实际的微流体通道来克服侧向层流系统的性能限制。

2007年，Whitesides研究组首次展示了基于SU-8的等离子体处理纸的图案。这一理念通过同时检测尿液中葡萄糖和蛋白质时颜色的变化进行验证。这种光刻图案化方法已被改进为与印刷掩模兼容的快速模型制作方法。其功能进一步增强，主要表现为垂直堆叠的纸层能使样本分布在试剂点阵列上，可同时检测多种分析物，以及可编程3D系统来实现特定应用程序的重新构建。虽然上述系统仍需要每步手工加入试剂，但Yager研究组已研发出了一种纸芯片系统，该系统基于可溶的海藻糖屏障可自动运送和加入多种试剂。在这一问题上，最近有研究展示了用一个96区的纸盘进行血清HIV检测的ELISA技术。在这项研究中，人抗HIV-1抗体被包被的HIV-1抗原捕获，加入碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG二抗进行显色，最后用台式扫描仪进行比色检测。除了这种基于反射比色法的检测之外，还包括吸光度、荧光强度和电化学发光的检测，这些检测均可通过纸芯片实验室系统实现。值得关注的是，一个美国财团已经尝试将柔性电子元件的LED阵列、光探测器和晶体管与纸基微流控技术进行整合，该财团包括美国全民诊断公司、伊利诺伊大学香槟分校和电子初创公司MC10。

结合上述的某些改进技术并辅以相应的附加组件，就能用来解决微流控免疫诊断技术在发展中国家资源贫乏地区的使用问题。例如，Linder及其同事开发了一种在常规聚乙烯管中放置一系列液体试剂接口的方法，这如同ELISA检测时一样。在进行测定时，聚乙烯管连接于微芯片入口，在芯片出口处施以负压，通过接口即可逐个吸入试剂。将该方法应用在附着于聚苯乙烯底物的PDMS微芯片上，利用荧光显微镜，可在13min内完成血清HIV检测，其灵敏度可达到纳摩尔级。尽管这些试剂在常温储存和运输过程中是稳定的，人们仍在努力证明这种方法在发展中国家现场检测的有效性。Yager及其同事已经开发出了一种用于流式免疫检测系统中的检测抗体和捕获抗体的干试剂储存模式，以便在发展中国家使用。在芯片外制备了聚酯（检测抗体）和硝酸纤维素（捕获抗体）上的试剂干片，并在组装包含多层聚脂薄膜和PMMA的检测卡时插入。利用外部注射泵驱动液体，用平板扫描仪可在9min内完成血清中疟疾的检测，其灵敏度达到次纳摩尔级。

在临床实验室中，通常将全血离心获取血浆用于分析。对于微流控体系，目前已有多种不同的血液过滤方法。为满足资源贫乏地区的特殊要求，人们开发了手动搅拌器样的装置进行全血分离。将全血样本加到聚乙烯管中，并在搅拌器样装置上手动旋转5min以分离出血浆，通过这种方法能从100µl全血中分离出约40µl血浆。这种低科技的样本预处理方法已经得到了验证，适用于纸基微流控胆固醇的测定，理论上来说，同样适用于免疫检测。

最近，人们开发出了全血兼容的 自供电集成微流控血液分析系统（self - powered integrated microfluidic blood analysis system，SIMBAS） ，见图2-8-4。

值得注意的是，这种带有基于物质沉降血液过滤的被动一步法系统，不需要手工制备样本或额外的流体控制设备，但它依赖于真空PDMS芯片中的负压驱动来被动填充液体试剂（如存储在干燥的真空袋中）。已经证实，利用标记的生物素-抗生物素蛋白方法，通过荧光扫描仪即可检测5µl全血中的物质，其灵敏度可达皮摩尔及以下水平。为实现低配条件下的检测结果扫描分析，Whitesides及其同事开发了一种基于常用的可拍照手机的远程分析方法。检测人员通过手机拍照，将芯片试验的比色结果数字化，并将数字信息传输给经过培训的专业医疗人员进行非现场分析。尽管这种方法非常适合偏远环境，但由于照相手机和环境条件所导致的图像质量差异，使得该方法仍存在技术缺陷。只有克服了上述技术难点，基于微流控的免疫诊断技术才能在POC领域，包括发展中国家的资源匮乏地区大放异彩。

五、商业化微流控免疫诊断

POC设备和基于免疫检测的诊断产品的关键成功因素在本手册的其他地方有所描述。虽然侧向层流OTC妊娠检测已取得商业化成功，但基于微流控的免疫诊断产品的商业化却受到一定限制，见表2-8-6。微流控的诊断产品之所以稀缺，一部分原因是这种复杂但低成本的微芯片在准确度和精确性上难以达到市场和监管体系的认可。监管方面，在美国基于微流控免疫诊断法与传统的基于免疫检测的测试受相同的法规约束；再者，还得考虑POC应用，最好是实现临床实验室改进修正案（CLIA）豁免，证明该测试是“非专业用户可以轻松操作”，并且错误风险较低。而且，该方法要求精密度好、配置高，能提供具有防止故障发生的用户界面，这对商业系统的设计和开发提出了很高的要求。目前有几个这样的系统正在开发中，但监管许可和市场接受程度远比预期的要慢。

最成功的商业微流控诊断设备之一是雅培的手持式i-STAT ^® 系统。该系统基于硅片上的电化学检测，可为实验室提供实时的检测结果。目前使用最广泛的测试卡是CHEM8+，它能利用几滴全血在2min内提供8种代谢项目，包括钙离子和血细胞比容的结果。还有已通过FDA510（k）批准的用于血液学、血气、凝血和心脏标志物免疫测定的测定卡，但目前只有CHEM8+为CLIA豁免。

拜耳公司的A1cNow+ ^® 是一种手持式家用型HbA1c免疫检测设备。HbA1c是评价糖尿病患者长期血糖控制的重要指标。该CLIA免检设备包括微流控和横侧向层流组件及机载荧光检测。Alere TRIAGE ^® 是美艾利尔公司生产的一种便携式荧光测定仪，可检测肌红蛋白、CK-MB和肌钙蛋白I（TnI）等心肌损伤标志物以及D-二聚体和BNP。同样也是全血加样，样本通过毛细管作用被动吸入通道，通过荧光读数，在15min内可获得定量结果。该系统还可用于尿液样本中某些药物的定性筛查（见“Triage”相关内容（该部分未译，有兴趣的读者可参考原书——译者注））。

Biacore™ X100及T200系统是一种无标记的SPR技术，该510（k）批准的系统旨在作为开发平台，用于实现定制化检测，是一种使用注射泵驱动液流的一次性多通道微流控技术。

已被510（k）批准的美克罗尼公司的ABORhCard ^® ，可同时定性检测个体的ABO血型和Rh因子。该检测卡单个测试一次性包装、信用卡大小，通过检测手指末梢血，几分钟内便可目测结果。索尼公司最近已将这种微流控驱动技术收购，以寻求在医疗和保健领域的多元化发展。

日本Wako公司的i30 ^® 微流控免疫分析仪已被510（k）批准生产，该免疫分析仪整合了复杂的微流控技术、电泳技术以及免疫化学检测技术来检测肝癌风险标志物甲胎蛋白异质体（AFP-L3）和脱-γ-羧基凝血酶原（DCP）。该检测卡可以并行分析多达6种标志物，最快可在10min内出结果。

美艾利尔TRIAGE ^® 检测系统最近正式推出新一代CE认证的心脏标志物检测卡，包括单通道高敏TnI，双通道TnI和BNP（Cardio2）以及三通道TnI、BNP和CK-MB（Cardio3）。通过提高TnI检测灵敏度，这些检测卡可测量出99%人群的TnI浓度，帮助急诊科更早地诊断急性心肌梗死并改善患者预后。卡拉洛斯诊断公司生产的PSA检测仪最近通过了CE认证，它基于微流体芯片技术，是一款信用卡大小、小型银标记的高灵敏度分析仪，能够在数分钟内从手指末梢的全血样本中得到定量检测结果，见图2-8-5。

除了上述市场上已在使用的诊断产品外，还有大量非常有前景的处于开发阶段的免疫诊断设备。特别是，目前正在从传统的外置读卡器发展为完全集成的一次性检测卡系统，从而无需额外仪器，并且用户操作也更为简单。MycroLab公司的Mycro ^® Check检测系统就是基于一次性的Mycro ^® Card卡，该卡包括先进的微流控装置、电子设备和显示屏。Molecular Vision的BioLED™平台将有机发光半导体（OLED）和有机光电探测器（OPV）与注塑成型的微流控芯片相结合，形成了低成本和完全一次性的POCT免疫诊断产品。

六、芯片、免疫检测和蛋白质组学

1961年，Feinberg首次报道了生物分析芯片的使用。该技术先将琼脂薄膜浸入自身免疫性甲状腺病患者的血清中，再将几微升甲状腺球蛋白抗原点在该膜表面，如果观察到免疫沉淀反应，即表明甲状腺球蛋白和患者血清中的抗体发生反应。醋酸纤维素膜条的出现使该技术得以改进，但直到几十年后，Ekins及其同事才进一步发展了这一概念，推导出了环境分析物理论，并基于微型化可增加检测灵敏度的理念，证明了多点和多分析物免疫检测的高灵敏度。这是第一个真正意义上的抗体芯片，并显示小型化多重免疫检测可能对临床诊断产生重大影响。然而，芯片技术首次取得重大进展是在基因组学领域，伴随高精度液体处理机器人技术和光学扫描仪的出现。随着人类基因组测序的完成，高通量DNA芯片、mRNA表达谱以及单核苷酸多态性分析得到了进一步发展。就生化和诊断效用而言，由于蛋白质翻译和降解速率上的差异，mRNA水平的变化并不一定与蛋白质水平的变化成比例。此外，核酸检测并不能反映蛋白质翻译后修饰，而这种修饰对蛋白质功能是至关重要的，且一个基因可以编码多种不同的蛋白质。由于控制细胞活性的是蛋白质而非mRNA，因此鉴定蛋白质本身就很重要。由于大部分技术来源于早期基因组芯片，在过去十年中，蛋白质微阵列技术得到了很到的发展。由于人类蛋白质的数量比24 000个蛋白质编码基因大一个数量级，可能多达10 ⁶ 个蛋白质，因此蛋白质组学研究人员的任务是相当艰巨的。微阵列能够在单个实验中检测数百或数千种不同的蛋白质，可成为解决该问题的有力工具。此外，芯片技术还可广泛用于各种应用，包括药物开发和分类、生物标志物检测、患者疾病的诊断及疗效监测等。由于通常是低丰度蛋白质提供最重要的生物信息，因此更需要高灵敏度、特异性和高通量测试平台，用于对蛋白质进行定性和定量检测以及进行健康与疾病的差异分析。

（一）芯片模式

芯片的基本概念是在可定义的位置（通过空间位置或光学识别）使用包被的捕获分子特异地结合单个分析物，若存在不同的捕获分子，则可同时检测复杂混合物中的多种成分。在过去的十年中，人们设计了各种各样的阵列模式。阵列通常可分为两类： 正相蛋白微阵列（forward - phase protein microarrays，FPPMs） （进一步分为分析抗体阵列和功能蛋白阵列）和 反相蛋白微阵列（reverse - phase protein microarrays，RPPMs） ，见图2-8-6。

在一种形式中，分析抗体微阵列作为经典的两位点非竞争性免疫检测法的微型版本，通过固定在载玻片上的抗体阵列文库来捕获样本溶液中的靶蛋白，随后使用针对该蛋白质上的不同抗原决定簇的标记二抗检测靶蛋白。标准的检测方法包括荧光法、化学发光法和比色法。这种微阵列通常用于分析复杂的蛋白质混合物，以测定单个样本内的结合亲和力、特异性和蛋白质表达水平。抗体微阵列是分析微阵列中最为常见的形式。该技术似乎对具有高质量抗体、特征已明确的蛋白质更为有效，但通常情况并非如此。为了避免对每个目的蛋白质都需要匹配抗体对，可以选择在与捕获抗体一起孵育之前，简单地标记（如荧光素标记）样本中的所有蛋白质，通过这种方法可以直接比较两个样本。该方法的缺点是对样本中低丰度蛋白质通常难以高效标记，并且可能由于单一抗体的交叉反应性而使特异性降低。

不同于分析芯片，功能蛋白质芯片是由单个、全长功能蛋白或蛋白结构域制备的，用于研究整个蛋白质组的更广泛的蛋白结合事件。功能蛋白质芯片可以研究不同形式的蛋白质相互作用，包括蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA、蛋白质-磷脂和蛋白质-小分子。

反相（间接）芯片是将包含复杂蛋白质混合物的样本固定在芯片上，用标记的特异性抗体检测样本中的靶蛋白。该技术可避免每种靶蛋白需要两种高亲和力和高特异性抗体的问题。将含有复杂蛋白质成分的组织或细胞裂解物或体液印迹在芯片上，每张芯片用不同的抗体探测。每张芯片可以固定多个不同的患者样本或系列稀释的样品。该技术非常适合于在临床研究中大样本受试者的筛查。

（二）芯片制造

对于核酸芯片，材料应具有共同的化学特性，因此无论核酸序列如何，都可以使用通用的方法将其固定到芯片上。在蛋白质芯片中，载玻片的表面性质和固定方法会对蛋白质的构象、功能和稳定性产生深远的影响。因此，为了在保持蛋白质构象和功能的同时，使结合能力最大化，人们尝试了许多不同的技术。随着用于DNA阵列的设备能够适用于蛋白质芯片，人们在启用自动打印机和激光扫描仪之后选择显微镜载玻片作为载体。在此之前，人们尝试了聚偏氟乙烯、硝化纤维素、聚苯乙烯、琼脂糖、PDMS和醛基活化的普通玻璃等。这些方法和其他如包被多聚-L-赖氨酸或通过硅烷或环氧衍生物共价附着于玻璃表面的方法，均可使载玻片表面的蛋白质产生一个随机方向，在某些情况下，这会影响蛋白质检测。亲和标签可以避免上述问题，在可重复的方向上提供稳定的连接。典型的例子是在镍表面使用6xHis标签、N端GST标签和麦芽糖结合蛋白质。

早期制作蛋白质阵列的其他方法包括：在二氧化硅表面上吸附 n -辛癸基三甲氧基硅烷的sSAM，二氧化硅预先用紫外光刻技术将其压成微米大小的阵列；将RNA-蛋白质融合杂交到一组表面结合的DNA捕获探针上来实现自组装；点在玻片、包被金的硅片或塑料表面（如聚苯乙烯）；电喷雾沉积于镀铝塑料上和固定在玻璃表面的聚丙烯酰胺凝胶小垫片（如100µm×100µm×20µm）内。

为了将蛋白质或抗体点在芯片上，人们使用了两种机器人微阵列打印机：接触型和非接触型。接触型打印机使用金属针直接与载玻片接触，在玻片上放置纳升级的蛋白质或抗体溶液，针的大小决定加样体积。用实心针点阵需要在每次应用后补充液体；使用带有毛细管作用填充内部储层的空心针，可以在一次填充后进行多次应用，点样的体积取决于接触时间。非接触型打印机通过传统的喷墨式、压电脉冲或电喷雾沉积释放出定量液体。后一种打印机提供了更精确的流体输送，从而改善了点与点之间的差异，尽管它们通常需要更大的样本量，有时还可能会出现点样位点错误。

现在许多商业组织提供用于打印阵列、执行测试和光学测量的预制或定制阵列和自动化设备。例如，Aushon Biosystems（www.aushon.com）、Arrayit Corporation（www.arrayit.com）、Affymetrix（www.affymetrix.com）、Invitrogen Life Sciences（www.invitrogen.com）、GeSim（www.gesim.de）、Arrayjet（array-jet.co.uk）、RayBiotech（www.raybiotech.com）、R&D Systems（www.rndsystems.com）和Gentel Biosciences（www.gentelbio.com）等公司。

（三）自组装的蛋白质芯片

蛋白质或抗体芯片的一个重要问题是它们的稳定性。蛋白质尤其是抗体的稳定性有很大的差异。含有成百上千个蛋白质的微阵列极易受到单个和非可控条件下的蛋白质降解的影响。相比之下，基于核酸的阵列非常稳定。利用这一点，He和Taussig发明了一种 蛋白质原位阵列（protein in situ array，PISA） ，蛋白质直接由DNA表达，并通过识别标签序列或将组氨酸标记的新生蛋白质结合而附着在镀镍阵列表面上。该方法通过将DNA模板包被于板上（而不是混悬于PISA溶液）进行转录和翻译得到了进一步改进。 核酸编程蛋白质芯片（nucleic acid programmable protein array） 用生物素化cDNA质粒编码的蛋白质作为GST融合蛋白，与抗GST抗体一起印刷到抗生物素蛋白包被的载玻片上以捕获蛋白质。因此，表达的蛋白质与cDNA一同固定在芯片上。在He和同事的另一个发明中，蛋白质表达是在两个载玻片之间的膜中进行的，其中一个载玻片载有DNA，另一个载玻片载有试剂以捕获翻译后的蛋白质。标签蛋白质表达的同时即可转移至第二载玻片进行固定，形成的蛋白质阵列是DNA阵列的镜像。这种方法的优点是所得到的蛋白质阵列不含DNA，并且用以产生蛋白质阵列的DNA阵列可以重复使用，有报道称至少可以重复20次。

（四）芯片的抗体来源

从理论上讲，针对每种人类蛋白质的特异性抗体的研究，将勾画出整个人类蛋白质组学的轮廓。近年来也有一些倡议，建立一系列专业协作的组合联盟，但是考虑到此工作的重要性和范围，凭单个组织甚至国家之力难以承担这份重担。ProteomeBinders及其后续的AffinityProteome研究，集结了欧洲诸多组织的努力，包括 Antibody Factory公司（德国，www.antibody - factory.org） 、 人类蛋白质组学研究组织（www.hupo.org） 、 抗体资源数据库（www.antibodypedia.org） ，旨在建立一个经过验证的人类蛋白质抗体的综合目录。同样，美国国家癌症研究所已经建立了临床蛋白质组学试剂资源库，以开发针对肿瘤标志物（特别是低丰度标志物）的单克隆抗体。这些计划前景可期，且在技术上可行，并具重大的科学和经济价值。

（五）检测策略

蛋白质芯片使用的检测方法类似于常规免疫检测方法中使用的检测方法。在基于芯片的酶免疫检测中，通过使用比色法、荧光测定法和化学发光信号检测系统来检测酶标记物。

随着最初用于cDNA和寡核苷酸分析的检测和芯片激光扫描仪的普及，荧光标记物如Cy3和Cy5染料在蛋白质芯片标记检测中逐渐流行。Srivastava等人通过这一样本直接检测的常用技术比较了正常人和囊性纤维化患者混合血清的蛋白质组学特征，并在其中对这些染料的用途作了说明，见图2-8-7。

由于半导体 Q点（Q - dot） 标记具有更高的量子产量、抵抗光漂白和宽斯托克斯位移等优点，因此也被应用于蛋白质芯片，与传统的荧光标记相比，它具有更高的信噪比。也有研究人员提出磁性纳米标签也可作为多路复用蛋白质阵列荧光标签的替代品，据报道其分析灵敏度可低至飞摩尔级。

通过应用 滚环扩增（rolling circle amplification） 技术扩增出与检测抗体共价连接的寡核苷酸引物，可提高芯片免疫检测的灵敏度。该方法结合荧光检测技术，可在芯片上以高灵敏度检测出单个抗原-抗体复合物的信号（如可检测出0.1pg/ml的PSA和1pg/ml的IgE）。该方法运用到在玻璃阵列上同时检测75种细胞因子，其中45种细胞因子的灵敏度达到≤10pg/ml。另一种蛋白质芯片中使用的信号放大技术是 酪胺信号放大技术（tyramide signal amplification， 也称为 催化报告沉积技术，catalyzed reporter deposition technique） ，它使用HRP标签来催化荧光酪胺衍生物转化为能与探针上邻近酪氨酸残基相结合的活性中间体。

无论标记的类型如何，依赖标记的检测的一个缺点是标记本身有可能会改变与其连接的分子的结合特性。为了弥补这一缺陷，最近开发了许多无标记检测技术，这些技术增加了具有可以实时监测蛋白质芯片结合反应动力学的优点。表2-8-7总结了这些技术的例子。其中，SPR技术最受关注且技术成熟。其余的SPRi、碳纳米线和 碳纳米管（CNT） 以及干涉测量和椭圆偏振技术也引起了人们的极大关注，它们既具高灵敏度，又有高水平的复用能力，但这些目前仍处于研究阶段。

质谱（MS） 技术也被应用于芯片免疫检测，并且作为生物标志物开发项目的一部分，基于 基质辅助激光解吸/电离飞行时间（matrix - assisted laser - desorption/ionization time - of - flight，MALDI TOF） 质谱和 表面增强激光解吸/电离飞行时间（surface - enhanced laser - desorption/ionization time - of - flight，ELDI - TOF） 质谱的技术平台已经被研发出来。在这两种方法中，待分析的蛋白质与具有紫外吸收能力的化合物在阵列上共结晶，并通过脉冲紫外激光束蒸发。离子化的蛋白质碎片随后在电场中被加速并通过速度被鉴别，其速度由不同的质/荷比表征。这两种技术在样本靶标和分析仪设计的构造上有所不同。这些方法为每个样本提供蛋白质分析谱，并已广泛用于新的生物标志物的寻找。但事实证明候选生物标志物的鉴定和验证更具挑战性。新出现的一项MS技术在加速该过程中极具潜力。在三重四极杆质谱仪上的 多重反应监测质谱技术（multiple reaction monitoring - MS，MRM - MS） 中，根据目标蛋白质的质/荷比来筛选目标多肽离子，再对其进行碰撞诱导解离，以监测所选片段。通过使用样本中特征蛋白多肽合成的、稳定的同位素标记标准物（ 稳定同位素稀释法，SIDMRM - MS ），可以对测试进行量化并提供近乎绝对的结构特异性。复杂样本（血清）和高丰度蛋白质的存在会限制该方法的灵敏度，但可以通过免疫捕获来弥补这个不足： 抗肽抗体捕获的稳定同位素标准方法（stable isotope standards with capture by anti - peptide antibodies，SISCAPA ^® ） 是一种有效的传统非竞争性免疫检测（夹心）方法，用MS技术代替标记抗体，其检测能力达到低至纳克每毫升的水平，且CV＜20%。

（六）基于微球的芯片

在平面芯片中，是依据分析物在芯片中的空间位置来识别分析物。而在基于微球的芯片中，试剂耦合至不同的微球集合，每个微球集合可通过其颜色、大小、形状或其他编码因素来识别。这种试剂特异的微米大小的微球混合在一起可以提供多重分析，并可通过类似于常规非竞争性免疫检测的方法与样本进行孵育。其检测原理是通过使用荧光标记抗体或荧光标记链霉抗生物素蛋白和生物素标记的抗体来分析每一个分析物。洗涤后，通过流式细胞仪对微球悬液进行处理，来识别微珠并测量结合的免疫复合物的荧光。基于微球的芯片的检测方法稳定、灵活，且可以通过使用标准的实验室液流处理系统来轻松地实现自动化，从而提供与传统ELISA相当的性能。

最普遍的基于微球的平台是Luminex公司的xMAP技术，它使用100个不同颜色编码的5.6µm直径的微球结合，以及一种可测量两个波长荧光的仪器。这种仪器首先识别出每一个微球来自哪个微珠集合，其次对结合的免疫复合物进行定量分析。这种开放式体系结构系统允许研究人员建立自己的多重分析方法，也可以从Luminex或其合作伙伴处选择各种商品化试剂盒（www.luminexcorp.com）。此外，在Luminex升级系统中，FLEXMAP 3D ^® 系统可扩展至500种微球集合，以及MAGPIX ^® 系统外形小巧紧凑，使用LED和CCD摄像取代流式细胞系统的激光和光电倍增管，来检测编码磁珠的荧光图像（参见本部分第七节“基于微球的多重免疫分析：Luminex ^® xMAP ^® 技术的发展和应用”）

其他基于微球的系统有：来自BD生物科学公司的 细胞微球阵列（cytometric bead array，CBA） （www.bdbiosciences.com），它使用30种不同光谱识别微球集合；eBioscience公司生产的FlowCytomix ^TM 多重免疫检测试剂盒，它能够通过大小和染色强度同时区分20种微球集合；Enzo生命科学公司也有类似的MultiBead ^TM 免疫检测试剂盒（www.enzolifesciences.com）。

此外，来自Immucor的BioArray Solutions BeadChip™系统使用光谱可区分的微球，但在测试前，微球混合物以单分子层固定在硅片上，检测结束时去除未结合的检测交联物，再在专业成像系统上读取芯片结果（www.immucor.com/bioarray/）。Illumina的BeadX-Press ^TM 和Veracode ^TM 技术使用全息图形编码圆柱形玻璃微球（长240µm，直径28µm）作为其多重分析系统的固相，通过读取板槽中收集的微球编码来鉴定结合在微球上免疫复合物的种类和检测荧光强度（www.illumina.com）。尽管这些技术最初是为了DNA分析而开发，但Illumina可为用户提供羧基化玻璃微球以开发他们自己所需的免疫检测方法。

微球芯片和平面芯片的相对优势已在业界引起争论，支持平面芯片的一方声称其具有更强的多重分析能力（单张芯片可进行几万项测试）、易于操作、非特异性结合低、实验室设备常规化，以及可使用不同标记物或无标记检测。而微球芯片在其多重分析能力可能性上更为有限，在测试特异性成为问题之前，测试混合物中的50种分析物的实际范围是有限的，但它们能够对每种微球进行独立的质量控制，因此更符合FDA批准用于临床诊断的验证和确认要求。

（七）应用

自从高密度蛋白质或抗体芯片的操作版本首次被引入使用以来，它们已经成为蛋白质表达谱、生物标志物筛选、疾病谱、抗体特征、临床诊断的可靠和稳定平台，并已成为蛋白质组学研究的重要工具。

蛋白质芯片可以对少量样本中的数百种蛋白质进行平行量化分析，使研究者可以同时比较某种疾病患者和对照患者之间的浓度模式。大多数疾病特异性蛋白质组学研究都是从癌症患者的样本中进行的。例如，2005年Gao等在肺癌的研究中使用一个84种抗体阵列来探讨肺癌患者和对照组之间的区别。2006年Sebastiani研究组在乳腺癌研究中使用149个癌样本检测8个蛋白质与存活的相关性。在2008年另一项乳腺癌研究中，Sauer等利用54种蛋白质筛选，发现其中5种蛋白质标志物组合可以对乳腺癌患者进行分型鉴定。2008年Linkov 等人应用19种细胞因子、趋化因子和生长因子的血浆蛋白组合模式筛选出其中5种蛋白质可用于鉴别甲状腺恶性和良性疾病。2006年Sanchez-Carbayo等使用含有254种不同抗体的抗体芯片对膀胱癌患者与对照进行区分，其检出率可达94%。也有许多关于卵巢癌患者的研究，包括磷酸化抗体的研究和应用6-plex试验在156名新诊断的卵巢癌患者和362名健康受试者中验证其筛选效率，结果显示6-plex对卵巢癌的诊断敏感性为95.3%，特异性为99.4%。Hudson等人的一项研究，使用了一个含5 005种蛋白质的芯片来识别自身抗体谱，该抗体谱能够识别卵巢癌患者血清中的94种抗原，选取筛选出的其中两种抗原联合应用比单独使用CA125鉴定卵巢癌的效果更好。随着芯片研究的深入，其在前列腺癌中的应用也受到越来越多的关注，包括应用反相蛋白阵列来随访疾病进展；Miller等利用一个包含184种抗体的芯片检测了33个前列腺癌患者和20个对照组血清，在这两组人群中鉴定出5种显著差异表达的蛋白质。另有Shafer等人的研究表明，血小板反应蛋白-1可以区分良性和恶性前列腺疾病，但该蛋白质与PSA无关。

其他临床应用实例还包括在400例暴发的严重急性呼吸综合征的血清样本中，使用含有82种蛋白质的冠状病毒蛋白质芯片进行的研究，以证明蛋白质芯片可用于大规模地鉴定血清中的病毒特异性抗体；Bozza等利用蛋白质芯片评估了17种细胞因子作为脓毒血症特异性生物标志物，以确定其与器官功能障碍相关的生物标志物。

许多商业化芯片产品现在可供科研使用，包括蛋白质芯片和抗体芯片，如细胞因子、趋化因子、肿瘤标志物和生长因子等。表2-8-8列出了可供研究使用的商用平面芯片系统的示例。

基于微球的系统主流产品是Luminex公司的xMAP和MAGPIX系统，为了满足科研需求，Luminex及其合作伙伴（Millipore、R&D Systems、Bio-Rad、Invitrogen、Innogenetics、Inverness Medical、Rules-based Medicine、Affymetrix和Zeus Scientific）还可提供大量的测试项目组合，覆盖自身免疫性疾病、心脏标志物、炎性疾病、细胞凋亡、细胞信号、细胞因子、趋化因子和生长因子、内分泌、代谢标志物和神经生物学等。其他基于微珠系统的商品化科研产品包括BD生物科学CBA系统的黏附分子、细胞因子、趋化因子；eBiosciences FlowCytomix系统的黏附分子、细胞因子、趋化因子、心血管标志物和肥胖相关标志物；以及Enzo Life Science MultiBead ^TM 系统的细胞因子和定制组合项目。

FDA认证或欧洲CE标识的多重分析芯片产品更加有限，迄今为止仅限于单个测试项目获得认证的多分析物测试组合。Luminex多重分析系统主要应用于通过较少检测项目即可诊断的临床疾病，目前可用于临床检测的产品列表即反映了这一点，主要以全身免疫性疾病和传染性疾病的诊断应用为主（表2-8-9）。

（八）芯片在临床诊断中的应用展望

芯片能同时分析成百上千种蛋白质间的相互作用，理论上可有力推进生物标志物探索项目的开发，但目前收效甚微。在过去的15年中，新型蛋白质分析物引入常规临床使用的转化率每年平均仅有1.5项。研究人员认为，造成上述困境的原因是缺乏高效的大样本验证技术平台、临床样本获取受限，以及缺乏明确且连贯的生物标志物开发流程等。另一种观点认为，临床实验室缺乏新产品也反映出行业风险规避、学术界专注于科学新发现，以及研究人员对满足监管机构要求的高标准的稳定性和可重复性缺乏理解。后面的观点已被蛋白质组学研究界广泛接受，为了缩短候选生物标志物的发现到临床应用的流程，人们已经采取了一些举措来消除转化医学研究人员需要验证基于蛋白质多重分析的特定分析测量标准的不确定性。在此背景下， 美国国家癌症研究所的癌症临床蛋白质组学倡议（NCI - CPTC， proteomics.cancer.gov ） 提出了生物标志物临床前验证阶段的新途径，与临床实验室组织合作制定共同的标准，并与FDA密切合作，使蛋白质组学研究界理解评估要求的注意事项。作为这一过程的一部分，NCI-CPTC成员准备了两份模拟的送审前的蛋白质多重测定说明，提交给美国FDA体外诊断设备评估和安全性办公室，以获得反馈。办公室给出的指导意见包括需要充分注意对可能影响检测稳定性和可靠性的潜在失效模式的理解，并在验证过程中相对于样本收集和测试，需要充分注意选择适当的预期用途群体。

从单个样本获得的多个测试结果的可用性在质量控制方面提出了新的挑战，无论这些结果是单独报告的，还是作为 多变量指标检测（multivariate index assay，IVDMIA） 输入到算法中生成单个结果。一张芯片可以提供数百乃至数千种分析物的结果，但是传统实验室通过监控高、中、低分析物水平的质控性能作为日常质量控制的方案就变得不切实际，特别是对于平面芯片。多重分析项目数越多，问题就越严重。如果一种（或多种）分析物的响应超出预期范围，则必须考虑其他分析物的所得结果要如何处理。对于一些需发布（或不需发布）或没有被要求提交的结果还存在一些争议，这些结果包括商业、伦理和法律问题，所有这些都需要在测试项目上市前得到解决。这些问题更多地局限于基于微球的芯片，尤其是通量小的多重分析芯片。因此，目前FDA认证的基于微球的测试项目主要为自身免疫和感染性疾病。更高通道数的多重分析芯片目前仅限于 实验室开发测试（laboratory developed tests，LDT） ，而不是FDA许可的广泛使用项目，如Rules Base Medicine公司生产的VeriPsych试剂盒，其通过测定51个蛋白质标志物组合来辅助诊断精神分裂症。

对新生物标志物的发现，其中每种蛋白质组学技术都可能发挥作用，没有任何一项技术可以提供高水平的多重分析、高灵敏度、高特异性，并具有可与当今临床实验室分析仪相当的稳定性和可靠性。很可能，免疫亲和/质谱和抗体芯片技术的结合将为结构化生物标志物的研发提供相关工具。

在临床应用方面，现在有机会利用多重分析蛋白质通路，结合相关的解释算法，可以为患者提供特异性基线，从而使医疗状况的监测可以真正实现个性化，而不是通过与基于人群的参考区间进行比较。这种方法可以检测样本中蛋白质表达谱的微小变化，从而早期发现疾病相关的病变。考虑到芯片与现有实验室分析仪竞争的可能性，现有的检测系统可以通过要求按顺序进行测试的一个样本进行进一步的测试，从而轻松地提高通量。除非多重分析系统能够获得更多收益，如IVDMIA预期的那样或样本量非常有限，否则诊断公司不太可能在开发新的多重分析系统方面投入大量资金。

七、结论

本节阐述了为实现免疫检测小型化目标所做的大量研究工作，以及所取得的成果，特别是已经应用于解决所面临的各种挑战的创新性分析技术。然而，最终的成功和真正衡量创新的标准取决于应用领域对技术的采用程度、明确需要所解决的问题，以及终端用户组织采用该解决方案的能力。目前，在研究领域中LOC概念的采用程度要高于其他任何领域。虽然前面的讨论强调的是临床诊断应用，但是LOC和POC测试在其他领域如环境、食品和材料鉴别检测中也有应用潜能。快速、简易和便携是检测仪器的理想属性，而经济和环境问题同样需要考虑。毫无疑问，这些是实现应用最大化的关键。然而，POCT检测的经验表明（见第五部分第三节“即时检测（床旁检测）”部分），这些新技术采用的速度很慢，且在医疗卫生系统中采用新技术存在某些障碍。关键障碍之一是对新技术应用尚未满足的需求认识不足。虽然分析设备理论上应该解决未满足的需求，但在临床诊断中存在明显过度需求，这可能与医疗付费业务模式的主导有关。

此外，从中心实验室分析技术的演变中可以吸取到许多教训，早期通过开发“多通道分析仪”来扩大检测“范围”，广泛采用该技术的结果表明，患者往往在接受与其病情无关的分析物（或生物标志物）的检测。这引发了两个问题：首先，患者（或保险公司）是否应该支付不必要的检查费用；其次，报告的一部分异常结果与所关注的临床病症无关。这种经验使开放型分析仪的开发更加强调“相关”生物标志物或“生物标志物组合”检测。因此，虽然检测通量是LOC概念的主要属性，但制定正确的“生物标志物组合”并发挥临床效用仍面临更大的挑战。还必须考虑的是，在前面的讨论中提到的关于不必要检测结果所产生的伦理问题，以及对临床医学循证日益增长的需求，这也是改善患者医疗保健服务质量要求的一部分。

因此，虽然LOC诊断的原则已明确，但常规应用却明显滞后。或许还可以从POC测试中学习到其他的东西，尽管由于未能提供良好的商业案例以及客户组织无法为引入颠覆性技术的临床实践做出改变，减缓了新技术的采用速度，但有好几个方案可能被使用，这些方案涉及的是多个项目检测。因此，当必须对一名患者依次进行少量项目检测时，单个分析物POC测试显得十分耗时。然而，尽管LOC解决方案可能正确，但我们所面临的挑战在于所选择的项目是否能够同时平行检测，因为在临床有关的检测项目菜单中可以提供许多检测项目；此外，这些与疾病相关的检测项目并不总是限于使用免疫检测原理对分析物进行检测。

因此，这就引发了另外两个问题：首先，LOC设备是否可以采用多种分析技术？其次，选择LOC设备的真正优势是否在于制造的灵活性，以及生产多分析物一次性设备组合的能力，该组合是否取决于客户？

毫无疑问，小型分析设备具有广泛、巨大的应用前景。此外，许多客户需要的，尤其是感兴趣的分析物范围内，相关产品已被逐步开发。然而，将其转化为最适合的设置、（具有即时响应且不需要任何专业技术知识的移动设置）、生产功能强大的设备和单测试/单分析物检测试剂或仪器以满足客户个性化需求，仍然是一个挑战。

八、参考文献和进一步阅读

（贾克刚、侯敏　译，陈福祥　审） TD6EbdzUN+0Gp1XIwc/s7TrPCc3+e2p4mh5E1GYZ6V60owQuJHKzE2fVo1io6ZMn