第二十二章
中药提纯辅料在蛋白质类成分的提取和分离纯化中的应用

第一节　蛋白质类成分概述

在中药中，蛋白质和酶是普遍存在的一类化合物，但已发现作为有效成分而存在的却为数不多。近年来随着研究工作的不断深入，陆续开发了中药中具有不同活性的蛋白质。例如来自番木瓜的蛋白质水解酶，可作驱除体内寄生虫药，称为木瓜酶；来自凤梨的凤梨酶又称菠萝酶，可以消化蛋白质，并作为除肠虫药和抗水肿及抗炎药包括血栓静脉炎；此外，多肽、低肽和糖肽也是目前正在展开的研究项目，例如蜂毒素中的主要成分为蜂毒肽（melittin），有强溶血作用和表面活性，它由26个氨基酸分子组成；另一种多肽为蜂毒明肽（apamin），具有兴奋中枢神经的作用，由18个氨基酸分子组成，两者的氨基酸排列顺序均已探明，目前正进一步作临床研究；水蛭素（hirudin）系抗凝血的一种成分，分子量约为20 000，分子中含有较大比例的二羧基氨基酸，所以多肽呈酸性反应，其组成中没有色氨酸和精氨酸，能作抗凝血药用；低肽类物质如牛黄中的水溶性肽，具有收缩平滑肌和降血压作用，其结构和组成正在研究之中；麝香中的水溶性低肽，具抗菌消炎作用，目前已作药用。另外，随着肿瘤药物研究的深入开展，单克隆抗体的出现，为一些毒蛋白的应用开辟了新的领域。例如相思子毒蛋白（abrin）、蓖麻毒素（ricin）、商陆抗病毒蛋白，其他如天花粉、肥皂草素、白树素等，作为单克隆抗体的一部分与载体组合成导向药物。

第二节　蛋白质类成分的理化性质

蛋白质是一类大分子的胶体物质，分子量很大，可以达到数百万甚至千万以上，少数蛋白质已能制成晶态。多数可溶于水，生成胶体溶液。一般煮沸其水溶液，蛋白质即被凝结而自溶液中沉淀析出，振摇蛋白质水溶液能产生似肥皂状的泡沬。蛋白质可呈现颜色反应，如双缩脲反应，Millon反应和Hopkins-Cole反应等；蛋白质和氨基酸一样，分子中既有羟基又有氨基，致呈酸碱两性反应；蛋白质溶液在等电点时，消除了电荷间的排斥作用而产生凝聚；蛋白质遇热，遇酸、碱、乙醇、丙酮等试剂而发生变性，吸水能力和溶解度大为降低，黏度增加，结晶性被破坏等。

第三节　蛋白质类成分的提纯辅料及其应用方法

一、蛋白质类成分的提纯辅料

蛋白质类成分的提纯辅料包括溶剂（用水提取，用乙醇、丙酮分离纯化）、无机盐类、分离膜类、色谱支持剂（硅藻土、葡聚糖凝胶、离子交换树脂等）、pH调节剂、助滤剂及过滤材料等几大类。

二、蛋白质类成分提纯辅料的应用方法

（一）提取辅料的应用方法

蛋白质一般用水冷浸提取，但其浸出液中除含蛋白质外，尚含有糖、无机盐、有机酸和苷类等杂质，故常先加入等量乙醇或丙酮，使蛋白质或酶沉淀。由于在常温下蛋白质或酶对溶剂的不稳定性，故操作时应在较低温度下迅速进行，并需加以搅拌，勿使局部溶剂浓度过高。

（二）分离纯化辅料的应用方法

以上析出的沉淀是总蛋白质，其中还可能带有一部分杂质，经离心后分出沉淀，以水溶解，再用分级沉淀法、透析法、色谱法、凝胶过滤法、电泳法等进行纯化，有时几种方法合并使用，则分离效果更佳。

1.分级沉淀法

常用的分级沉淀法有以下3种。

（1）有机溶剂分级沉淀法：

溶剂和蛋白质溶液均需预先冷却，然后将有机溶剂由低到高选择几个浓度，每一浓度所沉淀的蛋白质应立即离心分离，并溶于足够量的水或缓冲液中，使其中所含的有机溶剂稀释，然后在母液中再继续加入有机溶剂至预定的另一浓度，以沉淀另一部分蛋白质，最常用的有机溶剂为乙醇和丙酮。

（2）无机盐分级沉淀法：

由于硫酸铵的溶解度较大，对蛋白质或酶又无破坏作用，故最为常用。氯化钠、硫酸钠、硫酸铜、硫酸镁等也可使用。使用硫酸铵时，因它溶于水后呈酸性，故需注意调节pH至6～7。硫酸铵在溶液中的浓度常以饱和度表示，溶液体积及加入硫酸铵的克数，如表22-1所示。

（3）pH分级沉淀法：

本法是利用蛋白质在等电点时最难溶解的特性，采取改变pH的方法，使一部分蛋白质沉淀，以达到分离纯化的目的。

用分级沉淀法所得的蛋白质，常含有无机盐或其他小分子杂质，可采用透析法除去。

2.色谱法

色谱法包括吸附色谱、凝胶色谱和离子交换色谱等，均可用于蛋白质的分离分析。

将以沉淀法获得的总蛋白质，加硅藻土混匀后上样于吸附柱上，然后按色谱法的洗脱技术，用硫酸铵溶液作洗脱剂，可以使混合蛋白质分离，同时除去杂质，达到精制的目的。

应用凝胶色谱法即所谓分子筛分离法，通常可根据分离对象选用合适的葡聚糖凝胶，即合适的sephadex型号或交链的多聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。凝胶依法装柱后，将欲分离的蛋白质混合物溶液上样，用合适的洗脱剂洗脱，蛋白质将按其分子的大小分别洗脱出柱，此法还可作蛋白质分子量的测定。

离子交换色谱法，除常用的各种离子交换树脂外，在分离蛋白质时应用亲水性较强的离子交换剂，例如离子交换纤维粉和离子交换凝胶。纤维粉或凝胶分子带有二乙氨乙基时能呈阴离子交换的性能，分别称为DEAE阴离子交换纤维粉和DEAE葡聚糖凝胶（如DEAE-sephadex A-50）。当纤维粉或凝胶分子带有羧甲基时，能呈阳离子交换的性能，CM为羧甲基的缩写。在作此类色谱分离时，常采用分级洗脱或梯度洗脱技术。由于洗脱物是无色的，采用分步收集的方法，用显色反应检定各部分的收集液以决定取舍，再辅以电泳法以确定收集部分中蛋白质的分离情况。

其他如超速离心法也是分离蛋白质混合物的常用技术。随着超速离心机的不断改进，转速已达每分钟100 000次以上，使重力增加数十万倍，不同分子量的沉降速度会有显著的不同，借此可使各种不同的蛋白质分开。

第四节　蛋白质类成分提纯辅料及其应用方法的实例

一、天花粉蛋白类成分的提取分离

天花粉是葫芦科植物栝楼（ Trichosanthes kirilowii Maxim.）的根，有生津止渴，除火润燥、排脓消肿等功效。天花粉蛋白是栝楼根的一种有效成分，主要用于中期妊娠引产，并用于治疗恶性葡萄胎和绒毛膜上皮癌。

临床用精制天花粉蛋白的提取分离法如下：

精制天花粉蛋白经化学分析，蛋白质含量可达80%左右，灰分在10%以下。经琼脂加羧甲基纤维素电泳鉴定，主要有1个斑点。若进行聚丙烯酰胺凝胶电泳尚有6～7条区带，但其有效蛋白含量很高，无效蛋白含量甚微。其免疫电泳可见到3条弧线，其中一条是主要的，说明这一条就是有效蛋白，其他为无效或低效蛋白。经SDS（十二烷基磺酸钠）聚丙烯酰胺凝胶电泳证明，一些无效蛋白质的分子量都比较大，一般认为分子量越大越容易引起过敏。为进一步提纯，可将天花粉蛋白粗品经两次CM-sephadex C-50色谱分离后，即得天花粉蛋白引产有效之纯品。它在免疫电泳上仅为1条弧线，经测定，其分子量约为18 000，等电点为9.4，是碱性蛋白质，并且可能含糖。

二、雷丸中蛋白类成分的提取分离

中药雷丸是多孔菌科植物雷丸菌（ Omphalia iapidescens Schroet.）的干燥菌核，主要用于虫积腹痛，治疗绦虫及钩虫病，而以驱绦虫为主。其有效成分为雷丸素，是一种蛋白酶，可溶于水，不溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等。易受热破坏，在碱性环境中药性最强，酸性环境中则失效，故宜制成肠溶片。

其提取纯化方法如下：

三、半夏中蛋白类成分的提取分离

半夏是天南星科植物半夏［ Pinellia ternate （Thunb）Breit.］的块茎，现主要用于镇咳祛痰，《本草纲目》中曾记载半夏有“堕胎”作用。经动物实验证明半夏蛋白是抑制小白鼠早期妊娠的有效成分。半夏蛋白不含有己糖，可能是分子大小、结构和性质极为相近的一组蛋白。

其提取分离方法如下。

将新鲜半夏汁加固体硫酸铵至80%饱和度，室温静置。待盐析完全后，滤取沉淀物，每5g沉淀物用50ml离子交换水溶解，然后进行透析。透析完全后取出离心，将上清液在10℃下放置过夜，次日如有沉淀再离心除去，将清液在28～30℃放置，24小时后即有结晶析出，约1周后结晶完全。取所得结晶用10%饱和度硫酸铵溶液溶解，对同浓度的硫酸铵溶液透析平衡，如有沉淀可弃去，离心后，上清液对0.008mol/L磷酸钠缓冲液（内含0.02%叠氮钠作为防腐剂）透析平衡，25～30℃放置，晶体即自上而下沿透析袋壁析出。 JF3HbExOLjsrKFpmjBAJXT9W1KdmaGQ/DVjODxCFAQtwiZXoKjbRVHTbmz+evAtV