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（1）早期实验室及流行病学证据
●在动物和人体内，病毒可导致皮肤和黏膜乳头瘤（疣）。
●棉尾兔乳头瘤病毒诱导的表皮疣可发展为鳞状细胞癌，病毒致癌性可被化学致癌剂增强；然而未发现人体普通的疣可进展为肿瘤。
●19世纪中期，发现子宫颈癌与性传播感染有关：在性工作者中高发，在女性出家者或处女中极少见。
●1970年，发现子宫低度内皮病变的细胞中有带空泡的核，与皮肤疣中的组织学特征相近，发现空泡核中含有典型的HPV病毒结构特征，暗示子宫颈癌前病变是病毒诱导的。
●1970年，基于核酸杂交，发现很多从疣体中分离的HPV型别。
●1983年，Harald zur Hausen（2008年诺贝尔生理学或医学奖获得者）从子宫颈癌活检标本中克隆出 HPV 16 基因，该序列探针与50%以上的子宫颈癌标本杂交阳性。
●随后发现HPV 16/18的 E6 和 E7 基因在子宫颈癌组织和子宫颈癌细胞株中表达。
●将HPV分为高危和低危：HPV6/11导致尖锐湿疣和其他良性病变，但是不导致肿瘤；高危型也导致良性病变，但在鳞柱交接的转化带非常倾向于导致恶性病变。
●1990年前后，发现高危HPV的 E6 和 E7 基因可永生化人类表皮细胞株，包括宫颈和包皮的角质细胞。可抑制p53和pRb等抑癌基因。
●由于分子诊断水平不足，无法明确HPV感染状态，导致最初的病例对照研究不支持上述实验室结果。
●PCR试剂进步，随后证明高危HPV感染是子宫颈癌的高危因素，相对危险度（RR）高于100。
●21世纪初，确认高危HPV感染是子宫颈癌的核心因素（必要非充分）。
（2）1990年，启动HPV疫苗研究
不考虑减毒或灭活疫苗的两个原因：
a：HPV无法在细胞模型中培养；
b：HPV至少含有E5/E6/E7三个致癌基因，存在安全性隐患。
理解HPV结构为无包膜二十面体衣壳含有360个L1和12～72个L2。
野生型病毒进行腹腔或肌内注射可诱导中和抗体，预防后续的病毒感染；而变性或者非正确构象的L1则不行，提示疫苗中需要包含完整的正确构象L1单位。
已知：部分无包膜二十面体衣壳病毒可自装配成VLP，如多瘤病毒、乙肝病毒。
1991年，周健博士和Frazer教授在CV-1细胞中用痘病毒载体共表达L1和L2形成35～40nm（HPV病毒直径为50～55nm）VLP，被认为是“不完全正确组装的HPV壳粒阵列”。当时没有合适的中和抗体实验平台，无法评估其作为HPV疫苗的潜力。
（3）启动HPV疫苗研究
随后以SV40病毒载体在COS细胞表达HPV1的L1，但未形成VLP。
John Schiller等用杆状病毒系统表达出BPV L1 VLP，直径50nm，且能诱导出极高滴度的中和抗体（100 000）。这证明BPV L1自身可组装成VLP，且诱导极高滴度抗体。然而表达出的HPV L1无法组装成VLP?
可能原因1：L1表达量不足——表达出足量HPV16 L1仍不形成VLP。
可能原因2：不同型HPV L1自装配能力不同——前期已表达出恒河猴乳头瘤病毒（RhPV1）L1蛋白组装成VLP。
思考：可能是使用的HPV
L1
基因缺陷。
A：改用低度病变组织中分离的HPV16 L1，组装出VLP，发现精氨酸到组氨酸的突变，导致组装缺陷。
B：之后不同实验室用不同的表达系统陆续表达出HPV L1 VLP。
（4）HPV疫苗研究的快速发展
随后动物实验证明COPV、CRPV、BPV4的L1 VLP可在狗、兔子和牛中保护病毒攻击。
建立中和抗体检测平台：
A：L1和L2包裹 BPV 基因假病毒细胞中和模型。
B：L1和L2包裹报告基因假病毒细胞中和模型。
C：假病毒小鼠阴道感染动物保护评价模型。
证明HPV为型特异性，而同一型别内不存在不同的血清型。
多种细胞表达系统制备HPV L1蛋白。
HPV L1蛋白体外组装研究工艺成熟。
HPV L1蛋白结构研究取得显著成效。
启动多价HPV疫苗临床研究。
L1蛋白可自组装成VLP
HPV衣壳蛋白L1可在体外自组装成病毒样颗粒（VLP），无病毒核酸，不具有感染能力，与真病毒结构高度相似，具有较高的免疫原性，能诱发机体产生具有较高的保护性中和抗体（图1-3-10）。
图1-3-10 HPV VLP组装过程
注：由5个HPV L1单体组装成一个HPV五聚体，72个五聚体组装成T=7d的正二十面体病毒样颗粒
HPV L1疫苗制备过程（图1-3-11）
图1-3-11 HPV VLP疫苗制备过程
注：首先将L1基因整合至相应的表达载体，之后将表达载体导入相应的表达系统（包括酵母、杆状病毒-昆虫细胞以及大肠埃希菌表达系统）中，并经过纯化、组装过程得到HPV VLP，与佐剂混合制备成HPV VLP疫苗，之后进行临床前及临床试验，验证疫苗的安全性和有效性
理化性质检测：蛋白的大小，粒径，各组分含量等。
结构确证：N端和C段测序、氨基酸组成、质谱分子量、肽图指纹、三维结构解析等。
杂质去除检测：无菌检测，热原检测，异常毒性检测等。
效力检测：免疫小鼠和食蟹猴并进行细胞中和实验检测。
抗原鉴定：HPV型别特异L1蛋白VLP。
抗原含量：＞95%。
半数有效剂量ED
50
。
DNA 残余量：＜10ng/剂。
宿主蛋白残余量：＜0.1%。
内毒素：＜5EU/剂。
佐剂。
（1）HPV疫苗安全性评价
单次肌内注射给予ICR小鼠的毒性试验：解剖分析毒性反应。
重复肌内注射给予SD大鼠12周和恢复期4周的毒性试验：进一步评价毒性反应以及可能出现的延迟性毒性反应。
给予豚鼠的全身过敏反应试验：分析速发型全身过敏反应。
重复肌内注射给予SD大鼠生殖发育毒性试验：分析疫苗对生育能力、妊娠、哺乳、胚胎以及胚胎发育的影响。
（2）HPV疫苗有效性评价
主要采用假病毒-细胞体外中和检测模型，流程如图1-3-12：
图1-3-12 HPV假病毒-细胞体外中和检测示意图
注：将携带GFP报告基因的HPV假病毒与待检测系列梯度稀释血清孵育，然后加入贴壁的293FT细胞中，培养 72小时，通过与阳性和阴性对照组比较，分析实验组中GFP蛋白的表达强度，计算出血清阻断50%病毒感染的临界点，进而判断血清的中和滴度值
（1）临床试验设计
Ⅰ期临床试验
主要研究目的：研究不同剂量、不同配比受试疫苗的安全性和耐受性。
Ⅱ期临床试验
主要研究目的：探索不同剂量、不同配比受试疫苗在目标人群中的免疫原性（和保护率）及安全性，以期选择最优剂量和配比的受试疫苗进入下一阶段评估。
Ⅲ期临床试验
主要研究目的：评价疫苗的保护效果和安全性，研究终点主要包括病毒学终点（疫苗型别相关的一过性感染、6个月持续性感染和12个月持续性感染）和组织学终点（疫苗型别相关高度癌前病变）。
桥接试验
主要研究目的：评价疫苗（不同免疫程序）在青少年中的免疫原性是否非劣效于成年女性。
（2）临床试验安全性评价：国内外临床试验数据表明已上市的进口疫苗和目前已完成三期临床试验的国产疫苗均有良好的安全性（表1-3-1） [9-11] 。
表1-3-1 HPV疫苗国内Ⅲ期临床试验安全性数据的比较
注：试验对象年龄：国产二价疫苗为18～45岁；进口四价疫苗为20～45岁；进口二价疫苗为18～25岁
（3）HPV疫苗上市后安全性分析 [12-15]
至少已有2.7亿支HPV疫苗被使用，大量监测数据证明了疫苗的长期安全性。
●局部和全身不良反应常见，通常较轻微。局部疼痛、红肿最为常见。
●疫苗可能有关的严重不良事件（SAE）十分罕见，与其他疫苗类似。
●WHO全球疫苗安全顾问委员会（GACVS）于 2007、2008、2009、2013、2014、2015、2017年系统审查了HPV疫苗的安全性数据，认为已上市的2个疫苗均是安全的。
●GACVS特别审查了吉兰-巴雷综合征、复合性区域疼痛综合征（CRPS）、体位性心动过速综合征（POTS）、妊娠相关症状等，未发现其与疫苗接种的因果关系。
●国际妇产科联盟（FIGO）审查了现有数据后，支持HPV疫苗在适用人群中的持续使用。
●接种HPV疫苗不会增加不良妊娠结局的风险。
（4）免疫原性与免疫持久性考察 [9，16，17]
15～45岁男女性
●免疫原性：已上市HPV疫苗均具有良好的免疫原性，血清阳转率几乎均为100%，抗体滴度在全程免后一个月达到峰值，为自然免疫产生抗体滴度的100倍。
●免疫持久性：疫苗免后2年抗体滴度达到平台期，约为自然免疫获得的抗体滴度的10倍，目前进口二价和四价疫苗分别报道了免后10年和9.4年的数据，国产二价疫苗报道了免后3.5年的数据。
●保护性抗体水平：由于未出现突破病例，目前尚无法确定保护性抗体水平的界值。
9～14岁男女性
●间隔6或12个月接种2针疫苗均可产生不低于15～26岁女性接种3针疫苗的抗体滴度。
●间隔6个月接种2针疫苗均可产生非劣效于同年龄段女性接种3针疫苗的抗体滴度。
●若进行2针接种程序，2针间间隔越长免疫原性越好：0个月/12个月程序优于＞0个月/6个月程序。
（5）国外临床试验中的有效性：国外临床数据表明已上市的疫苗对15～45岁女性均有保护性，但由于大年龄组女性人数较少，试验组与对照组的差异无统计学意义（表1-3-2） [10，11，18] 。
表1-3-2 进口HPV疫苗对国外不同年龄段女性的保护性
在我国开展的临床试验中的有效性：国内临床试验数据表明已上市的进口疫苗和目前已完成三期临床试验的国产二价疫苗对女性均有较好的保护性（表1-3-3） [9，19，20] 。
表1-3-3 HPV疫苗国内Ⅲ期临床试验有效性数据的比较
注：数据收集时长：HPV16/18（大肠埃希菌）随访3.5年；HPV16/18（昆虫细胞表达）随访6年；HPV6/11/16/18（酵母表达）随访6.5年；试验对象年龄：HPV16/18（大肠埃希菌）为18～45岁；HPV16/18（昆虫细胞表达）为18～25岁；HPV6/11/16/18（酵母表达）为20～45岁
* 显示数据为HPV 6/11/16/18四个型别的持续感染病例数
1.人乳头瘤病毒是一类无包膜的双链DNA病毒，感染宿主上皮细胞后引起各种良性和恶性上皮异常增生；其早期蛋白为致癌蛋白，主要衣壳蛋白L1可在体外表达和自助装形成病毒样颗粒，富含中和表位，是理想的疫苗分子。
2.HPV持续感染是诱发子宫颈癌的最主要原因，高危型HPV E6和E7蛋白的异常表达是促使原代角质细胞永生化并诱导宿主基因组不稳定的主要因素；一般感染HPV后90%会在2年内自行清除，5%～7%会发展成CIN2/3。
3.HPV疫苗免疫机体后会诱发机体免疫系统产生高滴度的血清中和抗体，该抗体通过阻碍病毒与宿主表面受体相互作用，进而阻碍病毒入胞，达到预防病毒感染的作用。
4.基于HPV病毒自身特点，利用真核和原核表达系统制备的HPV L1 VLP是一种理想的疫苗形式，该疫苗已在国内外上市或已完成三期临床试验，临床试验显示该疫苗具有良好的安全性和有效性以及免疫持久性，可有效地预防子宫颈癌、肛周及外生殖器肿瘤和尖锐湿疣等疾病的发生。
（吴婷 张军）
1.de Martel C，Plummer M，Vignat Je，et al.Worldwide burden of cancer attributable to HPV by site，country and HPV type.International journal of cancer，2017，141（4）：664-670.
2.Li Z，Yan X，Yu H，et al.The C-Terminal Arm of the Human Papillomavirus Major Capsid Protein Is Immunogenic and Involved in Virus-Host Interaction.Structure，2016，24（6）：874-885.
3.Guan J，Bywaters SM，Brendle SA，et al.Cryoelectron Microscopy Maps of Human Papillomavirus 16 Reveal L2 Densities and Heparin Binding Site.Structure，2017，25（2）：253-263.
4.Li Z，Wang D，Gu Y，et al.Crystal Structures of Two Immune Complexes Identify Determinants for Viral Infectivity and Type-Specific Neutralization of Human Papillomavirus.mBio，2017，8（5）：e00787-e00817.
5.Guan J，Bywaters S M，Brendle SA，et al.The U4 Antibody Epitope on Human Papillomavirus 16 Identified by Cryo-electron Microscopy.Jouranl of Virology，2015，89（23）：12108-12117.
6.Roden，RBS，Stern PL.Opportunities and challenges for human papillomavirus vaccination in cancer.Nature Reviews Cancer，2018，18（4）：240-254.
7.Bruni L，et al.ICO Information Centre on HPV and Cancer（HPV Information Centre）.Human Papillomavirus and Related Diseases in the World.Human Papillomavirus and Related Diseases in China.Summary Report，27 July 2017
8.Chen W，Zhang X，Molijn A，et al.Human papillomavirus type-distribution in cervical cancer in China：the importance of HPV 16 and 18.Cancer Causes Control，2009，20（9）：1705-1713.
9.Qiao YL，Wu T，Li RC，et al.Efficacy，safety and immunogenicity of a Escherichia coli-produced bivalent human papillomavirus vaccine in adult women——A Randomized Clinical Trial.J Natl Cancer Inst.2019，ePub ahead of print.
10.四价人乳头瘤病毒疫苗（酿酒酵母）说明书，2017.
11.双价重组人乳头瘤病毒疫苗说明书，2016.
12.Hanley SJ，Yoshioka E，Ito Y，et al.HPV vaccination crisis in Japan.Lancet，2015，385（9987）：2571.
13.Scheller NM，Svanström H，Pasternak B，et al.Quadrivalent HPV vaccination and risk of multiple sclerosis and other demyelinating diseases of the central nervous system.JAMA，2015，313（1）：54-61.
14.Panagiotou OA，Befano BL，Gonzalez，et al.Effect of bivalent human papillomavirus vaccination on pregnancy outcomes.BMJ，2015，351：h4358.
15.WHO.Weekly epidemiological record，2017.
16.WHO，SAGE meeting of October，2018.
17.Hu YM，Guo M，Li CG，et al.Immunogenicity noninferiority study of 2 doses and 3 doses of an Escherichia coli-produced HPV vaccine in girls vs 3 doses in young women.Sci China Life Sci.2019，ePub ahead of print.
18.Wheeler CM，Skinner SR，Del Rosario-Raymundo MR，et al.Efficacy，safety，and immunogenicity of the human papillomavirus 16/18 AS04-adjuvanted vaccine in women older than 25 years：7-year follow-up of the phase 3，double-blind，randomised controlled VIVIANE study.Lancet Infect Dis，2016，16（10）：1154-1168.
19.Zhu FC，Hu SY，Hong Y，et al.Efficacy，immunogenicity，and safety of the HPV-16/18 AS04-adjuvanted vaccine in Chinese women aged 18-25 years：event-triggered analysis of a randomized controlled trial.Cancer Med，2017，6（1）：12-25.
20.Wei LH，Xie X，Liu JH，et al.Efficacy of quadrivalent human papillomavirus vaccine against persistent infection and genital disease in Chinese women：A randomized，placebo-controlled trial with 78-month follow-up.Vaccine.2018，ePub ahead of print.