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【摘要】 《全球结核病报告2019》疫苗研究进展部分报告了我国自主研发的两种结核病疫苗正处于临床试验阶段，其中治疗性疫苗微卡正处于Ⅲ期阶段，另一种亚单位疫苗AEC/BC-C02也正在开展Ⅰ期临床试验。此外，我国学者在多种新疫苗的研发方面取得一定进展，M72/AS01E疫苗是安全、有效的；AEC/Al/poly-IC及V569 DNA疫苗可能成为抗潜伏结核感染的候选疫苗；rBCG-DisA能诱导更强的免疫应答，但其保护力未优于BCG；c-di-GMP作为一种免疫调节剂，具备一定的疫苗研发潜力；rv3407 DNA疫苗具备一定的成为结核病候选治疗型疫苗的潜力；体外合成了稳定的Ag85B-mRNA疫苗，具有较好的免疫原性，为新型结核疫苗的研制提供了新思路。同时发现了一些新型抗原具有疫苗研发的潜力，Rv0674具备一定的候选结核病新疫苗开发的潜力。结核分枝杆菌Dnak和MPT83蛋白均具有较好的抗原性，并且刺激T细胞产生免疫应答的能力较强，两者联合可能对于结核病新型抗结核疫苗研究有较好的应用价值。
【关键词】 新型亚单位疫苗；重组BCG；核酸疫苗；新抗原
2019年，我国科学家在结核病疫苗领域取得了一定进展，尤其是在亚单位疫苗、DNA疫苗等的临床前研究，新型疫苗抗原的发现等方面均做出了一定的贡献。
Ji等 ［1］ 对正处于临床试验阶段的亚单位疫苗M72/AS01 E 进行了一项荟萃分析。共纳入了7项临床试验相关研究，涉及4 590例受试者。分析结果发现M72/AS01 E 疫苗有效性为57.0%，与对照组相比，疫苗免疫组M72抗原特异性多功能CD4 + T细胞显著增多，第2次接种后30天，血清反应阳性率达到峰值，研究结束时（210天），抗M72 IgG浓度持续升高。与对照组相比，疫苗接种受试者注射部位局部发红（相对风险，RR=5.99）、局部肿胀（RR=3.17）、不适（RR=3.01）、疲劳（RR=3.17）的风险有所增加，然而头痛、肌痛和疼痛风险没有增加。该研究结论认为M72/AS01 E 疫苗是安全、有效的，虽然有轻微的不良反应发生，但是并不影响其对健康成人结核病的预防效果。
Wang等 ［2］ 对亚单位疫苗AEC/Al/poly-IC在两种动物模型中进行了免疫原性和保护力的评估。该疫苗融合了结核分枝杆菌Ag85b、EAST-6、CFP-10三种抗原蛋白，并以铝及多核糖核苷-多聚胞苷酸（poly-IC）为佐剂。在BALB/c小鼠模型中，通过抗原特异性IgG检测显示疫苗在小鼠体内产生了较好的免疫原性。随后研究者利用豚鼠建立了潜伏感染模型，通过ELISPOT及多色流式细胞术分析等实验，AEC/Al/poly-IC接种后小鼠表现出了显著的抗原特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，并且在潜伏的MTB感染的豚鼠模型中证实了该疫苗较好的保护作用。AEC/Al/poly-IC免疫后的豚鼠肺、脾等脏器病理评分和细菌载量均显著低于对照组。这些数据表明AEC/Al/poly-IC在小鼠中具有高度免疫原性，可有效保护豚鼠免受潜伏的MTB感染；它可能代表了一种用于控制潜伏性结核病的有希望的候选疫苗。
李武等 ［3］ 构建了重组腺病毒载体Ad5-CEAB，并通过动物实验研究了其诱导动物产生抗原特异性免疫应答的能力。结果发现，与PBS对照组相比，BCG组和BCG初免联合Ad5-CEAB加强组表现出明显的促进T细胞增殖的效应，BCG/Ad5-2组、BCG/Ad5-1组和 BCG 组刺激指数（stimulate index，SI）均显著高于 PBS组，Ad5-CEAB 加强 2次的效果好于加强1次，但Ad5-CEAB加强1次也能取得显著的促进T细胞增殖的效果；Ad5-CEAB加强组IFN-γ分泌细胞的数量显著高于对照组；ELISA结果表明，淋巴细胞培养上清液中的白细胞介素-2和TNF-α的含量均显著高于BCG组，且BCG/Ad5-2组和BCG/Ad5-1组间细胞因子的表达无显著差异；流式细胞分析结果表明，Ad5-CEAB组中CD4 + 和CD8 + T细胞比值显著高于对照组，BCG/Ad5-2组和BCG/Ad5-1组间无显著差异。研究证明，BCG初免联合1次重组腺病毒加强免疫可以诱导小鼠产生较强的抗原特异性T细胞免疫应答。该疫苗初免加强的免疫策略及基于黏膜免疫的免疫途径有待更进一步的动物实验数据支持。
环二鸟苷酸（c-di-AMP）是一种参与调节多种细胞过程和宿主免疫应答的细菌二级信使，可参与细菌的致病性和参与诱导宿主Ⅰ型IFN-γ应答。Ning等 ［4］ 构建了重组BCG疫苗rBCG-DisA，可过表达MTB c-di-GMP合成酶DisA。建立了小鼠感染模型，研究了rBCGDisA的体液免疫和细胞免疫特性。结果发现，DisA在BCG中的过表达并不影响细菌生长，但使BCG的长度变短。rBCG-DisA可诱导与BCG相当的体液免疫和细胞免疫应答。MTB攻毒实验发现，rBCG-DisA和BCG免疫小鼠的脾淋巴细胞产生的IFN-γ、IL-2和IL-10均高于未免疫小鼠，且rBCG-DisA组细胞因子水平明显高于BCG组。巨噬细胞经c-di-GMP处理或细菌感染后，IFN-β、IL-1β和自噬相关基因（ atgs ）的转录上调。rBCG-DisA免疫小鼠攻毒后IL-6较其他免疫组显著上调。rBCG-DisA组与BCG组均发现了固有免疫表观遗传标记H3K4me3的表达，且rBCG-DisA组表达水平高于BCG组。两种疫苗免疫的小鼠攻毒后病理学变化无明显差异，小鼠肺和脾脏细菌负荷均显著降低，但两组无显著差异。综上，与BCG相比，rBCG-DisA能诱导更强的免疫应答，但其保护力未优于BCG。c-di-GMP作为一种免疫调节剂，具备一定的疫苗研发潜力，尤其在未来改良BCG疫苗的开发过程中有待深入研究。
Liang等 ［5］ 利用MTB潜伏相关抗原Rv3407构建了DNA疫苗，并对其免疫原性和治疗效果进行了评价。分5组免疫小鼠：①无菌水；②pVAX1空载；③ M.vaccae ；④ ag85a DNA；⑤ rv3407 DNA。每组肌注3次，间隔2周。结果显示，免疫 ag85a DNA和 rv3407 DNA组脾淋巴细胞培养液上清IFN-γ表达水平升高，Th1细胞增多，全血Th1/Th2免疫细胞比例升高，且以Th1型免疫应答为主。与其他组相比， ag85a 和 rv3407 DNA组的Ag85A或Rv3407 IgG特异性抗体水平显著升高。之后建立了小鼠感染模型，事先感染MTB的小鼠分两组，即 rv3407 DNA-PBS组和PBS组。结果提示， rv3407 DNA组肺部细菌载量显著低于PBS组。综上， rv3407 DNA疫苗可诱导抗原特异的细胞免疫及体液免疫应答，具备一定的成为结核病候选治疗型疫苗的潜力。
为研究针对结核分枝杆菌潜伏感染的DNA疫苗，粟海波等 ［6］ 基于质粒A39构建了p-VAX1-Ag85B-Rv3425-Rv2029c-PPE26（V569）质粒，并对其免疫原性及保护性进行初步研究。建立C57BL/6小鼠免疫模型，共分6组即PBS、p-VAX1-Ag85B（A）、p-VAX1-Ag85BRv3425（A3）、A39、V569和BCG，进行疫苗的免疫性评价。结果显示，与BCG组相比，V569能引发实验小鼠强烈的细胞免疫反应（IFN-γ高水平分泌），外周血CD4 + /CD8 + T细胞比例明显增加。构建斑马鱼-海分枝杆菌潜伏感染模型，将PBS、A、A3、A39、BCG、V569分别通过腹腔注射免疫斑马鱼后，每日注射地塞米松10µg诱导海分枝杆菌复发感染，对斑马鱼肝脏进行菌落计数并绘制生存曲线。与BCG免疫组相比，V569免疫斑马鱼后可显著减少其肝脏中海分枝杆菌数量，斑马鱼存活情况得到显著改善，表明V569 DNA疫苗可能是一种抗潜伏结核感染的候选DNA疫苗。
刘晶等 ［7］ 表达构建了基于ESAT-6-Ag85A（ES85A）融合基因的侵入型乳酸菌对小鼠体内免疫特性的影响。将真核表达载体pValac与ES85A连接构建真核表达质粒，并将其分别电转到重组乳酸菌NC8-pSIP-409和NC8-pSIP-409-FnBPA感受态中，构建重组侵入型乳酸菌pValac-ES85A/409和pValac-ES85A/FnBPA。将其免疫BALB/c小鼠，检测表达ES85A的侵入型乳酸菌对小鼠树突状细胞（dendritic cells，DCs）亚群CD80和CD83的影响以及血清中细胞因子的表达水平。表达ES85A的侵入型乳酸菌能促进小鼠体内DCs的分化和成熟以及提高血清中细胞因子IL-4的表达，为后期研发结核病DNA疫苗制剂奠定了基础。
夏敏等 ［8］ 通过体外转录MTB Ag85B-mRNA并评价了其免疫原性。结合密码子偏好性等特性，优化了Ag85B编码区序列，并在其两端插入β球蛋白3'和5'UTR序列。进行体外转录后，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，体外转染细胞验证其表达后，联合鱼精蛋白免疫Balb/c小鼠，检测抗原特异性细胞免疫应答。结果显示，Ag85B序列优化后，具有更高的稳定性，且成功体外合成了稳定的Ag85B-mRNA。Western blot检测Ag85B-mRNA转染293T细胞24、48 小时，均有清晰特异性的目的蛋白条带。小鼠免疫试验结果显示，Ag85B-mRNA可诱导针对Ag85B分泌高水平IFN-γ的Th1型免疫应答。该研究成功体外合成了稳定的Ag85B-mRNA疫苗，具有较好的免疫原性，为新型结核疫苗的研制提供了新思路。
Xiao等 ［9］ 对MTB Rv0674蛋白的免疫原性进行分析。研究结果发现，结核病患者中Rv0674特异性IgG抗体水平显著高于对照组。当Rv0674联合佐剂DDA/Poly I：C免疫BALB/c小鼠时，可诱导较高水平的IFN-γ、IL-2和IL-6。当使用高、低剂量疫苗免疫小鼠时均可诱导高滴度的抗原特异性IgG，提示Rv0674在体液和细胞免疫中均可能发挥重要作用。Rv0674可诱导Th1/Th2混合型保护性免疫，但以Th1细胞因子为主。综上，Rv0674具备一定的候选结核病新疫苗开发的潜力。
李晓琴等 ［10］ 重组表达了 MTB 蛋白 Dnak（Rv0350）和 MPT83（Rv2873），并对其进行了抗原性评价。收集人群包括结核病患者（135例）、其他肺部疾病患者（56例）和健康志愿者（94例）的血液样本，进行了抗原特异性体液免疫及细胞免疫分析。结核分枝杆菌Dnak和MPT83蛋白均具有较好的抗原性，并且刺激T细胞产生免疫应答的能力较强，两者联合可能对于结核病新型抗结核疫苗研究有较好的应用价值。
王培东等 ［11］ 对MTB Rv2450c进行T细胞表位预测分析。运用不同的生物信息学软件对其进行了理化性质、疏水性、T细胞表位分布等分析，筛选到了5个CD4 + T细胞优势表位，2个CD8 + T细胞表位，最终筛选出T细胞表位预测序列为：SQGIRAWP159-166，其免疫原性及疫苗开发潜力仍有待实验证实。
周玉真等 ［12］ 评价了MTB Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c的细胞表位融合蛋白（命名为msv）的免疫原性，通过异源表达、分离纯化及Western blot鉴定后，用纯化的msv免疫小鼠。ELISA实验检测小鼠的特异性抗体滴度，结果表明特异性抗体效价约为1：81 920；分离小鼠的脾淋巴细胞，采用淋巴细胞增殖法检测其免疫原性，发现抗原致敏的淋巴细胞经融合蛋白msv刺激后明显增殖。因此，该融合抗原可诱导小鼠特异性抗体表达并刺激细胞免疫应答，为研制新型多阶段结核病疫苗提供了可靠的候选抗原。
雨昕等 ［13］ 应用生物学软件预测结核分枝杆菌PPE32基因编码蛋白的结构和功能。该研究应用了Expasy、TMHMM Server v.2.0等多种生物信息学软件，分析PPE32蛋白由409个氨基酸组成，等电点为4.35，为亲水性蛋白，无跨膜区及信号肽，有31个磷酸化位点，1个保守域，蛋白二级结构以α-螺旋为主，有38个B细胞抗原表位和12个T细胞抗原表位。该蛋白的免疫原性及保护力有待更多的实验数据支持。
随着新技术的发展，新型结核疫苗抗原的发现手段逐渐优化，发现了一批候选抗原用于后续疫苗的研发，DNA疫苗的临床研究正在逐步开展，我国新型结核病疫苗的研发进度也在逐步加快，且逐步与世界接轨。
（王伟 于佳佳 黄威 卢水华 唐神结）
［1］JI Z，JIAN M，CHEN T，et al.Immunogenicity and Safety of the M72/AS01E Candidate Vaccine Against Tuberculosis:A Meta-Analysis［J］.Front Immunol，2019，10:2089.
［2］WANG C，LU J，DU W，et al.Ag85b/ESAT6-CFP10 adjuvanted with aluminum/poly-IC effectively protects guinea pigs from latent mycobacterium tuberculosis infection［J］.Vaccine，2019，37（32）:4477-4484.
［3］李武，邓光存，刘晓明，等.单次重组腺病毒加强BCG初免小鼠后诱导的特异性T细胞免疫应答［J］.农业生物技术学报，2019，27（3）:488-494.
［4］NING H，WANG L，ZHOU J，et al.Recombinant BCG With Bacterial Signaling Molecule Cyclic di-AMP as Endogenous Adjuvant Induces Elevated Immune Responses After Mycobacterium tuberculosis Infection［J］.Front Immunol，2019，10:1519.
［5］LIANG Y，ZHAO Y，BAI X，et al.Immunotherapeutic effects of Mycobacterium tuberculosis rv3407 DNA vaccine in mice［J］.Autoimmunity，2018，51（8）:417-422.
［6］粟海波，刘梓健，周洋洋，等.针对结核分枝杆菌潜伏感染的DNA疫苗V569免疫原性及保护性的初步研究［J］.微生物与感染，2019，14（5）:289-296.
［7］刘晶，张赞，刘洋，等 .表达结核分枝杆菌 ESAT-6-Ag85A 基因的侵入型乳酸菌免疫特性研究［J］.中国免疫学杂志，2019，35（1）:10-14.
［8］夏敏，杨晓岚，杨鹏辉，等 .结核分枝杆菌 Ag85B-mRNA 疫苗的体外合成及其免疫原性研究［J］.免疫学杂志，2019，35（5）:404-408.
［9］XIAO T Y，LIU H.C，LI X.Q，et al.Immunological Evaluation of a Novel Mycobacterium tuberculosis Antigen Rv0674［J］.Biomed Environ Sci，2019，32（6）:427-437.
［10］李晓琴，肖彤洋，李马超，等 .结核分枝杆菌 Dnak 和 MPT83 蛋白的抗原性评价［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2019，39（2）:106-113.
［11］王培东，何俊才，周放，等 .分枝杆菌 Rv2450c T 细胞表位预测及分析［J］.武汉轻工大学学报，2019，38（1）:33-36.
［12］周玉真，刘思静，唐明圆，等 .结核分枝杆菌基因 Rv2660c、Rv2460c、Rv3875、Rv3804c 细胞表位融合蛋白的表达及其免疫原性评价［J］.四川大学学报（医学版），2019，50（4）:506-511.
［13］雨昕，付玉荣，伊正君 .结核分枝杆菌 PPE32 蛋白的生物信息学分析［J］.中国病原生物学杂志，2019，14（2）:131-136.