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【摘要】 结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病，经过长时期的进化，结核分枝杆菌已分化成为多种不同的基因型，全球不同地区流行的主要结核分枝杆菌基因型亦存在差异。随着分子生物学技术的不断发展，国内外对结核分枝杆菌基因水平的认识也逐步加深，对结核病的分子流行病学特点的研究日益丰富。结核病分子流行病学的研究能够初步判断结核病传播相关危险因素、预测可能的暴发流行、追踪传染源，以及区分结核病患者为内源性复发和外源性再感染等。我国广泛流行的是北京基因型结核分枝杆菌，国内对结核病分子流行学的研究也主要围绕对北京基因型结核分枝杆菌耐药性的统计分析，国内基于监狱人群和HIV/MTB双重感染的特殊结核病人群的分子流行病学研究丰富了人们对结核病传播的认识，为制定针对性的防控策略提供重要依据。
【关键词】 结核分枝杆菌；北京基因型；耐药
分子流行病学是阐明疾病和健康状态相关的生物标志或分子事件在人群和生物群体中分布及其影响因素，并研究防治疾病、促进健康的策略与措施的科学。在结核病领域，分子流行病学主要用于结核病传播范围的确定、传播途径的判断与传染源追溯、区别内源性复发、外源性再感染、近期传播及耐药菌的传播流行等。本文对2019年国内结核病分子流行病学主要的研究进展进行总结。
彭英等 ［1］ 用RDl05缺失基因检测和7个位点可变数目串联重复序列（mycobacterial interspersed repetitive units-variable number of tandem repeats，MIRU-VNTR）对黑龙江省五常市121株结核分枝杆菌菌株（ Mycobacterium tuberculosis ，MTB）进行分子分型，计算其耐药率、Hunter-Gaston指数（Hunter-Gaston index，HGI）、成簇率，分析MTB 的DNA 多态性及北京基因型菌株与耐药的相关性。结果表明，在 121株结核分枝杆菌菌株中，通过RDl05缺失基因检测，其结果显示有101株为北京基因型菌株，占83.5%（101/121）；其余20株为非北京基因型菌株，占16.5%（20/121）。使用7位点VNTR分型技术检测，结果显示121株菌株可分为17个基因簇和64个独立的基因型；每个簇包括2～14株临床分离株，最大的簇由14株结核分枝杆菌菌株构成，所占比较高为11.6%（14/121）；121株结核分枝杆菌菌株中成簇菌株57株，成簇率为47.1%（57/121）。北京基因型为黑龙江省五常市主要流行菌株，且该地区的MTB呈明显的基因多态性，但是北京基因型与非北京基因型间的耐药率在此地区并无差异。
申旭波等 ［2］ 比较了黔北地区城乡肺结核患者流行病学特征及MTB基因型特征的差异，利用12位点MIRU-VNTR对MTB进行基因分型，结果显示农村患者131株菌株共分为106个独立基因型，9个基因簇，有25株成簇菌株，成簇率为19.08%（25/311）；城镇患者65株菌株共分为60个独立基因型，2个基因簇，有5株成簇菌株，成簇率为7.69%（5/65），两组患者菌株成簇率差异有统计学意义（χ 2 =4.349， P =0.037）。结果提示，农村肺结核患者的近期传播率高于城镇。农村患者流行病学总关联率为48%，但其中仅有2人为同一家庭，据此推测该地农村结核病的近期传播主要由家庭外接触传播。
Cui等 ［3］ 比较了广西壮族自治区内两个不同的区域内（高通报率地区与低通报率地区）家庭层面内MTB基因型的分布传播。北京基因型MTB在高通报率地区传播的比例为64.6%，在低通报率地区为50.7%（ P =0.02）。在调整其他风险因素（aOR=1.83）后，与非北京基因型相比，北京基因型增加了家庭结核病的传播风险。研究发现，北京基因型在家庭传播中起着重要的作用，并证实了北京基因型家族菌株的强传播性，石洁等 ［4］ 对河南地区668株结核分枝杆菌进行间隔寡核苷酸分型（Spoligotyping）和26位点MIRU-VNTR分型分析，并评估不同 MIRU-VNTR 位点组合的分辨效能。结果显示，北京基因型菌株共558（83.53%）株，是河南省最流行的MTB，其中典型北京家族基因型（SIT1）是最具优势的基因型（512株，88.89%）。26位点 MIRU-VNTR 可将668株菌分成567种基因型，其中含有38 个基因簇（139株）和 529 种独立的基因型。最小生成树结果表明北京基因型和非北京型菌株分别构成了2个大基因簇，最大的簇含有546 株典型北京基因型，而非典型北京基因型菌株组成的小簇围绕在该簇周围。第二大基因簇主要含有T1和MANU2 家族和其他非北京基因型，而8个未知基因型位于该簇周围，提示未知基因型菌株在进化亲缘关系上可能与非北京基因型家族更接近。但Spoligotyping和MIRU-VNTR北京型菌株的分型结果存在略微偏差，对于北京基因型家族而言，26位点的成簇率（16.12%）明显低于 Spoligotyping（98.74%），而 26 位点的 HGDI（0.998）明显高于 Spoligotyping（0.042）。VNTR的成簇率在北京基因型和非北京基因型之间存在差异（16.13% vs. 2.7%），表明在河南地区北京基因型MTB可能具有更强的传染能力。Spoligotyping和26位点组合后，可将所有 668 株菌分成 576 个基因型，但两者组合的成簇率低于26位点的成簇率。为进一步评估MIRU-VNTR 不同位点组合的分辨能力，研究比较了26位点与标准24位点、15位点和12位点之间以及结合Spoligotyping后的分辨性能。26位点、标准24位点和15位点与原始12位点组合相比，尤其与Spoligotyping组合后，对所有菌株的分辨效能显著提高。通过逐个增加VNTR位点评价累计HGDI值，最终鉴定出10个辨别能力最强的位点，分别为Qub11b、mtub21、miru26、qub26、mtub04、miru10、ETRF、ETRE、miru39 和 ETRA，其累计 HGDI达到0.996，与26位点的HGDI相近，进一步增加其他位点没有明显改善累计HGDI 值。所以，此套精简的10位点 MIRU-VNTR组合可用于河南省大部分MTB的分型。
王少华等 ［5］ 收集2013—2017年河南省中牟县临床分离培养的352株MTB，352株临床分离MTB经Spoligotyping分型分为31个基因型，北京家族占85.8%（302/352）；其次为T 家族（包括 T1、T2、T3），占 10.2%（36/352）；12 种基因型为无对应型别，占 4.0%（14/352）。2013—2017 年北京基因型家族的比率分别为 89.3%（50/56）、85.0%（68/80）、84.2%（80/95）、88.1%（59/67）、83.3%（45/54），各年间北京基因型比例差异无统计学意义（χ 2 =1.348， P =0.853）；2013—2017 年 T 家族的比率分别为 8.9%（5/56）、12.5%（10/80）、14.7%（14/95）、6.0%（59/67）、5.6%（3/54），各年间 T 家族比例差异无统计学意义（χ 2 =4.311， P =0.366）；2013—2017年无对应家族的比率分别为 1.8%（1/56）、2.5%（2/80）、1.1%（1/95）、6.0%（4/67）、11.1%（6/54），各年间无对应家族比例差异有统计学意义（χ 2 =11.182， P =0.025）。中牟县结核分枝杆菌临床分离株中北京基因型MTB为主要流行株，但是近两年无对应基因型别逐渐增多，提示结核病疫情存在新的变化。
Bai等 ［6］ 分析云南部分地区的 MTB 基因型与耐多药 -结核病（multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB）的关系。北京基因型是云南省的优势基因型并且是MDR中主要的基因型。利用Spoligotyping分型技术，对270株临床分离株进行了基因分型分析，发现68种不同类型的分离株具有很高的遗传多样性。其中北京基因型199株（73.70%），非北京型71株（26.30%）。在非北京基因型中，共检出6种基因型：H3（0.37%），U（0.74%），Manu2（3.70%），T1（6.30%），T2（0.74%），T3（0.37%），以及孤立基因型 38 个（14.07%）。耐多药耐药菌株表现出高遗传多样性的特点，在这270个MTB分离株中，102株临床MTB菌株经药物敏感试验（drug susceptibility testing，DST）鉴定为耐药（drug resistance，DR），其中有 52 株 MDR菌株（19.3%），其中北京基因型占78.85%，其次是孤立基因型（15.38%）。
刘晓俊等 ［7］ 对宜昌地区367株MTB临床分离株进行24位点MIRU-VNTR基因分型，用HGI和遗传差异值（h）对MIRU位点的分辨率和差异性进行评价同时对VNTR-MIRU结果进行成簇性分析，根据近期传播率公式计算其近期传播率；367株菌株分离来自367例患者，细分为初治患者321例、复治患者46例后，分别进行成簇率统计。367株结核分枝杆菌24位点VNTR-MIRU分型结果显示，其总的分辨率HGI值为0.999，其中遗传多样性最高的位点为QUB11b，h=0.79；遗传多样性最低的位点为MIRU24，h=0.03。分析时发现基因型呈明显的多态性，总共有324个基因型。成簇性分析发现，其中90株菌株形成39个簇，成簇率为24.52%（90/367），近期传播率为13.90%（51/367）；复治患者菌株成簇率为21.74%（10/46），初治患者菌株成簇率为24.92%（80/321），两者成簇率比较，差异无统计学意义（χ 2 =0.220， P =0.639），提示近期传播致病的传播率初治和复治患者相当，宜昌地区结核病患者以既往感染的内因复燃为主。此研究中近期传播率为13.90%，提示宜昌区存在MTB近期传播风险，应当在结核病防治过程中加强监测。
Luo 等 ［8］ 使用 RD105 缺失 -靶向多重 PCR（RD105 deletion-targeted multiplex PCR，DTM-PCR）方法对从江西省收集的157株MDR（84.1%）结核分枝杆菌分离株进行基因分型，其中132株为北京基因型，25株为非北京基因型。进一步MIRU-VNTR聚类分析显示，157株菌株被分类为114种基因型。共有105株菌株具有唯一模式，其余52株被分组为13个集簇，聚类率为33.1%（52/157），近期传输速率24.8%（39/157）。13个集簇的52株菌株中，50株为北京基因型，2株为非北京基因型，两种基因型间的聚类能力无明显差异（OR=3.16，95%CI 0.91～10.92， P =0.057）。结果显示，在耐多药菌株中最常见的基因突变位点为 rpoB531 、 katG315 、 inhA - 15 、 ahpC ，而北京基因型菌株与非北京基因型菌株在密码子突变位点方面无显著差异。
在江西省熊光初等 ［9］ 采用15位点MIRU-VNTR分型方法，对371株耐药结核分枝杆菌进行基因分型，其中农村地区294株，城镇77株，从而比较农村与城镇人群耐药MTB的分子流行病学特征。农村与城镇耐药结核菌均以北京基因型为主，分别占86.05%和84.42%，农村人群耐药结核菌的15位点MIRU-VNTR的HGDI值为0.996 9，城镇为0.993 5，所有菌株共产生33个基因簇，成簇率为28.64%，其低成簇率表明此地区患者耐药结核菌感染以复燃为主，故提示治疗中应增大患者药物实用的依从性。城镇人群耐药结核传播感染率为15.58%，农村为18.03%，两类人群的传播率无明显差异。
Li等 ［10］ 利用Spoligotyping和15位点MIRU-VNTR基因分型方法对河北省内123株耐多药菌株进行基因分型。结果表明，非典型北京基因型（SIT1）占MDR分离株的89.4%（110/123），7 株为非典型北京基因型（SITs 190、260、265 和 2 101）（7/123，5.7%），其余菌株分别属于 T1 基因型（SIT291 和 53）（3/123，2.4%）、T2（SIT52）（1/123，0.08%）、LAM1（SIT961）（1/123，0.08%）和 U（SIT602）（1/123，0.08%）。在 117株北京基因型中，73株（73/117，62.4%）为单纯 MDR-TB，30株（30/117，25.6%）为 Pre-XDR，14株（14/117，12.0%）为 XDR-TB。在此研究中，北京基因型在不同DST类型中所占比例较高。为了更好地了解MDR-TB菌株的传播，此研究用具有详细遗传和表型谱的15位点MIRU-VNTR建立系统发育树。123株MDR-TB菌株可分为8个小簇，包含24个菌株，而其余99个菌株表现出独特的模式。低的聚类率（19.5%）和较小的集群规模（每个集群2～5株）表明此地区MDR-TB菌株可能是在特定条件下（特别是在人类频繁迁移的地区）出现的，不同的基因型和耐药谱表明原发性获得性耐药是河北省耐多药结核病发生的重要因素。
谢彤等 ［11］ 对天津市监狱羁押结核病患者进行分子流行病学的研究，结果显示北京基因型MTB是天津市监狱羁押结核病患者感染的优势菌株，至少发现4个北京基因型进化分支在监狱肺结核患者中流行；但结核病患者感染不同进化分支的比例存在较大的差异，RD150（+）北京基因型现代菌株是导致北京基因型在天津监狱羁押人员中传播的主要分支，提示该进化分支较其他进化分支具有更强的毒性。今后在针对引起北京基因型广泛传播的分子机制研究中，应重点对RD150（+）北京基因型现代这一分支开展研究，同时也十分有必要着重针对RD150（+）北京基因型现代菌株的流行开展监测。
赵明惠等 ［12］ 对江西省114株HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌临床分离株进行分型研究，北京家族基因型菌株仍为HIV/MTB双重感染病例中结核分枝杆菌主要流行菌株。114例HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌成2个大的基因家族，即北京基因型家族和非北京基因型家族，分别占66.7%（76/114）和33.3%（38/114），共30种基因型。其中，非北京家族包括T家族共18株，H家族共5株，EAl5基因家族1株，CAS1-DEHLI基因家族1株及12种在数据库中没有对应基因家族或没有匹配的结果的新基因型13株。这对HIV/MTB双重感染人群结核病的流行趋势分析、防控措施制定等具有重要指导意义。
北京基因型MTB在国内广泛流行，虽然许多流行病学的研究探索了北京基因型与耐药间的关系，但其中这些关联的潜在机制还未被揭示，进一步的实验研究和深入的分子机制需要学者们继续努力探索。
（梁晨 李传友 唐神结）
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