第三节
侧向层流免疫检测系统：从当前的技术发展水平到下一代高灵敏、定量快速检测的演变

在诊断技术中，存在着一个传统的从检测手段和应用场景上连续演变的特点，即从高度准确的需要基础设备和集中式的方法，跨越到不那么精确的但可以用于分散的或用于 床旁（point of - care，POC） 的几乎不需要或者很少需要基础设备的检测方法。一般认为 侧向层流免疫检测（lateral flow immunoassays，LFIAs） 在这个连续演变的过程中具有相当重要的地位。换言之，侧向层流技术过去被认为是一种解决简单问题的廉价方法，但目前事实已不再如此。

技术的进步允许LFIA的性能扩展到需要更高准确度和灵敏度的应用中，同时从基础设备需求和用户友好性的角度仍保持了该技术的优势（几乎不需要或很少需要基础设备）。这使得该技术在分散的测试环境、医疗和其他方面的应用得到了改善。此外，发达国家把该技术进步应用于临床检测，使LFIA模式功能更强大，甚至可以执行复杂实验室系统的功能。这种LFIA模式利用侧向层流试纸条作为高度特异性平台的一个组成部分，同时利用读取器、专门设计的样本处理设备，以及具有机载功能的盒式解决方案等先进的实用性技术——从本质上创建了以侧向层流模式为核心的实验室分析仪。该项技术的其他应用处于这两端之间，需要高性能和易用性，加上用于高端现场应用的可移动的、实用性的技术。简言之，LFIA作为一项曾经与基于实验室条件的测试没什么关系的技术，现在越来越被视为是一种真正通用的技术，能够在整体应用场景的所有端都具有足够的性能。

为了适应这种发展方向，LFIA技术在物料、试剂、开发方法、制造设备、制造工艺技术和引进新一代的实用性技术方面都进行了不断地改进。本节主要概述侧向层流技术的基本原理，并讨论设计、开发、制造和支持技术中的关键要素，这些要素使这种检测技术能用于当今高要求的应用中。

一、侧向层流概述——当前的市场机会和标准技术

（一）侧向层流市场

全球侧向层流检测的市场规模预计在2022年将达到82.40亿美元，复合年增长率（CAGR）为8%（表2-3-1）。

依据应用场景分类，侧向层流市场可以分为临床医学/床旁检测、兽医学、食品安全和环境检测（包括食物、水和环境）、药物研发和质量控制测试等类型。

在2017年，临床医学/床旁检测部分占据了最大的市场份额。人口的增加、慢性病的流行、医疗保健成本的削减压力和以患者为中心照料需求的增加驱动了临床医学/床旁检测份额的增长。

世界范围内传染性疾病的高度流行、人口的快速老龄化、对床旁测试需求的增加和基于家庭的侧向层流设备应用的增加促进了临床医学市场的增长。

食品安全部分的检测包括：食物来源的致病菌、毒物和污染物。

环境测试可以分为：空气、土壤、水、重金属、有机物和微生物。

全球化食物供应的增加需要能够帮助安全分配和保质期的快速解决方案。调节标准需要经济高效的过程和步骤，这对于食物来源的病原菌的检测尤其关键。

环境和食品安全检测受到高度的管控，且管控定期进行。因此，生产厂商同样需要对产品进行更加规律和有效的测试。

从地域上分析，全球侧向层流市场分为北美、欧洲、亚太、拉丁美洲和中东、非洲几大区域。2017年，北美占据了最大的市场份额，其主要原因为人口的快速老龄化和慢性疾病的增加。

这些数据不包括非传统或者涉及机遇市场增量如消费者健康、生物学、化学或者放射防御等应用，这些领域在某个时间点有非常显著的增量潜能。

（二）标准侧向层流检测的结构

LFIA的典型配置如图2-3-1所示。传统设计的检测法由多种材料组成，每种材料都有一个或多个用途，它们相互重叠，用压敏黏合剂嵌在背板卡上。

LFIA检测由几个区域组成，通常由用不同材料组成的独立部分构成，这里将对每个区域进行简要解释。当进行一个检测时，将样本添加到试纸条近端和 点样板（sample application pad） 中。在这里，样本会被进行处理，使其与测试的其他部分兼容。处理后的样本通过这个区域移动到 偶联物板（conjugate pad） 。

在偶联物板中被固定的颗粒偶联物，通常为胶体金或者有色的、荧光的或顺磁性的单分散胶乳颗粒。该颗粒已经偶联到待检测的特定生物成分之一上。颗粒偶联物是抗原还是抗体，取决于检测的模式。样本使干燥的偶联物重新活化，当两者都移动到试纸条的下一部分，即反应基质中，样本中的分析物与偶联物相互作用。

该反应基质是一种多孔膜，在其上固定了该检测的其他特定生物成分。这些生物成分通常是蛋白质，可能是抗原或者抗体，它们被放置在膜特定区域的条带当中，在那里它们用来捕获移动到捕获条带的分析物和偶联物。

多余的试剂通过捕获条带，并滞留在 芯状结构（wick） 或吸收板中。反应基质上的结果可以解读为捕获的偶联物条带存在或者不存在，可以通过肉眼或者读取器进行读取。

免疫检测的模式可以是非竞争性的（也称为夹心法或直接免疫检测法）或者是竞争性的（或竞争性抑制法），检测模式可以适用于定性的、半定量的，或在某些情况下完全定量的检测。直接检测法通常用于检测具有多个抗原位点的较大的分析物，如hCG、登革抗体或抗原、HIV。在这种情况下，检测条带的存在表明测试结果为阳性。需要适当少于过量的样本分析物，这样一些偶联的颗粒就不会在捕获条带被捕获，它们将继续流向第二条固定抗体的条带，即质控条带。这条质控条带通常包括一种特异性抗免疫球蛋白抗体，该抗体对偶联物上的偶联抗体具有特异性。竞争性模式通常用于检测具有单一抗原决定簇的小分子，这种小分子不能同时与两种抗体结合。在这种模式中，反应基质上没有检测条带表明阳性检测结果。不管检测条带的结果如何，质控条带仍然会形成。

（三）制造工艺和方法

图2-3-2概述了传统的侧向层流测试试纸条的通用制造工艺。通常用于制造这些系统的材料和工艺以及材料的使用方式，几乎没有发生过大的变化。

1.工艺和设备

传统的和改进的制造技术、设备及供应商将在下面进行讨论。

快速检测法的性能要求在不同的细分市场之间存在相当大的差异。然而，一般来说，LFIA的性能一直在两个主要方面受到挑战：重现性和灵敏度。缺乏试纸条与试纸条间的重现性一直困扰着LFIA检测模式的名声，且限制了这些检测在许多定量模式中的采用和应用。这种重现性缺乏的主要原因来自检测试剂中使用的材料。然而，所使用的制造工具和工艺的差异也是这种批内变异的相当大的部分。另一个因市场需求而提升到更高水平的性能是灵敏度。这是诊断市场中所有检测技术的一个普遍趋势，在考虑制造工艺和工具的情况下，必须记住的是，提高灵敏度的要求是对制造工艺提出的新要求，而不是对制造工艺功能的单纯要求。非典型的工艺，如将偶联物冻干成珠子，以及使用非标准的、非颗粒的报告分子，反过来要求新的和可控的制造技术，这类非典型的工艺正越来越多地应用于克服侧向层流模式的变异性，提高速度和灵敏度。

（1）传统的生产过程技术：批间和卷到卷

LFIA的制造所需的主要工艺如下：

1）分配。将含有包括蛋白质、表面活性剂和聚合物在内的多种复合物的液体，以一种可控的、可重现的方式添加到LFIA的组分中，是这些检测产品生产中最具有技术挑战性的工艺之一。这里主要使用了两种将试剂应用于材料当中的方法。

对于大体积液体的添加，如膜封闭试剂、样本板和偶联物板处理剂，材料的浸注是通过 浸渍（dipping） 到容器中，然后进行 印迹（blotting） 和 干燥（drying） 来完成的。

对于以可控的方式添加定量体积的液体，如检测条带和质控条带分配以及偶联物沉积，需要更可控的、高度准确的和可复现的工艺。膜测试条带和质控条带的沉积已经可以使用多种分配方法来实现，这些方法在实际的生产基础上具有量值可变性和同样可变的适用性以及可扩展性。当今在工业上广泛应用的技术基本上有3种将定量体积的试剂分配到表面的方法。

接触头分配器（contact tip dispensers）： BioDot公司的FrontLine滑动头分配器是接触头分配器的一个示例。这种分配方法的其他生产商包括Kinematic Automation和Imagene Technology。该分配器由一个注射器或其他带有一个可在膜表面拖动的柔性尖端的变容真空泵组成，通过接触头系统的液体量是可定量的，这由所使用的泵的精度决定。然而，单位长度材料吸收的液体量却不一定是可定量的或可量化的。这是因为通常使用的硝化纤维素材料的吸收率取决于材料相关的问题。这些包括：

● 膜的水合作用；

● 膜的孔径；

● 膜表面特性（光滑度、灰尘）；

● 液体因素，包括黏度和蛋白质浓度；

● 环境因素，如试纸条加工区域的环境相对湿度。

这些因素引入到沉积工艺中的变异性会导致单位长度沉积体积的变化，并可能导致生产出的条带宽度的变化。这会进而将潜在的关键的变异水平引入到定量检测系统中。此外，由于接触头在材料表面的拖拽，可能会对材料，尤其是薄膜造成损伤。然而，这些分配器往往是非常可靠的，除了仔细地清洗之外，几乎不需要维护，所以从制造的角度来看，它们可以为测试条带和质控条带试剂的相对准确的分配要求提供一个很好的解决方案。

非接触式泵驱动电磁分配器（noncontact，pump - driven solenoid dispensers）： 包括BioDot公司的 BioJet Quanti，它使用一个滴液式驱动器，就像一个电磁阀通过液压泵与一个变容真空系统，如注射泵。该方法的优点是材料与分配器头之间不接触，提高了分配时的一致性，同时最大限度地减少了分配器尖端在材料表面拖拽造成材料表面损伤的可能性。这些分配器的优点与对分配器尖端的仔细维护、防止堵塞、流体脱气以获得非常准确的分配的要求相抵消，这对制造工艺来说意味着更大的维护负担。必须充分评估和权衡分配器更准确的性能带来的好处和在可规模制造性上应用所需的成本。

定量喷枪式分配器（quantitative airbrush type dispensers）： 颗粒偶联物在具有可变表面特征的平板上的沉积，如玻璃纤维和聚酯，通常是通过浸渍或喷涂工艺来实现的。大多数颗粒偶联物，如40nm的胶体金或100～200nm的乳胶颗粒，因为会堵塞或损坏分配器头，所以不能使用电磁阀或接触头分配器进行分配。因此，AirJettype分配器被广泛地使用。BioDot公司生产的AirJet Quanti是一种用于液体或颗粒定量沉积的独特技术，它既可以用于浸渍，也可以用于基底层上细线条或斑点的生成。这种技术的另一种产品是由Kinematic Automation公司生产的。这种分配器由一个气动喷雾发生器和变容真空系统如注射泵组成。典型的发生器是一个气动驱动的气溶胶，类似艺术家的喷枪。在这种情况下，分配器/发生器以µL/s为单位提供喷雾定量输送，当它与移动同步时，可以同时产生单独的圆点和线条。

2）浸注。浸注是材料与试剂的饱和。这道工艺之后，通常是被严格控制的干燥工艺。这可以通过在试剂中浸泡材料的薄板或网状物或者使用分配器使材料饱和来实现。其中任一过程都可以使用各种样式的薄板或网状物来完成。该方法的典型应用方式是用聚合物、表面活性剂和蛋白质的溶液对偶联物或样本板进行预处理，以使其更亲水、控制流速，或使用样本处理缓冲液使其饱和。阻断试剂通常也使用浸注法固化在膜上。

基本工艺包括将材料以平板或成卷的形式浸泡在液体容器中。许多在检测中使用的材料，由于其极端疏水性（如玻璃纤维或聚酯平板），需要较长的浸润时间来确保材料与液体完全浸注。这些工艺本质上可以分批，也可以是连续进行。如果分批，将平板或薄片浸入到相关溶液中，用手或通过其他方法如超声波振动搅拌，以确保液体被均匀吸收。然后将其去除，以印迹或挤压的方式去除表面水分，并使用冻干或高温强风进行干燥。

在一个连续的工艺流程中，仍然是成卷形式的材料，以小心控制的速度和接触角通过水浴槽，然后通常是在干燥道或干燥塔中进行挤压和干燥。由于多种原因，该浸泡和干燥的工艺，尤其是在分批的模式，是导致变异性的一个主要来源。这些原因包括不均匀的液体吸收和材料在烘箱中批量性的不一致的干燥程度。

3）干燥。干燥是实现LFIA一致性、稳定性和灵敏度的关键工艺之一。在一个试纸条的生产过程中，通常需要进行多次干燥过程，每种干燥的目的各不相同。例如，当测试条带和质控条带在分配后干燥到膜上时，其目的是获得稳定的免疫反应蛋白涂层。因此，干燥过程对检测的最终性能至关重要，必须非常小心地加以控制。干燥的程度、干燥的方法和时间，对于在表面上获得有活性的、稳定的蛋白质非常关键。干燥的控制和一致性是其中的关键，因为蛋白质干燥的时间、方法和程度对于干燥后蛋白质重新折叠成有活性的构象至关重要。

一般来说，当蛋白质溶液干燥到膜表面时，由于水分从系统中挥发，蛋白质与膜表面分离。最初的电荷吸引将蛋白质带到表面，在那里发生疏水结合过程。在此疏水结合过程中，蛋白质将其疏水区域暴露于膜表面。随着时间的推移，蛋白质会发生一些重新折叠，理想的结果是形成一个有活性的构象。所有这些都是在膜润湿试剂（即表面活性剂）存在的情况下完成的，这些润湿试剂可以对过程和蛋白质的最终活性产生影响。为了在干燥过程后产生最佳的活性，干燥的程度、干燥的速度和干燥的方法都可以针对单个蛋白质进行优化。因此，控制温度、时间和湿度成为影响干燥效果和重现性的关键因素。在干燥颗粒偶联物，如胶体金或偶联蛋白质的单分散胶乳时，同样的控制程度是也很关键的。合理的水分去除程度获得均匀的干燥，对于实现干燥后偶联物的稳定性、促进偶联物平板的均匀再润湿和偶联物颗粒的有效再悬浮至关重要。

两种基本的干燥工艺已经用于侧向层流工业界：高温强风干燥和冻干。冻干本质上是一种分批的工艺，具有较低的生产能力，因此尽管其具有良好的干燥特性，但并不常用于平板。强风干燥的常用方法是批量烘箱或网格式嵌入烘箱。尽管如此，冻干在其他偶联物模式的生产中变得越来越普遍，如储存在样本采集装置中或装载盒中的颗粒化偶联物。如果设计得当，即使储存在相对湿度为20%的情况下，偶联物颗粒也可以非常稳定，并且能非常一致和有效地将偶联物释放到检测系统中。这将在本节的后面进一步讨论。

4）纵切。结合本文的使用背景，纵切是一种沿着层压板网格轴线对材料进行切割的工艺，而切割是指垂直于网格轴线进行切割，以形成单个检测试纸条或材料卡片长度。纵切主要是用于将样本的宽幅薄板或网格储料和偶联物平板材料切割成更薄的网格来进行层压。材料可以在处理前和处理后进行预纵切，这取决于整个生产工艺和材料的特性，如拉伸强度和脆性。

5）层压。层压工艺是基于使用不同材料的试纸条或网格，将其黏合到塑料背板表面的压敏黏合剂上。塑料背板带有一个保护性的释放衬里，在层压之前将其移除。通常来说，层压是使用制造商如BioDot和Kinematic Automation生产的半自动层压机来进行的，或者使用将处理过的材料卷层压成背板材料卷的联机设备来进行，这通常会形成一个符合卡片长度的材料切割过程。这些材料在后续的步骤中会进一步加工成单个的试纸条。

6）切割。切割过程用于从层压板上切割最终的检测试纸条，将其装瓶或组装到塑料盒中。基本上有三种类型的刀具：铡刀、单旋转叶片、旋转式卡片切割机。

铡刀式切割机每个切割周期切割一部分，可以用于层压板的高速切割，也可以用于单个测试试纸条的切割，以进行拣选和放置组件操作。旋转卡片切割机使用一系列旋转刀片将层压板高速地切割成测试试纸条，同时将整个层压板切割成单个的试纸条。

7）检测盒组装。典型的检测盒的形式是一个带有塑料包装的检测试纸条，也可以包括干燥剂。在这种情况下，检测试纸条要么手动放置，要么自动放置在组件的底部，顶部通过焊接或者咬合与底部固定在一起。此外，在组件中包含射频识别（RFID）标签是当前一个逐渐明显的趋势，这对基于读取器应用的功能来说不可或缺。这些标签通常是在整体组盒组装时进行编程并被插入到检测盒中。检测盒组装通常是一个工艺瓶颈，如果该工艺是手动完成的，则需要高劳动力的投入；如果该工艺是机械完成的，则需要使用复杂的、定制的机械以相当高的每分钟零件组装率来完成组装过程。

8）包装。此操作包括将检测盒包装到含有干燥剂的锡箔袋中，并且在某些情况下，还包括与检测相关的其他材料的包装。包装可以手工来完成，操作者将检测盒和其他部件放置在预先成型的袋子中，然后用旋转封口机将袋口密封。包装也可以通过机器自动完成，此时袋子的成型是与其他操作一起完成的。

（2）加工选项

对于上述工艺，两种基本的方法是可行的且是常用的，即需要大量的手工劳动投入的分批工艺，以及连续（或 卷到卷reel - to - reel ）方法，它可以减少工艺中的手工劳动部分。

1）分批制造。分批制造技术的基本前提是，长度在150～300mm（通常情况下）的单张卡片是单独加工的。这种制造工艺允许使用成本较低的设备，但缺点是手工劳动投入高、工艺可重复性差、通常情况下产品变异性高。这种加工方法通常用于产量相对较低的情况。

分批加工通常由多台式仪器来执行，包括：

● 带有分配器的XY运动系统；

● 浸渍罐；

● 烘箱；

● 手动或半自动层压机；

● 切割机。

XY运动系统通常配备至少两个线式分配器用于测试条带和质控条带，以及一个偶联物分配器。

分批加工方法对于研发和制造基本上是一样的，且可以通过使用复制的系统来扩大生产规模，实现更高产量的生产。分批加工方法有两个主要的问题：第一个是质量易受手工操作的影响；第二个是分批工艺不能直接扩展到连续工艺。其主要优点是投资成本较低和使用方便（图2-3-3）。

2）连续制造。分批加工的替代方法是卷到卷或连续加工。在该方法中，材料被加工成50～100m长的连续卷，直到层压过程结束。这将产生更好的工艺控制、更高的产量、更低的手工投入和产品变异性。

连续设备通常由试剂加工和干燥模块、加工网格纵切模块和将材料层压到背板卡片上的模块组成。连续试剂处理单元执行分配和浸渍功能，并具有连续干燥和自动QC的能力。该系统可以安装不同类型的分配器，这些分配器与分批加工使用的分配器相同，包括接触式、非接触式和喷雾式分配器。

该单元还可以容纳浸渍罐模块，该模块由带有辊压机系统的试剂储存器组成，用于使移动的网格饱和。饱和的或分配的材料网格使用集成的干燥道或干燥塔进行干燥。

连续层压系统的功能是将所有经过预处理及横切至适当宽度的材料层压至带有预纵切的释放衬里的塑料背板上（图2-3-4）。

（3）最终设备组装。

在LFIA的生产中，最终组装通常是操作最密集的工艺。这一工艺的自动化的设计和实现被一个现实情况所困扰，即塑料包装的设计通常是为个别生产商或生产线定制的。这导致需要为每个包装设计定制工具。不过最近在组装方法上的创新具有将这种定制需求的影响降到最低的潜力。组装工艺可以被视为分批的（手工的）或连续的（自动化的）。

分批组装模式基本上是手动的，需要使用用于切割、组装和包装的相关设备。所需要的设备包括切割机、塑料包装的封口工具和带有预成型锡箔袋的密封机。使用高速铡刀或旋转式卡片切割机切割大批的试纸条。然后操作人员分别将切割后的试纸条放入底部塑料包装中，放置顶部部件，并使用压力工具将这两部分卡在一起。在使用手动密封机进行密封之前，操作者将零件放入带有干燥剂和其他任何辅助成分的锡箔袋中。这种方法是成本最少和劳动投入最密集的。从质量的角度来看，这也是最糟糕的情况，随着产量和操作者数量的增加，质量可能会下降。除了最容易受到操作者错误的影响之外，工艺中的这一步骤还涉及最大数量的零部件处理操作，这些操作既可能损坏部件，又会由于与操作者相关的错误而带来一定程度的变异性。

对于高质量和/或定量检测模式的产品来说，在产品组装和包装中尽可能多地实现自动化的同时兼顾实用性和成本效益一样都很重要。环境控制的实施也是很关键的，如在20～25℃的舒适的室温下，将相对湿度控制在20%以下。实现最低资金密集度的自动化方法是使用工作站，将层压卡片和轧辊料送入切割机，切割机将切好的试纸条放置到塑料零件中。切割系统应该配备瑕疵标记传感器，用于识别在上游已经被标记瑕疵的层压板上的零件。此零部件在切割操作中被切割和拒绝。然后，塑料盒零件手工放置并从工作站取出。一旦检测试纸条受到塑料包装的保护，该设备更易于手工处理。

下一个自动化级别是实现完全连续或自动化加工。在该方法中，使用的机器集成了所有的装配操作，从切割到试纸条放置、试纸条的QC、干燥剂的放置、盖子的放置和关闭、插入到袋子中以及袋子的关闭。打印、标签以及RFID插入也包括在流水线当中。这可以以很高的速率完成并产生非常高的产能。然而，这些机器往往是高度定制的和高度资本密集型的。

在发达国家，该类试纸条加工步骤的主要供应商是Kinematic Automation和BioDot Inc。最近，已经有一些新进入到装配市场的公司，如JOT Automation（芬兰），正采用模块化的、基于机器人的方法来完成此类装配工作。这种方法具有减少定制需求数量的潜力，并可能减少资产设备成本，尤其是在组装多个生产线的时候。

（4）其他工艺

其他关键的制造过程包括盒子的成型、盒子的组装、盒子和缓冲液的包装以及其他可选的工艺，如冻干，所有这些都是根据检测设计定制的过程。还必须执行的辅助过程，包括标签和条码的打印、RFID标签的插入、带有标识、条码和用于患者识别信息的盒子的标记，或打印、袋子的密封、盒子的组装及包装。

2.总结

我们应该从一个基本前提开始，即在LFIA的制造中，要处理的是一个与生俱来的复杂系统，该系统具有大量的可以带入到产品中的变异源。许多制造步骤设计和控制的目的是尽量减少材料和试剂的变异对整个产品变异性的贡献。在设计和开发过程中必须非常小心，以确保开发的过程可以适当地扩展和控制，从而使引入到产品性能中的不必要的变异源最小化。

二、未来POC诊断性能的发展

本节介绍影响POC检测和快速诊断未来的一些更相关的技术问题。其目的是讨论改进在现场和实验室环境中使用的POC快速测试的性能，正在采用的某些开发方法的现状和关键因素，并关注在快速医学诊断方面尚未满足的需求。

POC应用的技术设计的一个主要目的是将更准确的技术扩展到分散的检测场景，在这些场景中，它们通常是最常用到的。这方面的发展正沿着多条路径进行，但可以大体上分为两个领域：努力改进现有技术的性能以及以芯片上实验室的形式开发新技术的更彻底的方法和为了应对POC环境中分子诊断系统应用的挑战而专门设计的方法。本节的重点是侧向层流，因此本次讨论的主要内容将放在改进侧向层流系统的方法上。本节后面部分也将会提到使用侧向层流技术作为分子诊断的检测组件的内容。

现有技术的改进

为了提高系统的性能，使其既可以有效地应用在应用范围的低资源端，又可以应用在发达国家环境中的高端应用端，创新是侧向层流系统的每一个关键组件的需要。在任何应用的POC诊断设备的合理开发中必须解决的关键组件技术是：

● 样本采集和处理（如浓缩和准备）；

● 识别和信号生成技术；

● 读出和信号转导技术；

● 设备（盒子）设计。

除了这些系统的设计外，精心控制的制造工艺的设计和实现对于生产具有高度重现性的、定量的或多重系统的能力是很关键的。这些系统元素中的每一个都将通过举例进行讨论。

1.样本采集和处理

对于许多应用来说，传统的侧向层流模式能够提供足够的灵敏度。然而，在许多感染性疾病的应用和检测方法中，对于灵敏度的需求日益增长，如接近核酸扩增的灵敏度（LaBarre，2011）。在侧向层流中标记和检测的标准方法不太可能达到这些应用所需的灵敏度。因此，在许多情况下，样本准备是提高灵敏度和整体性能的关键。应当记住的是，LFIA和其他需要现场检测系统的一个重要吸引力在于：它们应该在可能的情况下，在单一步骤中提供完整的“从样本到答案”的解决方案。因此，将整个系统作为一个整体来考虑是至关重要的，包括样本、采样方法、样本预处理方法以及系统中分析物的浓度。当分析物浓度对于检测过高或过低时，它都可以是一个混淆因素，样本处理可以而且必须用来克服这些相关的问题。

取样是指生成非均匀对象的代表性样本。这种不均匀性对分析方法的成功提出了挑战。作为应用于高灵敏度快速的诊断，最关键的因素不是系统的绝对灵敏度，而是尽可能获得具有代表性的样本的能力，并最终在初始样本中检测出的分析物浓度才是至关重要的。取样和预处理的方法，主要是浓缩和去除潜在交叉反应剂和减少本底噪声，是确定一个检测法是否可以检测许多分析物的关键。此外，在某些情况下，高浓度分析物可能是免疫检测法的干扰因素。

样本操作和/或处理根据样本类型可以包括多种变异来源，如包括从手指针刺或静脉全血分离血浆、过滤，以及在唾液或呼吸样本中分解黏蛋白或改变尿液的pH。

在任何要运用到分散的检测环境的检测系统中，样本收集、处理和运送的方法必须简单、稳定和可靠，并且最好是检测设备的集成组件，应该是只需要最少的依赖于用户的步骤。

侧向层流全血处理策略的具体例子将在本节的其余部分进行讨论。

（1）手指针刺全血的采集选择和侧向层流应用中用于检测的血浆分离

为全血检测设计的集成检测解决方案的设计需考虑的关键因素是从血液样本是否来自于试管开始的。若是，则需要考虑是哪些抗凝剂，或者样本是否来自手指针刺。血液样本的主要处理步骤是：

● 从管子或手指针刺采集来的定量或半定量血液样本的计量；

● 从无明显溶血的样本中分离血浆；

● 样本传送到设备，纯样本、带有追踪缓冲液的纯样本或者预稀释的样本。

创建以一种直观的、用户友好的方式实现几个或者所有这些步骤的解决方案是一个持续的挑战，况且每个检测系统的要求都是不同的。

1）样本采集和转移。如果样本要从试管中抽取，那么通过提供用于现场环境的低成本的移液器/滴管，可以相对简单地将样本定量转移到设备，或者如果在实验室条件下，也可使用定量移液器。然而，即使在这一领域也有可能进行一些创新，使用低成本、不锋利的定制设备从采血管中采集和传送固定体积的血液。这样的装置已经被设计出来了。

根据用于血浆分离和传送到设备的策略，手指针刺的应用也需要创新。手指针刺样本的采集可以使用多种方式。现成的毛细管和低成本的一次性半定量移液器一样都是常见的。然而，还可以采用一些更新颖的方法，包括使用带有集成分配移液器的毛细管，该毛细管可以方便地根据体积和重现性进行定制（图2-3-5）。使用海绵收集也是可能的，这是一种与垂直过滤选项的使用相集成的方法。

2）血浆分离和传送到检测。在快速检测法中，可以通过多种方法实现分离。

① 过滤膜（filtration membranes）： 许多侧向层流类型的系统利用一个连续的血液分离膜，如Pall Vivid™或Cytosep™膜。这些系统是相对有效的，尽管它们在可处理的样本体积上受到限制。如果它们负载过重，红细胞会释放到检测中，导致本底噪声问题。通常，为了将血浆从膜上清洗干净且提供足够的体积来使系统完全湿润，该系统需要对样本进行预稀释，或需要使用追踪/清洗缓冲液（图2-3-6）。

② 其他方法（other methods）： 另外一种方法是使用主动垂直分离，这是一种已经被用在其他应用领域的血浆分离设备的方法，如FABPulous心血管 FABP方法（FABPulous BV荷兰），如图2-3-7所示。

2.识别

识别和信号生成元件是构成满足高性能要求的分析设备的必要组成部分，它可以产生在某种程度上与待检测分析物的存在和/或浓度有关的信号。

识别元件是检测的生物识别系统，在免疫检测中，它们通常是基于抗体-抗原的，尽管一些应用需要其他方法，如亲合素-生物素或核酸杂交。仔细筛选和选择试剂对这些应用的性能至关重要。检测性能将受变量（如抗体质，包括特异性和亲和力）及一些参数（如结合速率常数和抗体类别）的影响。为了追求更高的性能，LFIA系统与ELISA系统有着不同的系统特性要求，如不同的系统结构要求。

（1）侧向层流检测抗体选择

快速检测的整体性能受包括抗体质量在内的许多变量的影响。这包括抗原特异性和亲和力（由解离常数定义）等显而易见的参数。然而，更重要的可能是结合速率常数，该常数通常不在抗体筛选和选择以及抗体分类期间进行测量。有些亚型更容易偶联或片段化，并且可能导致与纯化、溶解性和长期储存相关的特殊挑战。例如，IgG3不能与蛋白A很好地结合，并在冷冻过程中容易沉淀。

侧向层流系统中涉及的抗体主要考虑因素包括：

● 是否使用单克隆或多克隆抗体；

● 如何选择和筛选抗体；

● 如何最优化偶联；

● 如何将抗体固定在膜上；

● 如何优化抗体的特性。

1）单克隆vs多克隆抗体。对于大多数系统来说，单克隆抗体比多克隆抗体更受青睐。然而，在许多情况下，多克隆抗体也可以提供充分的结果。商业问题和抗原相关的问题也在选择中起作用。多克隆抗体的供应受各种不确定因素的影响，除非能够在单个抗体库中获得足够的产品更新换代周期所需的抗体。在一段时间内，来自单个动物的重复供血将受到显著的变异影响，并且如果该动物死亡，来自另外一个动物的抗体特征将会有显著差异。商业上的问题是，产品更新换代周期总量的需求不能提前预测，并且用另一个多克隆抗体库来替代的验证成本很高，还可能需要重新优化LFIA的其他元素来匹配新的抗体库。多个抗体库可能需要被评估才能找出最接近的匹配的抗体库（表2-3-2）。

选择用于选择和筛选抗体的方法很重要，这将在下面进行讨论。

抗体的特异性本质将在偶联物制备和膜上的固定化方面具有重要地位。

除非正在开发的检测是针对浓度高于纳摩尔的物质，否则需要具有高亲和力的抗体。然而，高“亲和力”可能还不够充分。在侧向层流模式中，这种亲和力主要由快速的正速率（ k _on ）来推动。（注意这个常数也被称为结合速率常数（ k _a ），但是 k _on 通常被用来避免混淆 k _a 和 K _a ，结合常数也被称为 K _eq 、平衡常数。）

如果考虑LFIA的动力学，那么通常会有一个0.5～1.0mm宽、流速约为0.1～0.7mm/s的检测条带区域。在大多数系统中，这会为结合到检测条带上产生1～6s的潜在时间（Brown，2009）。因此，需要高正速率的抗体。

这种情况对于偶联物更有利，因为它与分析物接触的时间更长。“有效的”结合始于偶联物的再溶解，并在偶联物通过检测条带后结束。这一时间通常为10～20s，但是对于从偶联物平板中释放出来的最后的颗粒，这个时间可能长达数分钟。需要注意的是，对于正速率非常低的抗体来说，最先释放的颗粒（通常代表大多数颗粒）将会与只有少量抗原结合的捕获条带亲密接触，导致灵敏度低于偶联物颗粒被分析物饱和情况。这就是为什么样本和偶联物预先混合会有利的一个原因（稍后更详细讨论）。

2）偶联物上的抗体。胶体金的浓度通常用520nm处的光密度或吸光度来表示。40nm金的“1OD”溶液含有9 900亿个颗粒/毫升。能结合到一个金颗粒的最大抗体量取决于金颗粒的表面积。对于胶体金来说，如果使用40nm的金，那么每个颗粒大约有150个IgG分子（表2-3-3）。

使用金颗粒时，通常并不能定位抗体的结合或用共价键将两者结合。这是为什么胶体颗粒可以优于金颗粒的一个原因。这点将在之后的“试剂信号”相关内容中做进一步的讨论。

（2）侧向层流的抗体筛选方法

采用ELISA进行抗体筛选和选择是一种常见的方法，通常涉及用感兴趣的分子包被平板。

虽然这种方法对于寻找潜在的抗体对和亲和力的相对排序很有用，但是它通常不能预测LIFA的性能。检测条件是非常不同的。通常这些筛选检测需要较长的孵育时间。因此，反应通常处于平衡状态，并且ELISA中抗体表面浓度远低于LFIA。

虽然最初的抗体筛选可以采用ELISA或类似的方法来进行，但是应尽可能早地以能够预测LIFA检测性能的模式对抗体进行测试。

这可以很方便地使用点样法来完成，该方法以实际需要执行的检测模式来测试抗体和试剂。这是一种非常简单的方法，适用于筛选大量的抗体和检测条件。它使用“1/2油标尺”，这是一个没有样本和偶联物平板的侧向层流试纸条。捕获抗体在各种条件下进行点样，以探索固定条件。抗原在小试管或者微量滴定板中与偶联物预混合，然后将试纸条浸入到该溶液中。当然，这是一种混合和运行类型，但可以预测带有干燥偶联物的标准LFIA的性能。然而，重要的是使用既作为偶联抗体又作为捕获抗体的抗体来执行此测试，因为将偶联物与样本进行预混合比使用干燥偶联物提供更长的偶联物/分析物反应时间，因此在实际系统中成对定位的性能可能会有所不同（图2-3-8）。

（3）侧向层流应用的替代捕获试剂——适配体技术

在POC快速检测法的设计和开发中，需要解决的关键元素之一就是热稳定性问题。大多数LFIA要求可控的储存条件以获得最佳稳定性。某些检测法完全不能容忍较高的温度。这在很大程度上是系统所使用的结合试剂稳定性的一个函数。这种对温度控制的要求，即使检测法不一定要保存在低温条件下，也会增加供应链的成本，并且可能妨碍其在高温现场环境中检测的使用。这对于发展中国家的诊断应用，或在发达国家中生物战、农业或兽医检测应用来说都是一个主要问题。

适配体的使用可以替代需要高热稳定性的检测法的抗体。

适配体（aptamers） 是可以结合到靶向分子的寡核苷酸或肽分子。适配体通常是从一个大的随机序列池中选择来创建的。更具体地说，适配体可以分为：

● DNA或RNA适配体。它们是由（通常是短的）寡核苷酸链组成的。

● 肽适配体。它们由短的可变的肽结构域组成，连接到蛋白质支架的两端。

核酸适配体是通过体外重复轮次筛选而设计的核酸种类。适配体在生物技术和治疗应用中非常有用，因为它们提供能与抗体相媲美的分子识别特性。除了辨别识别外，适配体比抗体更具有优势，因为它们可以完全在测试试管中设计，很容易通过化学合成来生产，具有理想的储存特性，以及在治疗应用中很少或根本不会引起免疫原性。

1990年，两个实验室独立地开发了选择技术：Gold实验室，通过指数富集（SELEX）利用配体的系统性进化这一术语来描述选择针对T4DNA聚合酶配体的过程；Szostak实验室，创造了体外选择这一术语，选择针对各种有机染料的RNA配体。Szostak实验室还为这些以核酸为基础的配体创造了“适配体”（来自拉丁语，aptus，意为“合适”）这一术语。两年后，Szostak实验室和Gilead Sciences两个彼此独立的机构，利用体外选择方案分别开发出了针对有机染料和人类促凝剂（凝血酶）的单链DNA配体。RNA和DNA适配体之间似乎没有任何系统性的差异，除了DNA内在的化学稳定性更强。

自从适配体发现以来，许多研究者已经利用适配体选择作为应用和发现的手段。2001年，位于德克萨斯大学奥斯汀分校和SomaLogic，Inc.（Boulder，CO）的艾灵顿实验室（Ellington lab）实现了体外适配体选择过程的自动化，将选择实验的时间从6周缩短到了3天。

SELEX过程已经在商业应用中得到了最广泛的应用。然而，提高了选择效率的替代选择方法也正在进入市场。诸如Base Pair Biotechnologies（Houston，TX，USA）和BioAptus（Belo Horizonte，Brazil）等公司已经开发出快速筛选适配体库和在快速周转时间内生产高纯度、高亲和力的适配体的方法，大大降低了试剂的成本。

快速诊断应用中使用适配体的主要优势包括：

● 高热稳定性；

● 定制的特异性和亲和力；

● 产生针对几乎任何表位的适配体，甚至非免疫原表位的能力；

● 生产的可扩展性——一旦选定，这些分子就会被简单地排序和生产。

在撰写本文的时候，适配体在侧向层流技术中的应用正在研究中。虽然基于适配体的检测方法的商业化到目前为止还很有限，然而基于上述优势，该技术还是显示出了如上所述的令人信服的前景。

3.信号生成

信号生成元件包括标记物和读取器或所使用的结果解读方法。对于POC免疫检测来说，大多数检测仍然是通过肉眼或使用光学读取器进行的，然而荧光、化学发光和磁场测量系统的使用越来越多。各种信号传感器也被应用在这里，包括荧光团、颗粒结合或直接标记、光学（胶体金或彩色胶乳颗粒）或顺磁颗粒。在全行业中，已经发生的变化是将读取器系统整合到POC免疫检测系统中，其中很大一部分是基于荧光的使用来实现的，这主要是考虑灵敏度、可用性和成本的原因。在降低灵敏度方面，非光学标记物如荧光颗粒，可以预期产生比典型的胶体金或彩色光学标记物高1～2个log的灵敏度。

侧向层流系统中最常用的颗粒检测试剂是胶体金和单分散胶乳。其他的选择如纤维素纳米颗粒技术（NanoAct ^TM 来自日本的Asahi K asei Fibers公司）代表了一类可以提高灵敏度、重复性和可视化侧向层流新技术。胶乳颗粒可以与各种检测试剂偶联，包括有色染料、荧光染料和磁性或顺磁性组分。特定的侧向层流系统中使用的颗粒标签和检测试剂的选择由以下几个因素决定。

● 共价偶联的需要。通常是为了稳定性、灵敏度和变异性的控制。共价结合可以在所有这些领域产生益处。活化胶乳颗粒通常是这种偶联的唯一选择，因为蛋白质与胶体金的结合通常是通过被动吸收实现的。

● 量化的需求。以侧向层流模式开发真正的定量检测法需要在开发和选择所使用的基本材料和技术方面做出大量的努力和关注。如果应用需要一种读取器技术，那么标签选择的可用选项将扩展到包括胶体金、彩色或荧光胶乳以及顺磁胶乳颗粒。

● 高灵敏度。在光学读取检测中，由于金颗粒的尺寸较小（通常在20～40nm范围内，对比这些系统中使用的彩色胶乳颗粒，则为100～300µm），从而在测试条带上可以达到较高的填充密度，因此通常可以使用胶体金而不是彩色胶乳颗粒来提高灵敏度。与典型的彩色胶乳颗粒相比，金也具有更高的颜色强度，这使在检测中能够更好地识别低值阳性结果。然而，相比之下，胶乳可以产生多种颜色，并且可以利用较深的颜色，如深蓝色染料，这些颜色与侧向层流膜的白色背景形成比胶体金更强烈的对比。纤维素纳米颗粒有许多不同的颜色，在复杂的应用中也很有用。在以读取器为基础的检测中，使用荧光或顺磁颗粒，在某些情况下比使用胶体金或彩色胶乳等光学标签，通常可以在高几个数量级的区域产生更高的灵敏度。

有些标记方式尽管并不常用，也可以进行选择，例如上转换发光物、酶、胶体碳、铂、顺磁颗粒等。这些物质也可以产生高灵敏的信号，但是由于商务、法规等原因限制，它们并未广泛使用。

（1）常规颗粒、标记和供应商

表2-3-4列举了一些LFIA中最常用的荧光染料，以及其对应的激发、发射波长。表2-3-5列举了常用的荧光信号以及对应的着色颗粒。

（2）下一代侧向层流标记物性能的改善

传统的LFIA方法包括将偶联物颗粒分配到诸如玻璃纤维或聚酯纤维等纤维性偶联物平板上。这些玻璃纤维是疏水材料，经过亲水性试剂处理，以使其具有足够的亲水性以接受偶联物。然后用高温或冻干法在偶联物平板上进行干燥。偶联物通常在高浓度的糖或聚合物中干燥和稳定。

这个过程需要多个步骤，每个步骤都包含内在的变异来源，而这些变异来源又相应地导致测试结果的变异性。偶联物平板的释放效率通常不高，而且对于偶联物颗粒来说总是变化很大。这是LFIA中信号强度标准变异系数（CV）的一个主要贡献因素，试纸条和试纸条之间的变异系数在15%～30%的范围内。为了克服这些问题，诊断咨询网络（DCN）已经开发了一些替代方法。

1）使用直接荧光标记。作为使用颗粒标记物的一种替代方法，荧光染料可以直接标记检测试剂。普遍认识表明使用荧光颗粒会使灵敏度下降。这背后的原因是，一个直径在300～400nm范围内的荧光颗粒可以容纳20 000～30 000个荧光团分子。相比之下，一个抗体通常只能标记5～10个分子。然而，实践表明，如果存在灵敏度损失也是最小的，反而系统中的CV大大减少。这可能是因为在没有颗粒存在的情况下，检测条带上的结合抗体密度会高得多，从而补偿了每个结合中荧光团的数量。从偶联物平板上释放出来的直接标记的蛋白质也要高很多，因为当在没有颗粒存在的情况下，材料的纤维中捕获的机会更少。

2）冻干法。传统过程包括使用强风烘箱或干燥道将颗粒偶联物干燥到偶联物平板上。这一过程本质上是非均匀的，导致标准侧向层流设计中偶联物性能的变化，尤其是稳定性和释放性。替代的方法是使用冻干法来制备微球，并将这些微球与检测的其他部分分开储存。这意味着偶联物不在试纸条上，而是在检测中的另外一个元件中干燥，如在将混合的样本和偶联物传送到设备之前，可以将样本添加到管子中。

从系统中去除微粒带来了许多好处，包括：

● 提高偶联物从平板释放的效率；

● 提高干燥或冻干试剂的稳定性；

● 提高释放的重现性。

这种方法的另一个优点是：偶联物和样本是预混合的，这使得抗原检测法的性能更好，并且避免了与从偶联物平板缓慢释放以及样本和偶联物的混合物缺乏活性相关的潜在问题。使用该系统，较高的灵敏度和较低的CV（＜10%）都是可能的。缺点是：这种方法的一个结果是制造工艺不同于传统的方法，需要优化和操作冻干工艺，其本质上是分批处理工艺，除非精心设计，否则会成为制造的瓶颈。微球的冻干和稳定化是一种特殊的工艺，对于不熟悉该工艺的厂家，相对来说很难将其扩展到生产批量。然而，有一些服务供应商可以优化这些类型的工艺，并根据生产规模提供冻干服务。最后，冻干微球除非精心设计和稳定化，否则对湿度高度敏感。许多冻干工艺需要将最终产品储存在相对湿度低至3%的环境中。这导致需要在侧向层流生产环境中对微球进行特殊处理，并且无法在通常的包装环境中将微球储存在盒中，而通常包装环境中相对湿度通常保持在20%或以下。成功的关键是需要一个策略，包括仔细设计微球中使用的稳定剂和辅料，使微球能够在相对湿度为20%或20%左右的稳定状态下处理和存储。

冻干法的另一个缺点是：现在可能需要两个或多个操作步骤。然而，这可以通过一些创造性的设计和开发策略来克服。例如，DCN诊断公司已经设计了集成侧向层流设备，该设备包含了多种附加功能，包括在机试剂储存和集成的样本处理功能。可以设计具有在机储存试剂功能的试剂盒，既可以冻干形式，也可以液体形式。因此，可以为用户设计操作简单的设备，仍然可以实现美国CLIA的豁免（CLIA是指1988年的临床实验室改进修正法案修正案，见“床旁测试”），但是需要确定什么定义为多用户步骤，包括样本传递、偶联物再水化，以及追踪缓冲液传递（图2-3-9）。

4.信号转导和分析处理

传统的POC免疫检测被设计成定性的、阈值的检测法，由使用者进行解释，没有读取器的帮助。这种解释方法导致了主观性问题，并且几乎不可能开发出定量的系统 。在临床和现场环境中，还存在数据丢失、患者信息错误记录以及使用者错误的可能性。开发具有集成读取器系统的检测法是许多下一代POC检测系统的关键特性，同时代表了一个重要的技术挑战，尤其是对基于现场的诊断平台来说。

目前已经开发出了市售的读取器系统，并且可以在各种环境和应用中使用。读取器可以是手持式、便携式台式（移动）或真正的台式系统。还可以购买到多种光学模式。以下的讨论仅限于比色法（如胶体金或彩色胶乳）或荧光系统。

在开发用于现场应用的仪器时，目的是设计检测和设计设备，使其具有分析过程的生物学所要求的适当水平的复杂性。这些检测的自动读取使得读取检测结果相对容易，并且减少人为错误的机会。

目前有许多读取器技术用于侧向层流应用，这些技术由不同公司生产，如Qiagen Lake Constance（德国）、Axxin Inc（澳大利亚）、Hamamatsu（日本）和LRE Medical（德国）。这些单元对于许多在“第一世界”的环境中的应用是非常理想的，它们是功能强大的、相对低成本的、经过校准的、高性能的单元，具有相关客户服务和支持。然而，对于发展中国家来说，这些读取器通常过于复杂和昂贵，并且用于校准、维护和操作的支持基础设备不到位。

另一种替代方法是使用智能手机摄像功能将模拟信号格式的检测结果转换成数字信号格式。进一步的技术进步是分析应用和算法的开发，然后查询数字数据，以提供可用的检测结果，其中还可以包括处理选项。这些产品提供的读取器解决方案可以应用于现场，并且利用现有的光学和通信技术。然而，这些在现场读取检测结果的通用方法面临一些挑战，包括平台淘汰问题、缺乏与开发人员的协调和校准问题。监管问题也将阻碍许多发达国家市场采用这种类型的技术。由于这些问题，在未来一段时间内，读取器在医疗诊断中的应用可能仍将局限于专门为该应用设计的专用读取器系统。

（1）侧向层流应用可用的光学选项

1）成像系统。成像系统的主要优点是，它们可以产生包含检测条带和质控条带的读取区域的完整图像记录。这在许多方面都很重要，包括医学或执法应用结果的存档，以及在试纸条全宽度范围内条带强度的平均，如果条带的开发中存在不均匀性，这一特性可以用来使图像获益——在定性应用中特别有用。对于功能强大的、准备在现场有效应用的读取器，这些系统中移动部件的缺少可能是一个特别的优势。此外，许多成像系统可以针对特定客户使用的标记物进行定制和优化，以减少噪声并提高检测灵敏度。这种定制允许提供读取荧光标记物的仪器，包括基于铕的颗粒或荧光分子。

随着数码相机技术的发展，图像生成和图像处理技术也得到了长足的发展。包括Axxin Inc（维多利亚，澳大利亚）在内的多家公司，已经将低成本、高性能的成像硬件整合到专用设备中。其他公司使用现有的智能手机摄像头和图像分析软件来在侧向层流系统中生成高保真的结果。所有这些都将成像能力和高性能成像分析软件相结合，该软件可以识别检测条带和质控条带的存在和位置、确定强度、扣除背景噪声，并将结果与预先编程好的校准曲线和/或阳性/阴性判定的判断值进行比较。

这些系统的缺点来自于许多方面。旧的基于CCD的技术成本较高，难以小型化。新的基于CMOS的技术虽然比较便宜，但是在图像保真度方面的性能可能较差。尽管对于所有可用的技术来说都是如此，但成像系统的成本/体积比往往是至关重要的。被认为是使用通用平台（如智能手机）的系统的主要缺点之一是平台淘汰的问题。这类平台的软件、固件和硬件都在不断发展，导致定期淘汰，使供应链的关键元素超出了服务供应商的范围。某些读取器供应商已经克服了这一问题，他们囤积其技术所基于的基础单元，以确保以这种方式向客户提供服务。其他供应商将淘汰包括在其设计阶段，允许他们仔细地选择具有实用的生命周期的组件，并计划未来的组件替代（图2-3-10）。

2）扫描系统。各种供应商，包括Qiagen Lake Constance（施托卡赫，德国）、LRE（慕尼黑，德国）和Hamamatsu（东京，日本），都提供基于扫描光学的侧向层流读取器。基本选项是点扫描系统，扫描区域较小，仅扫描反应后条带宽的10%～20%，通常与线扫描相比，线扫描是扫描整个条带宽或非常接近条带宽的位置来完成的。使用点扫描，使试纸条在整个宽度上非常均匀的反应变得至关重要，这将许多责任推给试纸条开发人员和制造商来确保不会由于试纸条中不适当的流动特性而产生异常结果。这是一个一般通过适当的设计和控制试纸条的制造过程而可以避免的问题。该扫描系统的优点在于其低成本和低复杂性（图2-3-11、图2-3-12）。

（2）总结

一般来说，对于侧向层流应用中的设计、开发和实现读取器系统都有解决方案。实现这样的系统的关键在于规格的仔细设置和合作伙伴的选择。然而，应该记住，读取器只是性能最佳测试平台的一部分，连同检测试纸条和在其中运行的设备，所有这三个元素必须一起进行优化才能获得最佳效果。

5.对下一代性能的设备设计的考虑

在设计一个具有高水平性能且重要的是在商业化环境中具有操作的自由度的完整LFIA系统时，考虑整个系统的设计是至关重要的。设计中的一些创造性可以带来巨大的性能收益。相比于标准的试纸条性能，改进的典型区域包括多路复用的能力和产生低CV结果的能力，从而实现量化。以下给出一些可能的设计方法示例，并对每一种方法进行考虑。

（1）量化和读取器集成。

当考虑在LFIA中进行量化时，检测盒设计中许多元素发挥作用。

1）样本添加的控制。在许多系统中，定量地向试纸条传递准确的样本体积变得至关重要。样本可能已经经过了预处理，如过滤或稀释。传递的体积和浓度的可容忍的误差应该仔细的计算，还有在可行性验证过程中所建立的检测所致的可容忍的误差，以及检测公可容忍误差应决定在样本处理步骤中做出的许多设计决策。

2）流量控制。在确保试剂盒中适当的和一致的流量方面，有许多工程方面的考虑。要应用的第一条规则是，除非不同试纸条之间的所有材料是相同的，否则跨多条生产线使用相同的盒子需要仔细评估。不应该使用现成的零部件。通常用于侧向层流生产的材料和工艺有相对较大的公差，这必须在盒子的设计中加以考虑。主要考虑因素包括：

● 将检测试纸条安装到盒子中——材料和层压的可容忍的误差；

● 样本板是否允许充分压缩以防止泄漏；

● 重叠/层压的可容忍的误差是多少；

● 条带位置的可容忍的误差是多少。

首先制成实际试纸条的工程图纸是很重要的，这一步通常会被试纸条开发人员忽略。这给了工程师们一个关于系统可变性和关键可容忍的误差的清晰的概念，他们必须在塑料的设备中考虑到这些（图2-3-13、图2-3-14）。

第一个关键步骤是确保添加到样本孔中的整个样本被吸收到样本平板中，没有发生溢流。特别是当读取器要扫描设备的时候，横跨试纸条宽度的均匀的条带反应非常关键。平板之间重叠处的压力点对于确保流动的均匀性至关重要。

3）读取器集成。对于读取器集成来说，还有另一组关键因素要考虑，包括条带位置的可容忍的误差，这些可容忍的误差由层压工艺和试纸条在设备中以及设备在读取器中的定位来控制。试纸条的制造过程必须加以控制，以防止在拆除和层压过程中在条带位置上发生严重的漂移。检测盒必须保持试纸条处于正确的位置，并且读取器上插口内的功能需要将设备保持在相对于读取器正确的方位。对于大多数光学系统来说，读取窗口的形状以及它如何影响试纸条的光照也是至关重要的。检测盒被光照时不应投下阴影（图2-3-15）。

（2）多重检测

如果打算要进行多重检测，应及早考虑是否在试纸条上尝试多重（如一个试纸条上有多个分析物），或者是否在单个盒子中放置多个试纸条。是否可以使用单个试纸条完全取决于检测方法和试剂，以及是否可以使用一个单独的、允许每个试剂组发挥适当功能的条件组合来将分析物提供给每个检测。这个决定可以影响读取器的选择、检测盒的设计和加工，以及生产线开发的总体方法（图2-3-1 6）。

三、总结：侧向层流的未来方向

根据过去的性能和趋势来推断快速检测市场的未来需求和方向是有难度的，而且基本上是徒劳的。例如，临床快速检测/POC市场正在发生结构性变化，包括产品购买和支付的方式、监管的方式、从传统诊断市场内外出现的新的和强大的企业，以及全新市场的出现如个体化医疗和辅助诊断。由于所有的这些原因，很难预测在未来5～10年内市场将向何处演变。

然而，从技术角度来看，侧向层流向其演变的方向也有一个相对清晰的走向。侧向层流技术可能会继续将重点放在更好的灵敏度、重现性、量化和多重的持续改进上。而它的应用向诸如消费者诊断等领域的演变，将继续推动向集成设计特性的方向发展，这些特性可以使经过最低程度或未经培训的用户能够直观地使用。侧向层流技术还将会继续发现其他应用。它跨越各种潜在细分市场的一个主要的例子就是 核酸侧向层流（nucleic acid lateral flow，NALF） 。

下一代检测方法的目标是实现分子技术的灵敏度，以及侧向层流检测试纸条的稳健性、易用性、简单性和降低成本。用于诊断应用的特异性DNA或RNA链的实验室检测的标准方法涉及固有的劳动密集型、复杂工作流程元素的应用，其中许多元素要求有自动化和高水平的质量控制，尤其是在定量检测的应用中，以产生确认有效的结果。将这个复杂的工作流程简化为一个简单的一次性的盒子或一组简单的易于执行的步骤，对于在POC中实现分子检测是一个巨大的挑战。这样做意味着处理分子诊断检测的工作流程中每一个被执行的步骤都需要被应用并被集成到一个检测设备里。

这种简化方法的一个关键元素是检测不依赖于仪器。NALF是一种已经在许多系统中成功使用的方法。准备和制造NALF设备的方法是相对明确的，并且经过充分的验证（例如，参见Piepenburg et al. ，2006）。然而，在工业规模上的实现已被证明是困难的，有限数量的几个系统已经接近商业化，包括BioHelix ExpressStrip（BESt）和SAMBA（基于简单扩增的检测）来自Diagnostics for the Real World（剑桥，英国）。目前这些研究进展迅速，预计NALF将成为下一代POC核酸检测的标准工具。

这只是侧向层流技术不断演化的一个领域中的一个例子，然而，这也是这种技术灵活性的一个主要的证明。

世界卫生组织性传播疾病诊断倡议（SDI）制定了确定的标准，作为确定检测是否满足疾病控制需要的基准。此后，这些标准作为预期是用于大多数分散的或快速检测环境条件下的诊断技术的有益基准，得到了广泛的应用。这些关键标准是可负担得起的、灵敏的、特异的、用户友好的、快速和稳健的、无需设备以及可交付给终端用户的。

侧向层流技术仍然是唯一一种广泛使用的检测模式，如果不是全部，它也能够满足大多数已经认同的标准，并在同时证明其应用的灵活性和性能保真度的能力，这种能力已经可以接近更加复杂的诊断技术。作为这种独特的特征的集合，这种检测模式很可能在未来许多年里在快速检测领域占有一席之地。

四、参考文献和进一步阅读

（李士军、杨薇　译，何建文　审） 8MRdp3fwfXLCBg5IucBIiQh05f6W1SlWEdFXHus5HgPEWxjg3VeCMZ0UuNXv2Smd