第二节
均相免疫测定

均相免疫检测法只需将待测样本和免疫化学试剂混合，然后进行检测。样本和免疫试剂发生免疫化学结合产生一种物理上可检测的信号，无须将游离标记物与结合标记物进行分离。由于均相免疫检测法的结合反应速率不受表面缓慢扩散的限制，所以孵育时间较短，通常只有几秒钟到几分钟；同时，均相免疫检测法的非分离检测方案最大限度地减少了对自动化的要求。至少从理论上来说，均相免疫检测法比非均相免疫检测法更为灵敏，这是因为非均相方法的分离和清洗步骤本身就更容易出错，并且往往会逆转弱结合反应，从而使灵敏度降低。然而，由于均相免疫检测法的样本成分没有通过清洗步骤被去除掉，由样本基质的非特异性影响而造成的检测信号的变化，使得其高灵敏度的优势往往无法实现。近期均相免疫检测相关的研究集中于避免样本干扰问题和提供与最好的非均相方法灵敏度相近或者更高的方法。

利用竞争性和非竞争性的方案，均相免疫检测已被开发应用于某些大分子和小分子物质的检测。免疫化学结合可以动态地进行，也可以在结合达到平衡后进行。每种均相免疫检测法独特的和共同的特点是，它们提供了一种机制来修饰由标签产生的、作为免疫化学结合事件函数的信号。均相免疫检测法这一特点与非均相免疫检测法形成对比，后者依赖于在分离步骤之后识别固相标签的位置。因此，大多数标签是环境敏感的传感器，对局部环境的pH、溶质浓度、电场、空间限制、辐射强度、溶剂化等变化做出响应。

首例报道的免疫检测法是均相的，但并没有使用标签。该方法的提出归功于Kraus，他在1897年创造了 沉淀素（precipitin） 这一术语，用来描述抗原和抗体混合后形成的沉淀物（Kraus，1897）。同样，最早使用标签的免疫检测法也是均相的（Meyer，1922）。该检测法采用绵羊红细胞作为标签，包被有人免疫球蛋白，类风湿性关节炎患者体内出现的抗免疫球蛋白抗体导致细胞形成明显可见的凝集，从而展现抗体的存在，这种方法被称为血凝反应。而后随着分光光度法的出现，人们发现Kraus沉淀素反应中的可见散射光可以使用比浊法来测量，从而对沉淀素的形成进行定量（Boyden 等，1947）。然而，该方法并不适合常规使用。它不仅对样本中的其他成分非常敏感，而且生成的信号是双相性的——向固定数量的抗体中加入抗原时，信号先升高后降低（通常称为前带现象或钩状效应）。这是因为只有当抗体和抗原接近等摩尔浓度时，抗体才能在抗原间形成桥梁，产生多聚复合物。在低抗原浓度下，过剩的抗体包裹每个抗原分子；在高抗原浓度下，过剩的抗原占据每个抗体结合位点。

一、颗粒凝集法

颗粒凝集法（particle agglutination） 中常见的颗粒形式包括：

（一）红细胞与胶乳

均相免疫检测法发展过程中的一个重大进步是用可控的胶乳颗粒代替Meyer法中的红细胞（Singer，Plotz，1956）。通常，抗体与胶乳颗粒或红细胞表面结合，当存在多价抗原时，这些颗粒或红细胞形成聚集体。另一种方法是，颗粒表面可以包被抗原用于检测抗体。竞争法和夹心法检测体系均可以使用。非竞争性夹心法检测的建立可以采用两个抗体包被的、能结合多价抗原的胶乳颗粒。存在的抗原越多，凝集反应越多。凝集反应虽然不像沉淀素反应那么烦琐，但足够过量的抗原会产生双相反应。此外，添加的抗原可以抑制抗体诱导的抗原包被颗粒的聚集，这种“凝集抑制”方法避免了双相反应，但通常不太灵敏。无论哪种情况，我们只需要将样本和试剂混合，并用光学方法测量凝集。Agen公司推出了该方法的一个创新模式，即使用患者自身的红细胞作为检测法中颗粒来检测HIV抗体。该检测法将HIV抗原偶联到能够与红细胞表面的抗原结合的抗体上，添加到全血样本中，抗原会立即结合到红细胞表面，如果样本中存在HIV抗体，红细胞随后会发生凝集（图2-2-1；Wilson等，1991）。

虽然对凝集进行目视观察具有一定的灵敏度，但无法定量。大多数仪器测量依赖于 透射光比浊法（turbidimetry） 或 散射光比浊法（nephelometry） 。透射光比浊法测量的是穿过样本的透色光强度，散射光比浊法测量的是与光束成一定角度的散射光强度。散射光比浊法更灵敏，但也更容易受到样本中颗粒物的干扰。由于光散射强度与颗粒浓度不呈线性关系，因此无法简单地减去样本本底。

如今已有各种策略来避免样本本底问题。通过监测比浊信号的变化率，可以有效地减少用于药物滥用的标准尿液检测法（Abuscreen ^® ，Roche Diagnostics）的问题，以及可以定量测量普通血清蛋白（ICS-Ⅱ™，Beckman）。另一种方法是检测流动相中的单个颗粒，这些 “颗粒计数免疫检测法”（particle counting immunoassays，PACIAs） 评估免疫化学反应中未聚集颗粒数量的变化（Masson 等，1981），此方法在测量低浓度分析物时最为可靠。

通过测量从悬浮颗粒散射的激光的角度各向异性（ 激光散射比浊法，laser nephelometry ）可以获得高灵敏度。光散射是颗粒大小的敏感函数，特别是当光的波长与颗粒大小相似时。与简单的比浊法相比，该方法具有更高的灵敏度，但来自于样本和试剂中颗粒物质的干扰也会增加（Von Schulthess 等，1976）。

（二）金纳米颗粒

另一个用于检测凝集反应的相关方法是使用比胶乳或者红细胞具有更大增强光散射的颗粒。胶体金属具有较高的折射率，并可以产生极强的光散射，散射光强度与颗粒大小密切相关。对于金溶胶来说，当金颗粒大小从50nm增加到120nm，可以观察到相对清晰的明显的吸收和散射光最大值从520nm增加到620nm。金纳米颗粒浓度在低的飞摩尔范围内可以被检测到。Yguerabide和Yguerabide已于1998年描述了这一现象的理论基础（Yguerabide &Yguerabide，1998）。

金纳米颗粒的凝集改变了有效颗粒的大小，这一变化反映在悬浮液颜色的变化上。虽然目前对 金纳米颗粒（gold nanoparticles，AuNPs） 应用的探索正在复兴，但基于这一现象的多种 “溶胶颗粒免疫检测法”（sol particle immunoassays，SPIAs） 早在30多年前就已经开发出来。例如，一种夹心法SPIAs通过将样本与结合了抗人胎盘催乳素（human placental lactogen，HPL）抗体的金纳米颗粒混合，并用比色计测量其颜色变化，可以检测到5.4pM的HPL。此外，包括用于检测激素的竞争性免疫检测法在内的其他检测也得到了证明（Leuvering等，1980）。目前，虽然纳米技术的兴起使人们对该方法的研究更加深入，但在灵敏度方面几乎没有改进。Liu 等人（2008）提出使用 动态光散射（dynamic light scattering，DNS） 代替光吸收来监测球形金纳米颗粒标记的抗体和金纳米棒标记的另一种抗体的凝集程度。尽管该方法对颗粒大小和形状的控制有所改善，且使用了更先进的检测方法，但游离前列腺特异抗原（prostatespecific antigen，PSA）的最低检测限（0.1ng/mL（4pM））没有本质上的变化。然而，通过将金纳米颗粒附着在磁性颗粒上，聚集的磁场增强，可使DNS检测到低至140fM的甲胎蛋白（Chun 等，2011）。

另一种检测金纳米颗粒凝集的方法是利用其在不发生光漂白的情况下吸收光的能力。基于 光热束偏转原理（photothermal beam deflection，PBD） ，这种性质被用于甲胎蛋白的检测。抗体被结合到20nm的金纳米颗粒和较大的50µm的玻璃颗粒，在多价抗原存在的情况下，每个玻璃颗粒周围会聚集很多金纳米颗粒。用强光束照射悬浮液时，每个聚集体附近会产生高度局部化的加热，聚集体附近溶液折射率的改变导致光束可测量角度的偏转。虽然较大的玻璃颗粒的快速沉降降低了该方法的便利性，但是相比胶乳颗粒的凝集反应，该检测法在灵敏度方面提高了一个数量级（Sakashita等，1995）。

（三）磁性纳米颗粒

除了金纳米颗粒的应用外，检测磁性纳米颗粒的免疫化学诱导的聚集也是检测病毒和细胞分析物的一种极具前景的方法。具有超顺磁性氧化铁核的纳米颗粒具有单磁畴，在磁场作用下会对齐。当纳米颗粒以这种方式被磁化时，它们会形成能影响水的核自旋弛豫时间的簇，这与传统的 磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI） 测量的参数相同。在一项研究中，使用具有亲水表面涂层并与抗HSV-1抗体偶联的磁性颗粒，通过台式磁共振成像仪监测弛豫时间，可以检测到100µL血清中低至50个的HSV-1病毒颗粒（0.8aM）（Perez等，2003）。利用小分子抗原可以干扰抗体包被和抗原包被的磁性纳米颗粒结合的能力，类似方法同样可以用来检测小分子抗原，随着MRI仪器在缩小体积和降低成本等方面取得进展，该方法的临床应用可能会取得进展。Lowery（2009）最近对该方法进行了综述。

Ranzoni等人（2012）描述了一种创新的方法来监测免疫化学诱导的磁性颗粒聚集，从而避免使用昂贵的仪器。向300nm或500nm抗体包被的磁性颗粒施加磁场可诱导聚集并加速抗原夹心颗粒对的形成。用旋转磁场代替静止场会使未附着的颗粒分散并诱导颗粒对的受控旋转。通过同时用激光照射样本，旋转粒子对的光散射被转换成粒子对方向改变的函数。信号可以作为分析物浓度的函数来进行分析。采用该方法，在3min之内，可以检测出缓冲液中0.4pM和血浆中5pM的BSA。

二、裂解免疫检测法

由免疫球蛋白与细胞抗原结合引发的细胞裂解是机体防御机制的基本部分。该过程依赖于补体的作用，补体是一种复杂的蛋白质混合物，通过与细胞表面的抗体结合，触发一系列级联反应，并最终导致细胞裂解。该过程是一种被深入研究但很少使用的均相免疫检测法—— 溶血免疫检测法（hemolysis immunoassay） 的基础。在待分析样本存在的情况下，与红细胞共价结合的抗原可与抗体结合。可用于与细胞结合的抗体量受样本中存在的游离抗原竞争性结合的影响。结合后，加入含有补体的血清，进一步孵育并完成裂解后，剩余的完整细胞被除去，通过血红蛋白的光吸收，来测量释放到溶液中的血红蛋白浓度（图2-2-2）。由于相对较少的结合事件即可导致许多血红蛋白分子被释放，因此该方法的检测灵敏度接近于放射免疫检测法（Arquilla&Stavitsky，1956）。

尽管溶血免疫检测法在早期有所成就，但现在已经成为历史。红细胞难以储存，操作方法很复杂，补体不稳定，并且必须采取措施使样本中可能存在的补体失活。许多克服这些问题并提高检测灵敏度的尝试已经取得了一定程度的成功。一个更简单的方法是测量释放的血红蛋白的过氧化物酶活性而不是它的光吸收。由于荧光或化学发光底物不进入细胞，因此使用此类底物可以避免细胞去除的步骤。然而，试剂稳定性和样本组分的干扰问题仍然存在（Tatsu&Yoshikawa，1990；Tatsu等，1992）。

裂解免疫检测（lysis immunoassays） 的一个重大进展是，当人们发现在抗体与表面抗原结合时，比红细胞更稳定的 脂质体（liposomes） 也可以被补体裂解（Kataoka等，1971；Kinsky，1972），释放的物质不再局限于血红蛋白。在脂质体形成的过程中，几乎所有的溶液中的化合物原则上都可以被包裹。蛋白质和其他大分子几乎可以被无限期地保留，而足够亲水的较小分子只能缓慢地渗漏出来。研究已经发现了许多能被包裹的标签。被包裹的荧光化合物在足够高的浓度下通常会被淬灭，仅在被释放时才会产生荧光（Yasuda等，1988），而表现出浓度依赖性的染料也有类似的表现（Frost等，1994）。稳定的氮氧自由基被捕获后，其溶液在稀释时显示出 电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR） 光谱的变化（Chan等，1978）。被包裹的螯合剂释放后，可与稀土元素离子结合形成荧光复合物（Ius等，1996）。被包裹的酶底物在释放时可被本体溶液中存在的酶转化为可检测的产物（Thompson&Gaber，1985），且释放的辅酶也可以与相应的脱辅酶反应（Haga等，1990）。

基于 包裹化酶（encapsulated enzymes） 的使用，商业化脂质体裂解免疫检测法的开发已经引起了广泛的关注（Canova-Davis等，1986；Yu等，1987）。酶不仅能够抵抗渗漏，还提供了无限放大的机会，因为每个脂质体都可以释放许多酶分子，而每个分子可以产生许多可检测的产物分子。遗憾的是，这种潜在的强大方法的实际应用难以发展。用于稳定标准化补体溶液的方法尚不明确，并且血清样本中补体活性和抑制剂的存在也未被成功克服。

三、自旋免疫检测法

Coons首次提出免疫检测中可以利用除颗粒之外的其他分子报告基团，他使用荧光素标记的抗体来使抗体与组织切片的结合可视化（Coons等，1942）。尽管荧光标签最后变得非常有用，但稳定的氮氧自由基是均相免疫检测法中第一个常用的报告基团。氮氧自由基具有一个未配对的电子，用 EPR光谱（EPR spectroscopy） 可以检测到。电子具有1/2的自旋，在磁场中有两个（2S + 1）取向。这些电子状态之间在依赖于场强的精确微波频率激发下可以发生跃迁。紧密相关的氮核具有S = 1，提供了3个可能的局部磁场，因此存在3个独立的共振频率。当涉及磁场中氮氧化物基团的取向时，这种超精细耦合是各向异性的。当分子相对稳定时，氮氧化物溶液中许多可能的取向产生宽的光谱。然而，如果分子足够小，由于分子的快速转动而导致超精细耦合的平均化，则产生清晰的三线光谱。

小的氮氧化物标记的药物，如吗啡与抗吗啡抗体的结合会大幅度降低其转动的速率，从而导致谱线变宽（图2-2-3）。在游离吗啡存在的情况下，氮氧化物标记的药物的结合会被抑制，谱线变窄，这是“ 自旋免疫检测法（spin immunoassay） ”的基础，自旋免疫检测法是第一种被广泛应用的商业化均相和非均相免疫检测法（Leute等，1972）。它以商品名FRAT出售，在越南战争期间，美国陆军用它筛查滥用药物的人员。该方法是完全手动的，但非常简单快速，使用毛细管吸入固定体积的尿液，然后将毛细管的内容物注入由标记药物和抗体混合物组成的试剂中，再将溶液吸回毛细管中，塞住毛细管的一端并放入EPR腔中。整个过程大约在30s内手动完成，几乎不需要任何培训。战争结束后，该方法因其灵敏度差（约10 ^-7 M）和仪器昂贵而被放弃使用。

四、荧光免疫检测法

荧光免疫检测法（fluorescence immunoassays） 通常有以下几种：

（一）荧光偏振

另一种监测转动速率变化的方法是 荧光偏振免疫检测法（fluorescence polarization immuno assay，FPIA） 。光被分子吸收的差异取决于它们相对于激发光的方向和偏振是如何取向的。随后，由每个被电子激发的分子所发出的作为荧光的光一般会发生偏振。然而，自由转动的分子在它们持续被激发的期间旋转，从而使它们的取向随荧光偏振的净减少而随机化。转动越快，观察到的偏振荧光越少（图2-2-4）。这种现象首先应用于Dandliker的均相免疫检测法中（Dandliker&Feigen，1961；Dandliker等，1973）。与自旋免疫检测法一样，抗体与标记抗原结合，如与青霉素结合的荧光素，会影响标签的转动速率。游离抗原的存在抑制了结合，导致自由转动标签增加，从而减弱了发射光的偏振。最初，该方法只是实验室的一时新奇而已，这是因为商业化的荧光分光光度计还处于原始的发展阶段，并且需要进行两次差别在于偏振镜需要进行90°旋转的单独测量。

FPIA与自旋免疫检测法一样，也得到了广泛的应用，尽管主要用于小分子分析物的检测。将待测样本与抗体混合，样本中的抗原与荧光标记的抗原竞争结合抗体，抗原浓度越高，产生的偏振越少。 雅培公司（Abbott Laboratories） 主要使用FPIA在其免疫化学系统上进行治疗药物监测和药物滥用测试。该方法被弃用多年之后又取得成功，很大程度上源于改进后的分析偏振光固态方法的发展。

FPIA难以分析高分子量分析物，有以下两个原因：第一，大抗原与可能具有相似质量抗体的结合产生的转动率变化相对更小，从而导致偏振的变化更小；其次，大多数荧光标签的激发态寿命在10 ^-9 ～10 ^-7 s范围内，寿命太短不能使较大的生物聚合物发生旋转重定向。基于铼的荧光团显示出的偏振荧光寿命为3ms，虽然扩展了理论上可行的特殊应用的分子量范围（Guo等，1998），但由于淬灭影响偏振的测量，所以在长时间存在的激发态下，淬灭杂质的干扰问题越来越大。

来自外来荧光团的干扰和标签与生物样本中蛋白质的非特异性结合，在历史上限制了FPIA的检出限约为100pM的浓度。通过使用高亲水的长波长染料以及可区分本底和标签发射的延时测量，FPIA已被证实可以在缓冲液中检测低至10pM的寡核苷酸（Devlin等，1993）。2010年发表了一篇关于荧光偏振免疫在检测中应用的更详细的报道（Jameson和Ross，2010）。

（二）荧光共振能量转移

荧光（或弗斯特，Fo¨rster）共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET） 是指能量从电子激发的供体分子转移到附近具有能量可达激发态的受体分子。供体和受体之一或两者的激发态会随荧光发射而衰减。当两者都为荧光时，能量转移可以通过供体的发射强度的减少和同时发生的受体较长波长发射强度的增加来观测到。与免疫检测法最相关的能量转移机制取决于电子跃迁偶极子的通空耦合（Förster，1948）。能量转移速率与供体和受体之间距离的六次方成反比，并且与供体荧光发射和受体吸收光谱的重叠直接相关。根据所使用的染料不同，供体荧光降低50%的距离，即FRET距离 R _o ，可以接近10nm。

FRET免疫检测法最初是为了避免使用当时可用的原始方法测量荧光偏振而发展起来的（Ullman等，1976；Ullman&Khanna，1981）。该方法只需要一个简单的荧光计，且适用于小分子和大分子检测。通过将荧光供体偶联到抗原上、受体分子偶联到抗体上，可以很容易地构建竞争性免疫检测法。通常，抗体与多个受体分子连接，以确保在有效的能量转移距离处免疫复合物中至少有一个受体。在免疫（夹心）检测法中，每个抗体上可能需要多个供体和受体（图2-2-5）。通常，检测法是通过在免疫化学结合初始阶段的期间内，跟踪荧光的变化速率来进行，这减少了样本对荧光的干扰，因为通常样本的干扰在整个检测过程中是不变的。在竞争性免疫检测法中，抗原通过竞争抗体结合位点导致供体荧光减少的速率降低。在夹心免疫检测法中，由于两种抗体与抗原的加速结合，抗原浓度的增加加速了供体发射光的淬灭。与沉淀素和胶乳凝集法一样，FRET免疫检测法必须使用足够的抗体浓度，以避免在抗原过量时发生前带现象，此时只有单个抗体分子可用于与结合抗原。

FRET免疫检测法的首个商业化应用是在Syva的Advance ^® 免疫化学系统中。在该系统中，监测的是供体荧光的减少，而不是理论上更敏感的受体荧光的出现。这一环节很必要，因为难以找到一种不被用来激发供体而直接激发的荧光受体的光。然而，通过使用消光系数接近2×10 ⁶ /（M·cm）的高荧光蛋白——藻红蛋白作为供体，均相血清地高辛检测法可以获得足够的灵敏度，并可以定量测量血清中500pM的药物（在检测介质中25pM）。

通过开发专门的受体和替代的能量供体，后续的FRET免疫检测法规避了这个问题。例如，已发现金纳米颗粒（AuNPs）是高效的FRET受体，它可在不干扰受体自发荧光的条件下直接监测供体荧光。均相肌钙蛋白夹心免疫检测法证明了这种类型淬灭剂的优点，该检测法使用与AuNP结合的抗肌钙蛋白抗体和用高荧光Cy3标签标记的第二个抗肌钙蛋白抗体。两种抗体与肌钙蛋白结合后，可导致高达95%的荧光淬灭，并可检测浓度低至20pM的肌钙蛋白（Mayilo et al，2009）。类似地，石墨烯已经被证实是一种高效的受体，以荧光量子点作为供体。Förster能量转移距离超过10nm，并可以构建一种能够检测甲胎蛋白的灵敏的FRET免疫检测法（Liu et al，2010）。

量子点（quantum dots，QD） 作为能量受体的使用近来受到了相当多的关注。常用的CdSe/ZnS核/壳QD可以在2～10nm的范围内制备成各种尺寸。它们具有相似但不相同的吸收光谱，并且根据其尺寸大小，在不同波长下能有效地发出窄带光谱。因此，QD非常适合在多重免疫检测法中作为共用荧光供体的能量受体，在多重免疫检测法中，每种分析物可以通过对组合的发射光谱去卷积来进行独立分析。Geissler等人（2010）在一个模型系统中，利用时间、激发波长和发射波长分辨率的组合，使用不同的铽供体和5个不同的量子点作为荧光受体，进行了五重检测。有文献近期对量子点在FRET检测法中的使用进行了综述（Algar和Krull，2010）。

时间分辨FRET免疫检测法，TR - FRET（time resolved FRET immunoassay，TR - FRET） 的发展为荧光免疫检测法提供了重大改进。作为供体的稀土螯合物特别适用于此目的（参见第三部分“信号产生及检测系统”一节）。这些标签具有毫秒数量级的长寿命荧光，而大多数荧光物质的荧光发射都在一微秒内衰减。在短暂的光脉冲之后，来自样本杂质和已经被直接激发的受体分子的发射光迅速衰减。供体的共振能量转移激活受体分子，随之测量的延长荧光只与来自供体发射以及那些被供体共振能量转移而激发的受体分子的发射相关。与稳定状态的荧光测量相比较，本底发射的降低提供了更高的灵敏度，并且可以通过测量受体和供体发射光的比例来降低样本基质的淬灭效应。Cisbio在TRACE ^TM 时间分辨放大穴合物发射（time - resolved amplified cryptate emission） 的方法中使用了该方法，并使用了铕螯合物供体以及从红藻中获得的能接受能量的荧光基团——别藻蓝蛋白（Mathis，1993）。利用Cisbio的Kryptor ^TM 时间分辨荧光分析仪，进行了药物发现均相结合检测法。目前，时间分辨、量子点、金属颗粒以及石墨烯受体的各种附加组合形式是研究热点，它们也可以帮助进一步提高FRET免疫检测法的敏感性和多重复用。

上转换磷光体（up - converting phosphors） 代表荧光供体的另一种类型，可以避免不必要的受体和荧光样本组分的直接激发。在通常的照射条件下，与用于激发的光相比较，荧光分子发出的光波长更长。这是因为荧光分子的起初激发态在重新发光之前以发热的形式失去振动能量。在足够强度的更长波长的光激发下，通过同时或者逐步地吸收两个或者更多较低能量的光子，可以达到相同的激发态。来自激发态的荧光发射波长虽没有实质上的改变，但是却比激发光的波长更短，因为激发光是近红外的，来自受体和样本中荧光分子的本底发射是最低的。即使本底荧光强度很大，由于如1，4-双-（4-二氨基苯乙烯）苯衍生物这样的荧光分子在800nm处具有较大的双光子吸收截面，所以可与非荧光受体一起用于检测低至50pM的抗BSA抗体（Liu et al.，2008）。

基于 上转换颗粒（UCPs） 的使用是一种更稳健的上转换方法。UCPs是在晶状基质中嵌入稀土元素的陶瓷材料，这些稀土元素通常吸收970～1 000nm波长的光。该方法可制备亚微米至小于10nm大小的颗粒。由于上转换到可见光谱区域是在相对长寿命激发态的连续激发下发生的，因此并不需要很高强度的激发光（Austin and Lim，2008）。使用UCP结合的抗体和 Alexa Fluor680标记的17-β雌二醇，可以对20%的全血中低至0.5nM的雌二醇进行定量检测（Kuningas et al.，2007）。980nm的近红外激发光经磷光体上转换到660nm，继而将能量转移到发射波长为740nm无样本本底荧光的Alexa染料上。

（三）荧光保护检测法

在免疫检测法中用于调节荧光的另一种方法是对系统进行排列，使那些在免疫复合物中未被结合的荧光标签淬灭。这是一种直接的方式，无须从结合的标签中分离游离标签，且可用于将非均相荧光免疫检测法转换为均相模式。例如，竞争性免疫检测首先孵育分析物、抗体和荧光标记的抗原。抗体可以存在于溶液中或者结合在物质表面。随后加入只选择与未结合标签反应的淬灭试剂，并测量与结合标签相关的剩余荧光。

最普遍的荧光保护检测策略是用抗荧光抗体作为淬灭试剂。一些荧光团比如荧光素，只要与抗荧光抗体结合就会被淬灭。当这种结合产生不完全的淬灭作用时，非荧光能量受体就会结合到抗体上。假如荧光标签通过短链与低分子量半抗原结合，抗体与半抗原和标签的同时结合会在空间上受到阻碍。因此，半抗原结合的荧光标签会被抗荧光抗体淬灭，除非它们与抗半抗原抗体结合以受到保护（图2-2-6）。蛋白质抗原上的荧光标签受抗体结合保护的效果较差，这一问题可以通过提供一种在空间上阻碍抗荧光抗体与抗原免疫复合物结合的方法来克服。实现空间位阻的一种有效的方式是通过使用增加尺寸的抗荧光素抗体，可以通过将抗荧光素抗体与抗免疫球蛋白形成免疫复合物或者与右旋糖酐形成偶联物来实现（Zuk et al.，1979）。

荧光保护同样也可以应用于使用了荧光标记抗体的检测法，前提是结合的组分有充足的空间。当荧光标记的蛋白质抗体与固定在悬浮琼脂糖颗粒上的抗原结合时，荧光标签被隔离，不能与随后加入的抗荧光素抗体结合。游离抗原越多，标记的抗体与琼脂糖抗原结合越少，则被淬灭的荧光标签越多。通过添加包被了抗荧光素抗体的碳颗粒悬浮液可以更好地区分结合和游离的抗体。碳颗粒不仅可以增强淬灭，而且可以抑制残余的抗荧光剂抗体与琼脂上的荧光标签的缓慢结合（图2-2-7；Ullman，1981）。最近发现，高效的AuNPs和石墨烯淬灭有望取代碳颗粒淬灭，从而明显地改进荧光保护免疫检测法。

特别是对于小分子分析物的竞争性免疫检测，荧光保护检测法比FRET更有优势，因为只需要一个标签，故可以使用不同的荧光标签来进行多重检测。此外，荧光保护检测法可调节高达98%的荧光信号，相比之下，FRET只能调节30%～80%。这两种方法的灵敏度都受到样本荧光背景干扰的限制，除非使用了时间分辨荧光。如在FRET中，这一问题可以通过测量淬灭速率而不是测量加入最后一个试剂后的反应终点来最小化。这样有效地减去了静态样本的本底，虽然对脂血的样本来说，稀释后脂质的溶解而引起的光散射变化可能也是一个问题。

令人惊讶的是，荧光保护免疫检测法虽然比FRET更有优势，却很少受到关注，主要被应用于配体和细胞受体结合的非免疫化学检测。荧光标记的配体和非标记的待测化合物可以竞争细胞表面受体的结合。加入抗荧光素抗体只会淬灭未结合的偶联物，因此待测化合物的有效竞争越少，荧光强度越高（Sklar et al.，1982）。

（四）荧光波动分析

目前已经发展出很多不同的基于通过检测荧光强度的时间变化来检测免疫化学结合的方法用于均相免疫检测法。抗原-荧光剂结合物与包被着抗体的胶乳颗粒的结合，当然会导致这些颗粒具有荧光性。假如颗粒上抗体的数量和亲和力足够高，则由颗粒所定义的体积内结合物浓度会比在本体溶液中更高。通过用激光扫描这些颗粒悬浮的小体积来检测结合。使用荧光波动关联方法，结合发生的时候可以观测到增强的波动，这是由于荧光颗粒在某些体积中存在，而在其他体积中不存在（Elings 等，1983）。

这种方法已被应用于均相血型鉴定系统。全血细胞用膜溶性荧光染料染色，血型特异性抗体导致的荧光红细胞的聚集可以通过荧光波动分析法检测到。为此，探针伸入到有两根光纤的溶液中，其中一根光纤向溶液中输送窄束光线，另一根光纤从光路的一小段收集荧光发射并将其发送到 光电倍增管（photomultiplier tube，PMT） 。通过使用大约1nl的扫描体积，就可以将单个细胞产生的波动与二聚体产生的区分开来，而无须等待更大的聚集物形成（图2-2-8；Ghazarossian et al.，1988）。

一种相关的方法被用于来进行高通量筛选的配体与细胞或胶乳颗粒结合的均相检测中。Applied Biosystems的FMAT ^® 系统中，表面有受体或抗体的细胞或颗粒、荧光标记的配体以及待测化合物在微量滴定孔中混合。用激光扫描孔底表面，每次只激活一小部分体积。荧光波动的大小可以用来估计标签结合的程度，这与待测化合物结合的能力呈负相关。这种方法允许标记两种发射不同波长的染料来实现多路复用。

从足够小的体积测量荧光的能力使 荧光相关光谱（fluorescence correlation spectroscopy，FCS） 能够取代荧光标签聚集体的简单检测。FCS可以在足够低的荧光浓度和足够小的扫描体积下（通常大约1fL）观察到单个分子的荧光。待检测分子可以通过它们在检测体积中扩散的特征速率来与其他的荧光物质区分开来，而这种特征扩散速率受分子的数量和形状影响。该方法可用于药物的高通量筛选，筛选条件确保游离和结合的荧光颗粒具有不同的扩散速率，可以实现灵敏的均相免疫检测。例如，Tang et al.（2010）使用荧光分子标记的抗体和结合到更大的14nm银纳米颗粒的第二抗体进行夹心免疫检测，可以检测到浓度低至1.4pM的血清甲胎蛋白。更高的灵敏度可以通过使用不同的人IgG抗体分别与40nm的金颗粒结合来获得（Chen et al.，2009）。这种颗粒具有荧光性和光稳定性（He et al.，2008），且它们的扩散特征可以被免疫化学性诱导的聚集极大的改变。在20%犬的血清中，可以检测到浓度低至5pg/mL（30fM）的人IgG。

通过使两个不同的荧光分子变得在免疫化学上相互关联，可以避免区分其不同扩散速率的要求（Winkler et al.，1999）。来自成对荧光剂的共焦发射可以很容易与非成对分子区分开。该方法被称为共焦荧光一致分析，后更名为 荧光交叉相关光谱（fluorescence cross - correlation spectroscopy，FCCS） ，通过在光谱波动分析中包括FRET的相互作用，这种方法被进一步增强。Eggeling 等人于2005年描述了各种额外的分子组合。

五、化学和生物发光免疫检测法

化学和生物发光免疫检测法（chemi - and bioluminescent immunoassay） 作为均相免疫测定的方法被深入研究。

用可能更灵敏的 化学发光共振能量转移 （chemiluminescence resonance energy transfer，CRET） 取代FRET的努力目前还不乐观。CRET不同于FRET之处只是用化学激发FRFT供体而不是用光激发。早期试验中，为了获得更高的灵敏度，使用异鲁米诺标记的多种半抗原和蛋白质抗原可以在其与荧光素标记的抗体结合时，使荧光发射更灵敏（Patel 和Campbell，1983）。尽管该检测法在灵敏度上与放射免疫检测法相当，但化学发光反应对样本组成差异的高度敏感性导致其部分性能无法接受，至少对临床应用来说是这样的。最近，高效的微分子能量受体，例如石墨烯（Lee等，2012）已被用来淬灭过氧化物酶催化的鲁米诺氧化的化学发光。使用石墨烯和过氧化物酶分别偶联两种不同抗体的均相C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）夹心免疫检测法，可在临床相关水平（nM）检测血清CRP。在类似的用于检测甲胎蛋白的夹心免疫检测法中，使用AuNPs取代石墨烯进行淬灭，在较低pM范围具有更高灵敏度（Huang 和Ren，2011）。

天然生物发光酶在免疫检测法中的使用具有潜在的优势，因为发色团通常会被隔离，受样本中可能存在的干扰物质的影响最小。 生物发光共振能量转移（bioluminescence resonance energy transfer，BRET） 作为监测蛋白结合相互作用的方法已经被深入地研究，但是令人惊讶的是BRET免疫检测法却很少受到的关注。在一个值得关注的例子中，生物发光的海肾荧光素酶被用作供体，增强的黄色荧光蛋白被用作受体；抗溶菌酶抗体的V _H 和V _L 片段分别以每种标签的嵌合蛋白形式表达；溶菌酶的存在引起两种抗体片段的结合和重组，导致在底物腔肠素存在的情况下，受体蛋白的发射光增加（Arai等，2001）。同一组研发人员论证了一种用于检测十肽的竞争性BRET免疫检测法，该检测法使用萤火虫荧光素和十肽抗原的融合蛋白以及荧光（Cy3.5）受体标记的抗体（Yamakawa等，2002），这两种方法都没有很高的灵敏度。

六、表面增强拉曼散射

拉曼光谱测量的是化学物质在辐照过程中以偏移频率散射的极小部分光。频率偏移是由电子振动耦合引起的，与激发波长无关。分子在接近金属表面时会显示出 表面增强拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS） ，可产生10 ¹¹ 倍的拉曼信号增强。AuNPs 和银纳米粒子可以产生较大的增强功能，具体取决其大小和形状以及与其他增强子的接近程度。粗糙金属表面增强的磁场可使吸附在金属表面的分子拉曼散射信号被放大。通过免疫化学诱导的颗粒与粗糙金属表面的结合，可构建高灵敏度的异相免疫检测法。近年来，人们对开发SERS均相免疫检测法表现出相当大的关注，但该方法的潜在高灵敏度尚未被认识到。Chen等人在2008年报道了使用SERS的人IgG均相免疫检测法。该方法在AuNPs上标记抗人IgG抗体和另一个增强子；粒子与IgG结合后的聚集增强了拉曼散射，但该方法的灵敏度限制在约0.7nM IgG。Li等人在2008年使用蛋白A标记的金颗粒和荧光素（增强子）标记的生物素，将生物素化IgG的模型检测系统的检测限值降低了一个数量级。相比之下，在IgG的异相夹心免疫检测法中，标记特制立方金颗粒的抗体与金表面结合，其灵敏度可达到1pM（Narayanan等，2008）。

七、酶免疫测定法

酶免疫测定法（enzyme immunoassays） 包括以下几种技术：

（一）酶放大免疫测定技术

均相酶免疫测定法于1972年被首次提出，次年以EMIT ^® （Rubenstein等，1972）作为商品名应用于尿液中药物滥用的商业化检测法，又称为 酶倍增免疫检测技术（enzyme - multiplied immunoassay technique） 。该检测法使用一种简单的“混合-读数（mix-and-read）”方法，其优点是可使用通用标准实验室分光光度计。该方法是基于抗药物抗体抑制溶菌酶-药物偶联物酶活性的能力，酶可催化细菌细胞壁水解，通过清除混浊的细菌悬液进行监测。在游离药物存在的情况下，与偶联物结合的抗体减少，从而导致清除率增加。之所以选择溶菌酶，是因为其与大的底物反应似乎容易受到抗体的空间抑制（图2-2-9，左箭头）。然而，光散射检测并不非常灵敏，且由于血清引起的细菌凝集，该方法并不适用于血清检测。

理想的酶不应存在于待测样本中，低浓度状态下也可被通用的光谱仪检出，且酶活性不受样本基质影响；此外，酶在偶联后必须保持活性和稳定性，最重要的是，产生的偶联物活性必须由抗体调节。葡糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）来自于肠膜样明串珠菌中，可满足大多数这些要求。G6PDH的相对分子质量为109kDa，包含两个相同的亚基，可将NAD转化为NADH，在340nm波长处可测量吸光度；血清中的内源性G6PDH与NADP反应，因此不会干扰测量。当半抗原与G6PDH上赖氨酸的氨基结合时，所形成的半抗原和G6PDH偶联物会受到抗半抗原抗体的抑制；尽管抗体不大可能对小底物产生空间位阻，但结合的抗体与酶之间的分子接触通过改变酶的构象产生抑制作用（图2-2-9，右箭头）；观察到的抗体抑制率可高达80%，但其抑制率的大小主要取决于半抗原的结构和抗体的特异性。增加每个酶分子的半抗原数量可提高抑制能力，但同时也会降低酶的活性。将半抗原仅靶向定位于那些具有抑制作用的赖氨酸是很困难的，因为不同位点针对不同的半抗原具有活性，因此该方法需要经常进行广泛筛选，以确定连接偶联物的合适方法和确定有效的抗体。

尽管存在这些局限性，但针对大量治疗药物的血清EMIT G6PDH检测法和针对滥用药物的尿液检测法已经被成功开发出来。目前已报道了几种利用大分子底物的替代酶，如淀粉酶、磷脂酶C、线粒体苹果酸脱氢酶和葡聚糖酶等，但这些酶要么对血清成分过于敏感，要么在低浓度时难以测量。

当前的EMIT法使用转基因的G6PDH以实现使用更少的半抗原进行更大调节，其偶联物更稳定并提供更大的检测响应。半抗原连接到每个亚基的单个半胱氨酸（没有天然的半胱氨酸）上，半抗原结合在一个位点上，使得抗体诱导的调节最大化；合适的位点可通过绘制酶表位图来确定，该表位由一个可诱导酶构象变化的抑制型抗G6PDH单克隆抗体来识别；然后利用半胱氨酸系统地一次替换该表位中的氨基酸（Ullman，1999年）；药物与半胱氨酸巯基结合制备的偶联物的活性未受影响。目前，西门子医疗公司（Siemens Healthcare）使用重组的G6PDH构建的EMIT检测正在销售，用于地高辛的检测，该检测必须对低至500pM的地高辛进行精确定量。

基于酶偶联物活性的简单调节免疫检测法的主要局限性在于针对大分子设计检测法的难度。该问题的根源是需要使抗体与酶紧密结合，从而对酶的活性产生强烈的影响。目前一种基于抗体与蛋白质类抗原形成聚合物能力的方法取得了些许成效。已经发现，辣根过氧化物酶（HRP）可被高浓度过氧化氢抑制，但当其作为一个大聚合物的一部分时，酶活性则可以得以保存（Hoshino等，1987）。利用该原理，已经报道了用于蛋白C（protein C）、甲胎蛋白和多形核白细胞弹性蛋白酶的均相酶免疫测定法。在这些检测中，抗体-HRP偶联物与抗原结合形成聚合物（沉淀素）后，当使用高浓度的过氧化氢时，其酶活性仍然能保持。该方法必须使用足够的抗体来避免前带现象，且检测的灵敏度受到系统对血清干扰敏感性的限制。

蛋白质检测的另一种方法是基于抗体-酶偶联物复合物针对大的酶底物的空间阻断潜力。这一点在β-半乳糖苷酶偶联物上得到了很好的证明。β-半乳糖苷酶偶联物通常不受抗体调节，即使当抗原很小时；然而，当底物 邻硝基苯 - β - 半乳糖苷（o - nitrophenyl - β - galactoside） 连接到大的葡聚糖聚合物上时，小抗原和大抗原酶结合物的抗体诱导调节作用被观测到（Gibbons等，1980）。该底物已应用于人IgG和CRP的EMIT检测法中。使用葡聚糖连接的荧光底物，建立了竞争性铁蛋白检测法，其检出限约为4pM（Armenta 等，1985）。遗憾的是，血清中偶有存在的低水平抗β-半乳糖苷酶抗体阻碍了该方法在高灵敏度血清检测中的应用。

（二）电荷诱导的酶活化

酶活性免疫化学调节的另一种方法是在酶与免疫复合物结合时改变酶的微环境。一种免疫复合物高度带电的CRP检测法可作为例证，该检测法又称为 电荷诱导的酶活化（charge - induced enzyme activation） 。在该方法中，CRP与抗CRP抗体-β-半乳糖苷酶偶联物结合时不会显著影响酶活性；随后加入过量的未结合的抗CRP抗体，会增加免疫复合物内的拥挤程度，并在使用大分子底物时降低酶活性；然而，如果未结合的抗体是琥珀酰化的，且大分子底物带正电荷，则由于底物对免疫复合物的库仑吸引作用，酶活性会增加（图2-2-10）。基于这一原理的蛋白质抗原和抗体的酶激活免疫检测法已经得到证实（Gibbons等，1981）。通过简单地添加大量过量的琥珀酰化抗体就可以避免前带现象。

尽管这种方法具有明显的吸引力，但也存在一些缺陷。检测混合物中浓度低至60fM的抗原可被检出，但使用超过0.1%的血清便会影响定量。因此，其实际检测限仅为60pM左右。此外，因为高灵敏度检测法的响应曲线不是单调递增的，所以虽然检测法没有前带效应，但数据处理比较困难。

（三）酶连传

酶连传（enzyme channeling） 提供了一种检测免疫复合物中两种酶接近度的方法。第一种酶可催化中间底物的形成，第二种酶再将中间底物转化为可检测的产物；当两种酶在同一溶液中独立分散时，产物的形成速度一开始较缓慢，但随着中间底物浓度的增加而加快。当两种酶在同一表面紧密结合时，这一动力学行为会发生变化；中间产物在第一种酶分子附近的局部浓度是由中间产物的生成速率和扩散速率决定的。局部稳态浓度迅速达到高于本体溶液中的浓度；第一种酶的几个分子在一个表面局部化地增加了中间底物的形成速度，从而增加了它的局部浓度。当第二种酶与这个表面结合时，它会经历一个相对恒定的中间体浓度升高，从而导致最终产物的生成速率线性增加。

均相酶连传免疫测定法利用了这一现象（Litman等，1980），包括琼脂糖颗粒、胶乳珠和微量测试孔的聚苯乙烯表面在内的各种表面均已被使用。一种酶用于标记抗体或抗原，另一种酶则过量结合于表面。通常，第一个酶附着在表面，因为这样可以获得了更多的线性动力学，尽管当酶的作用被逆转时连传也能发生。目前多种配对酶已被使用，包括碱性磷酸酶/β-半乳糖苷酶、己糖激酶/G6PDH和 葡糖氧化酶（GO） /HRP。当天然底物不可用时，如碱性磷酸酶/β-半乳糖苷酶，可以制备允许顺序反应发生的合成结构。

HIgG的竞争性检测法可以使用标记有HIgG和GO的琼脂糖颗粒来进行（图2-2-11）。在与葡萄糖反应时，这些颗粒被过氧化氢所包围；当过氧化氢扩散到本体溶液中时，其被稀释，且浓度被反应混合物中的过氧化氢酶进一步降低；当HRP标记的抗HIgG抗体在 ABTS（一种显色性HRP底物） 存在的情况下与颗粒结合时，颜色形成的速率几乎是恒定的，且与HIgG的浓度成反比。

酶连传最灵敏的应用避免使用预制表面，有利于胶体沉淀的原位形成。Ullman等人使用含有GO标记的抗 PRP抗体（Ab - GO） 、HRP标记的 抗PRP抗体（Ab - HRP） 和游离GO的试剂，对流感嗜血杆菌细胞壁成分聚核糖磷酸酯（polyribose phosphate，PRP）进行了检测（Ullman 等，1984）。该试剂与添加有抗GO抗体的临床样本相结合产生Ab-GO：PRP：Ab-HRP夹心复合物，并与胶体GO：抗GO抗体免疫复合物（沉淀素）相结合（图2-2-12）。葡萄糖、ABTS和过氧化氢酶的加入启动了酶连传反应；检测反应几乎是线性的，其检测限约为10fM PRP，足以用于细菌性脑膜炎的脑脊液检测。值得注意的是，尽管均相酶连传免疫测定法灵敏度高和检测方法简便，但在这些初步的研究之后就很少受到关注。

八、酶效应物免疫测定法

均相免疫测定法可以不使用完整的酶，而使用可以与酶或酶片段结合并影响酶活性变化的催化惰性标签，这种方法被称为 酶效应物免疫测定法（enzyme effector immunoassays） 。已被研究的标签包括酶底物、辅酶和抑制剂，以及酶片段。

（一）底物连接荧光免疫测定

底物标签已被用于监测血清中药物浓度相对较高的治疗药物水平。 β - 半乳糖苷酶伞形酮（β - galactosidylumbelliferone ）与 茶碱（theophylline） 的结合并不影响其作为β-半乳糖苷酶的荧光底物。当抗茶碱抗体存在时，反应受到抑制，因为底物与抗体结合时，其在空间上不易与酶接近；如果茶碱存在，它会竞争抗体结合位点，荧光伞形酮产物的出现速率会增加。

底物连接荧光免疫测定（substrate - linked fluorescence immunoassay） 方法的一个主要问题是必须使用低浓度的底物才能使分析物进入有效的竞争性结合。在低浓度时，酶的转化速度较慢；在非常高的酶浓度下可以显著提高其速率，但随后成本就变得难以承受。此外，该方法不具有其他酶免疫检测法所具有的信号放大的优点，即提供信号的分子数永远不能大于被分析物的分子数。

克服这些限制的一种方法是使用一种能够提供非常容易检测到信号的底物，如ATP可以用作底物。ATP-抗原偶联物与萤火虫荧光素酶反应产生一种当抗体存在时会被抑制的化学发光信号。该方法已被应用于HIgG和 2，4 - 二硝基苯丙氨酸（2，4 - dinitrophenylalanine） 的竞争性检测（Carrico等，1976）。虽然这克服了灵敏度的一些限制，但由于化学发光反应对基质效应的敏感性，样本与样本间的变异大大抵消了灵敏度方面的理论增益。

（二）酶辅因子免疫测定

辅因子或其他辅基是刺激酶活性的更有吸引力的标签，被应用于 酶辅因子免疫测定（enzyme cofactor immunoassay） 。与底物标签不同，这些基团提供了信号放大的机会。最成功的例子是使用FAD-分析物偶联物，它可以与无活性的 脱辅基葡糖氧化酶（apo - glucose oxidase） 形成复合物，产生有活性的GO；当这些偶联物与抗分析物抗体结合时，络合作用被空间抑制，酶不被激活。样本中分析物的竞争作用增加了可用的偶联物浓度，从而增加了酶的活性（图2-2-13）。Miles Laboratories公司将该方法商业化用于蛋白质分析物，如甲状腺结合球蛋白。试剂也被制备成干燥试剂条，用于一步测量血清中的药物；被称为ARIS™的脱辅酶再激活免疫检测系统，条带浸渍有干燥的FAD偶联物、抗体、脱辅酶、葡萄糖和检测过氧化氢的试剂，过氧化氢是酶反应的产物；当条带与样本接触时，如抗体与被分析物结合而不是偶联物结合，脱辅酶和FAD偶联物的组装会增强；形成的颜色的强度被用来确定 苯妥英（phenytoin） 和茶碱等药物的浓度。这是一种该类型检测的理想形式，因为它允许不稳定的脱辅酶以干燥的形式储存。

（三）酶抑制剂免疫测定法

酶抑制剂可像辅酶一样用作标签（图2-2-13）。 酶抑制剂免疫测定法（enzyme inhibitor immunoassay） 的关键是选择合适的酶抑制剂。 硫代乙氧基甲基膦酸酯（S - substituted ethoxy methylphosphonothioates） 是 乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase） 的不可逆抑制剂； 甲状腺素（thyroxine） 、茶碱等半抗原与硫结合不影响其抑制作用。然而，当偶联物与抗半抗原抗体结合后，酶抑制率降低；游离半抗原竞争抗体结合位点，增加有效抑制剂的浓度，造成相应的抑制加速和酶活性下降；反应之后是二硫硝基苯甲酸与乙酰硫胆碱酶解后形成的硫胆碱反应产生的颜色形成的速率（Blecka等，1983）。通过使用茶碱和甲氨蝶呤（一种酶的可逆抑制剂）的偶联物， 二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase） 也以类似的方式被用于茶碱的检测（Place等，1983）。

胆碱酯酶抑制检测主要由雅培（Abbott）公司销售并在其双色分析仪上进行，但该方法的适用范围和局限性目前尚不明确。很明显，足够的灵敏度需要抑制剂与酶的结合作用非常强，且最好是不可逆的，同时需要一种灵敏的酶活性检测手段。由于难以找到更好的抑制剂/酶组合，该方法的进一步研究可能受到阻碍。

（四）酶互补免疫测定

有些酶可以被分解成无酶活性的片段，只有当它们与原始全酶结合时才会变得有活性。来自于 核糖核酸酶A（ribonuclease A） 的无活性S蛋白与其20个氨基酸的N末端S肽互补，可使其酶活性恢复正常。甲状腺素与S肽的偶联可以在不阻断与较大的S蛋白片段互补作用的情况下实现；然而，重新组装的酶活性降低。抗甲状腺素抗体与重新组装酶的结合产生酶活性的恢复作用，这是均相免疫检测的基础（Gonnelli等，1981）。相反，当抗甲状腺素抗体添加到游离的S肽偶联物中时，互补作用被阻断，酶活性受到抑制。该方法同样可用于甲状腺素的均相检测（Farina 和Gohlke，1983）。前者是一种简单的EMIT类型的检测，其中抗体提供活性增强作用而不是抑制作用；后者是基于一个相关但不同的现象，概念上类似于酶辅因子免疫测定。在这两种情况下，游离甲状腺素对抗体的竞争导致酶活性的变化。

虽然核糖核酸酶没有被证明是有吸引力的，可能是因为没有高灵敏度的方法来检测核糖核酸酶的活性，但使用另一种酶——β-半乳糖苷酶的 酶互补免疫测定法（enzyme complementation immunoassay） 已经被商业化，商品名为 CEDIA ^® （cloned enzyme donor immunoassay，克隆酶供体免疫测定） 。这种天然酶有4个相同的亚基，但对于必须组装多少个亚基才能产生活性，目前还没有达成共识。然而，人们很早就认识到，两个共同组成一个亚基的多肽可以结合，具有几乎完全恢复的酶活性，这一过程被称为α-互补作用（Ullmann等，1967）。这些片段包括较小的“供体”肽和较大的“受体”蛋白；多个供体-受体对具有此属性；每一对的成员一起包含了天然酶的整个氨基酸序列。在CEDIA中，供体多肽通常来自N端，受体缺失了包括供体一部分的氨基酸；供体经过修饰后可以在特定位点与抗原偶联，并通过基因工程提供良好的酶活性恢复（Engel 和 Khanna，1992；Henderson等，1986）。

在CEDIA检测法中，首先分析物和供体偶联物竞争抗体结合位点，然后加入底物和过量的受体；分析物浓度越高，能够结合该偶联物的抗体就越少，产物的组装速率和最终催化生成速率也越快（图2-2-14）。CEDIA法已被应用于各种小分子以及一些蛋白质的检测。与EMIT检测一样，CEDIA法需要大量的筛选来确定不仅具有所需的特异性和亲和力，而且也能抑制互补作用的抗体。大分子抗原的供体偶联物很难设计，因为庞大的取代基会干扰互补作用，但对供体进行基因工程改造的能力提供了比EMIT更大的灵活性。由于β-半乳糖苷酶的高转化率和良好的检测能力，这些检测比EMIT提供了稍高一些的灵敏度，它们的主要缺点是需要重新构建相对不稳定的受体酶片段，而这些片段必须干燥保存，并且互补反应需要额外的时间。与EMIT一样，构建实用的非竞争性夹心免疫检测法的便捷方法尚未见报道。

基于β-半乳糖苷酶互补作用，目前Discoverx公司在出售对细胞内蛋白-蛋白结合进行定量的相关检测方法（Wehrman等，2005）。与CEDIA的不同之处在于，蛋白质的结合将两个酶片段结合在一起，并在酶活性出现的情况下启动互补作用。其中一个片段以融合蛋白形式表达，定位于特定的亚细胞区域，如细胞膜或细胞核；另一个片段融合到正在进行易位和结合的蛋白上。该方法的成功关键在于选择不影响易位和结合过程的酶片段。该方法通常用于通过测量药物诱导的 β - 抑制蛋白（β - arrestin） 与 G蛋白偶联受体（G - protein coupled receptors，GPCRs） 结合的高通量筛选。该技术在体外蛋白免疫检测法中的应用尚未展开研究。

九、邻位诱导杂交

许多细胞过程的一个特点是通过两个或两个以上反应物在细胞间隔内结合位点的定位来实现化学反应。定位导致反应组分的有效浓度增加，从而产生更高的反应速率，增强结合事件。 邻位诱导杂交（proximity - induced hybridization） ，如上述连传和电荷诱导酶免疫测定法一样，都是基于这一原理。免疫复合物通常占0.01仄升量级的球形体积。在这个体积中，单个自由扩散分子的有效浓度约为200mM。因此，附着在复合物不同成员上的寡核苷酸之间的速率和复合物内的平衡可以提高许多数量级。基于这一原则的两项应用已受到关注。

（一）邻位连接免疫测定

邻位连接测定法（proximity ligation assays，PLAs） ，又称 邻位连接免疫测定（proximity ligation immunoassay） ，使用两到三种“邻近探针”，每一种探针都能被整合到一个包含分析物的复合物中，每个探针都包含不同的寡核苷酸。PLA最简单的配置之一是使用两种标记的多克隆或单克隆抗体制剂的免疫检测（Gullberg等，2004）。第一步，将标记抗体的混合物与样本混合，然后形成包括两种寡核苷酸的免疫复合物。第二步，加入包括连接酶和连接模板寡核苷酸的试剂组合，该模板与免疫复合物中的两个邻近的寡核苷酸结合，从而使它们能够相互连接。免疫复合物外探针序列浓度较低，因而大大降低了非特异性连接的速度；PCR所需的所有元素也包括在组合试剂中。第三步，只需要通过热循环对连接探针进行PCR扩增，不需要对反应混合物进行额外处理。使用这种方法，在低至1µL的样本中可检测低fM浓度的IL2、IL4和VEGF（Gullberg等，2004）。

该方法的一个改良（称为3PLA），使用了3个邻近探针（Schallmeiner等，2007）。探针可以是任何结合物质，如抗体、适配体、寡核苷酸等。结合物质可以直接作用于同一分子上的不同位点，或者使用直接作用于复合物中不同分子的结合剂来检测分子复合物。在3PLA中，两个邻近探针用上述不同的寡核苷酸进行标记，第三个邻近探针用上述模板寡核苷酸进行标记。由于这三种寡核苷酸必须非常接近才能发生连接，因此该方法有望具有更高的特异性，并且应该能够耐受更高浓度的未结合抗体，而不会发生不适当的非特异性连接。此外，该方法还提供了一种提高灵敏度的方法，通过包括只有在靠近模板时才能被置换的互补寡核苷酸，来保护寡核苷酸不受非特异性连接的影响（图2-2-15）。该方法已被证明在1µL（约200aM）中可检测低至100个分子的VEGF、PSA和肌钙蛋白。虽然与其他非常高灵敏度的均相免疫测定法，如发光氧连传免疫测定（LOCI）相比，PLA更耗时，但它很可能成为研究单细胞水平或接近单细胞水平的分子相互作用的有力工具。

（二）邻位杂交免疫测定

在均相检测中，邻位诱导杂交的一个相关方法是使用FRET检测（Heyduk等，2008）。与PLA类似，在夹心免疫测定中使用了两种不同寡核苷酸标记的抗体制剂。在该方法中，寡核苷酸分别用一个FRET受体（如Cy5）和一个FRET供体（如荧光素或铕螯合物）标记。寡核苷酸具有短的（6-7bp）互补部分，这样设计的目的是使与游离抗体结合的探针杂交最小化，而不干扰免疫复合物内的杂交。该方法称为 邻位杂交免疫测定（proximity hybridization immunoassay） ，是一种很有吸引力的替代FRET免疫检测法的方法，FRET免疫检测法使用多种染料标记的抗体，其中一些抗体距离太远，无法实现有效的能量转移。复合物内寡核苷酸结合也有望通过稳定三分子夹心复合物而提高灵敏度。肌钙蛋白和CRP的模型检测法已经进行了研究，得到的肌钙蛋白检测限约为30pM。

十、同位素标签

闪烁亲近测定

同位素标签（isotopic labels） 的一个优点是可以构建与自由配体在化学上完全相同的标记配体。这对于配体的化学标记可能干扰与天然受体结合的检测具有特别的价值。然而，这种优势必须与放射性同位素的生物危害、稳定性和处理问题，以及标准放射结合检测法的分离和清洗步骤的不便进行权衡。

闪烁亲近测定法（scintillation proximity assay） （SPAs）是一种避免分离和清洗的放射性同位素检测法。SPA需要一种可以发射出只在浓缩介质中短距离传播的α或弱β粒子的放射标签。受体或抗体与荧光基团溶解的聚合物表面（如胶乳珠）结合。如果放射标记与表面结合，标记的辐射就会穿过聚合物并产生光脉冲，这些光脉冲可以通过闪烁计数检测到。大多数未结合的标记距离太远，辐射无法到达活动表面（图2-2-16）。除了荧光胶乳珠，荧光孔也可以被使用，抗体或受体可与孔表面结合。无论哪种形式，只需要将标记的抗原和样品与包被了抗体的表面一起孵育，然后测量光发射（Hart和Greenwald，1979）。

Perkin Elmer公司销售SPA试剂可用于高通量药物筛选。在这一应用中，除了使用抗体外，还使用天然受体，可以进行竞争性和夹心法免疫检测。抗体、抗原或受体可携带放射性标记。

SPA的一个重要的考虑因素是标签的选择。每一分解事件产生的光最多的是α粒子，它们有很高的能量和很短的电离轨道，电子密度很高。此外，短路径长度提供了结合和非结合标签之间的最佳区分。然而，与α发射相关的高能量使它们在被摄入时特别危险，不能作为常规标签使用。弱β粒子也有较短的路径长度，但每次衰变事件产生的发射较弱。β衰变同位素如 ³ H、 ³³ P、 ³⁵ S和 ¹²⁵ I，每一种都发出能量低于300keV的β粒子，是最实用的（Udenfriend等，1987）。

十一、电活性标签

使用 电活性标签（electroactive labels） 的均相免疫检测有以下几种：

（一）安培检测

二茂铁（ferrocene） 在不影响大多数血清成分的电压下易于被氧化（340mV与饱和甘汞电极（SCE））。由于电子转移到电极上需要非常近的距离，所以电流随着二茂铁体积的增大而减小；利用该原理设计了均相电化学免疫检测法，称为 安培检测（amperometric detection） 。二茂铁与甲状腺素等半抗原偶联，偶联物的电解氧化是在一种电化学惰性试剂的存在下进行的，这种惰性试剂旨在快速地将二茂铁离子还原回中性标签。葡萄糖和GO可用于此目的。当甲状腺素抗体存在时，由于偶联物与电极的可及性降低，电流降低（图2-2-17）。游离甲状腺素与抗体竞争，导致电流增加（Robinson等，1986）。

（二）电化学发光

电化学发光（electrochemiluminescence，ECL） 的测量使高灵敏度的免疫检测法的发展成为可能。该方法最初是通过使用一个在电极上可以被氧化的芘标签，然后通过循环伏安法快速还原来得以证明；在适当的电压下，后一过程充分放热，使芘最终处于激发态，随后发射光子。与安培检测一样，当标签与体积较大的复合物相关联时，这个过程会受到阻碍。因此，抗白蛋白抗体的结合减少了芘标记的白蛋白的发射，而游离白蛋白的竞争性结合导致信号的恢复（Ikariyama等，1985）。

使用强荧光钌（Ⅱ）螯合物代替芘可大幅提高灵敏度（Blackburn 等，1991）。与芘一样，钌在电极上被氧化，但在反应混合物中加入三丙胺后，在不改变电极极性的情况下被还原。胺的电化学氧化与钌氧化同时发生，生成的自由基阳离子经过去质子化形成胺自由基；这种物质本身就是一种强还原剂，能把一个电子转移回钌。该过程充分放热，使钌处于电子激发态，随后发射光子（图2-2-18）。

免疫检测法是通过使钌标签与悬浮珠子上的抗体结合来进行的。根据检测法是竞争性的还是夹心（免疫测定法）免疫检测，确定标记分析物类似物还是第二抗体。这些珠子可以减少钌对电极的可及性。在竞争性检测中，标记的抗原被抑制与珠子结合，因此信号随抗原浓度的增加而增加；在夹心法检测中，标记的抗体会随着抗原浓度的增加而与珠子结合，导致信号下降。

一些用于逆转珠子保护作用的方法也被研究，以便当标签结合到珠子上时信号会增加。这是通过使用磁珠来实现的，磁珠被集中在电极，在读取之前进行清洗。该非均相方案提供了更高的灵敏度，且该方法被扩展到非常低浓度的分析物，如血清TSH。这种类型的ECL检测已被设计用于许多临床上重要的分析物，并被用于罗氏（Roche）公司的Elecsys ^® 免疫检测系统。

十二、氧通道免疫检测法

发光氧通道免疫检测

为了在均相免疫检测中获得超高灵敏度而不需要耗时的扩增步骤，必须确定标签不仅可以在非常低的浓度下检测到，而且能够产生可以调节的信号。除了只提供中等灵敏度的同位素标签外，所有可调节的标签都在一定程度上受到样本基质的影响。高量子产率的荧光化合物具有高消光系数，光散射金属纳米颗粒与单分子检测技术具有良好的灵敏度，但微弱的信号可以被来自大量样品的本底发射所掩盖。化学发光检测对单分子检测的灵敏度本来就低得多，因为每个分子最多只能产生一个光子。但是，化学发光本底在大多数类型的样本中是不可测量的，因此化学发光标签是测量非常低浓度的最佳选择，这有别于非常低的绝对数量。不幸的是，化学发光反应对介质效应的高度敏感性阻碍了许多设计实用的均相化学发光免疫检测法的尝试。

发光氧通道免疫检测法（luminescent oxygen channeling immunoassay，LOCI） 是目前唯一一种能够充分利用化学发光精细灵敏度优势的均相免疫检测法（Ullman等，1996年）。该方法是通过在胶乳珠内部诱导化学发光反应来实现的，此时它是完全从样本基质中分离出来的。该方法使用两种类型的配体或受体包被的胶乳珠，它们足够小（约250nm）且不会从水悬浮液中沉淀出来。其中一种珠子是化学发光剂珠子，其中溶解的烯烃能与单线态氧（ ¹ Δ _g O ₂ ）迅速反应，产生一个电子激发产物；该反应生成一种能在约1s内自发分解的二氧杂环丁烷，并能有效发光；另一种珠子含有一种溶解的感光剂，如 酞菁（phthalocyanine） ，它能使氧分子在光照下处于单线态；感光剂也被从与样品的接触中物理分离，从而与非特异性的介质效应绝缘。

LOCI检测与酶连传免疫检测法类似（图2-2-19）。感光剂珠子被波长足够长的光激发，化学发光剂很少被激发。珠内形成的单线态氧扩散到水溶液中；因为它在水中只有4µs的寿命，因此它只存在于每一个最邻近的感光剂珠子上，约300nm以外珠子表面几乎检测不到。当化学发光剂珠子与感光剂珠子结合时，暴露在单线态氧中，单线态氧扩散到珠子中，引发化学发光反应；未结合的珠子由于太偏远而不会受到影响。虽然每个结合事件产生的光子数变化小于FRET免疫检测法，但该方法每个结合事件产生的光子数比标准的化学发光检测法多10 ⁴ 个以上，后者每个结合事件产生的光子数少于一个。

任何一种特定的检测模式所需的结合试剂都可以结合到珠子表面，前提是反应导致两种类型珠子之间依赖分析物的结合。结合反应后，用680nm激光照射珠子悬浮液，持续多个0.1～1s的周期，在550～650nm处产生较短波长的化学发光发射，在相同的时间周期内被积分；只需要一个装有激光和机械快门的光度计即可。由于信号强度很少受到限制，因而在结合平衡建立之前就可以进行测量。因此，信号是在特定时期内形成的珠子对数量的度量。

该方法的检测灵敏度至少等于且常常优于最敏感的非均相免疫检测法。在一种TSH夹心免疫检测中，在每一个珠子上使用不同的抗TSH抗体，低至120 000个分子（在最终900µL检测溶液中230aM，或50µL血清样本中4.1fM）能被检测到，总孵育时间为14min。适用于pM浓度水平的药物（如地高辛）的竞争性检测可以在1min内完成。

夹心免疫检测的方案已经被开发出来，它可以减少孵育时间并限制化学发光烯烃的长波长激发所产生的非常微弱的本底化学发光。在一个典型的夹心检测中，首先将样本与包被有抗体的化学发光剂珠子和针对不同抗原表位的过量生物素化抗体混合孵育；将珠子的浓度保持在低水平以减少本底，但由于每个珠子有1 000个或更多的抗体结合位点，因此可以获得中等浓度的抗体。这使得夹心结构的有效形成不依赖于缓慢的珠子间结合。在较短的孵育期后，添加包被有链霉抗生物素蛋白的珠子，并与结合于化学发光剂珠子的生物素的数量成比例；大量过量的感光剂珠子可以用来加速珠子间的结合，因为其对本底没有贡献。在第二个较短的孵育期后测量化学发光发射。利用这些条件，可得到分析物浓度超过5个数量级的检测范围。该方法在药物、蛋白质、抗体、细胞表面抗原、受体和核酸的检测中都已被证实。

样本基质对LOCI信号的影响不大。单线态氧在珠子之间的传输过程中，原则上可以被样本组分截留，但单线态氧的寿命太短，只能被反应性强、浓度高的化合物所捕获。蛋白质是血清中单线态氧的主要淬灭剂（Wagner等，1993）。这对样本间变异的影响很小，通常使用终浓度不超过10%的血清或血浆来避免这一问题；对于尿液，一个更严重的问题是大剂量维生素C治疗后尿液中抗坏血酸盐浓度高，需要相对较高的最终稀释步骤（尿液＜1%）或加入氧化剂来解决。该方法已在西门子（Siemens）公司的Dimension Vista ^® 分析仪和珀金埃尔默（Perkin Elmer）公司的用于药物发现的高通量AlphaScreen ^® 和Aphalisa ^® 上商业化使用。

十三、小结

尽管与一些非均相检测法相比，均相检测法的灵敏度有限，但由于其自动化的要求较低，且有机会使用常见的实验室仪器手动进行检测，因此较老的均相免疫检测法（如EMIT、CEDIA、FRET和胶乳凝集法）已得到广泛应用。在过去的十年中，人们开发出了新的方法来实现更高的灵敏度和降低对基质效应的敏感性。最近发展的ECL、磁聚集、LOCI和PLA免疫检测法在不同程度上保留了早期方法的简单性。这些方法受样本基质的影响很小，并且可以在非常小的样本体积下进行。近年来，针对LOCI的通用均相免疫检测试剂的商业化应用，可能会加速传统的非均相免疫检测法（如RIA和ELISA）在商业化应用和基础研究中的替代。

均相方法的一个重要的、与非均相方法相比不甚理想的特性就是其有限的多路复用能力。考虑到人们对开发新均相方法的浓厚兴趣，这一限制很可能很快就会被克服。多路复用的一种有效方法是基于测量荧光配体与包被不同捕获抗原或抗体的珠子的结合；每个捕获配体都由与其珠子相关联的独特荧光标记编码；荧光标记与特定配体的结合可以通过流式细胞术来确定（Lima和Zhang，2007）。可以说，这是一种均相的方法，尽管经常使用分离步骤，而且仪器很复杂。通过用均相波动分析代替流式细胞术，单个编码的珠子原则上可以用一种简单得多的方法在本体悬浮液中进行分析。此外，量子点和金属纳米颗粒作为标识码的使用，为提高灵敏度提供了机会；进一步利用光散射和扩散速率作为附加编码参数，我们可以有理由地预计，未来高灵敏度的均相方法的发展可以与大规模非均相方法的多路复用水平相媲美。

十四、参考文献

（关秀茹、刘彦虹　译，何建文　审） zjikUJkdOEjJqSOR5X/PwDet0UqhJGzqHzckVxo+fxTrXyoHDOco+pCire2Zow23