在中药中,蛋白质和酶是普遍存在的一类化合物,但已发现作为有效成分而存在的却为数不多。近年来随着研究工作的不断深入,陆续开发了中药中具有不同活性的蛋白质。例如来自番木瓜的蛋白质水解酶,可作驱除体内寄生虫药,称为木瓜酶;来自凤梨的凤梨酶又称菠萝酶,可以消化蛋白质,并作为除肠虫药和抗水肿及抗炎药包括血栓静脉炎;此外,多肽、低肽和糖肽也是目前正在展开的研究项目,例如蜂毒素中的主要成分为蜂毒肽(melittin),有强溶血作用和表面活性,它由26个氨基酸分子组成;另一种多肽为蜂毒明肽(apamin),具有兴奋中枢神经的作用,由18个氨基酸分子组成,两者的氨基酸排列顺序均已探明,目前正进一步作临床研究;水蛭素(hirudin)系抗凝血的一种成分,分子量约为20 000,分子中含有较大比例的二羧基氨基酸,所以多肽呈酸性反应,其组成中没有色氨酸和精氨酸,能作抗凝血药用;低肽类物质如牛黄中的水溶性肽,具有收缩平滑肌和降血压作用,其结构和组成正在研究之中;麝香中的水溶性低肽,具抗菌消炎作用,目前已作药用。另外,随着肿瘤药物研究的深入开展,单克隆抗体的出现,为一些毒蛋白的应用开辟了新的领域。例如相思子毒蛋白(abrin)、蓖麻毒素(ricin)、商陆抗病毒蛋白,其他如天花粉、肥皂草素、白树素等,作为单克隆抗体的一部分与载体组合成导向药物。
蛋白质是一类大分子的胶体物质,分子量很大,可以达到数百万甚至千万以上,少数蛋白质已能制成晶态。多数可溶于水,生成胶体溶液。一般煮沸其水溶液,蛋白质即被凝结而自溶液中沉淀析出,振摇蛋白质水溶液能产生似肥皂状的泡沬。蛋白质可呈现颜色反应,如双缩脲反应,Millon反应和Hopkins-Cole反应等;蛋白质和氨基酸一样,分子中既有羟基又有氨基,致呈酸碱两性反应;蛋白质溶液在等电点时,消除了电荷间的排斥作用而产生凝聚;蛋白质遇热,遇酸、碱、乙醇、丙酮等试剂而发生变性,吸水能力和溶解度大为降低,黏度增加,结晶性被破坏等。
蛋白质类成分的提纯辅料包括溶剂(用水提取,用乙醇、丙酮分离纯化)、无机盐类、分离膜类、色谱支持剂(硅藻土、葡聚糖凝胶、离子交换树脂等)、pH调节剂、助滤剂及过滤材料等几大类。
蛋白质一般用水冷浸提取,但其浸出液中除含蛋白质外,尚含有糖、无机盐、有机酸和苷类等杂质,故常先加入等量乙醇或丙酮,使蛋白质或酶沉淀。由于在常温下蛋白质或酶对溶剂的不稳定性,故操作时应在较低温度下迅速进行,并需加以搅拌,勿使局部溶剂浓度过高。
以上析出的沉淀是总蛋白质,其中还可能带有一部分杂质,经离心后分出沉淀,以水溶解,再用分级沉淀法、透析法、色谱法、凝胶过滤法、电泳法等进行纯化,有时几种方法合并使用,则分离效果更佳。
常用的分级沉淀法有以下3种。
(1)有机溶剂分级沉淀法:
溶剂和蛋白质溶液均需预先冷却,然后将有机溶剂由低到高选择几个浓度,每一浓度所沉淀的蛋白质应立即离心分离,并溶于足够量的水或缓冲液中,使其中所含的有机溶剂稀释,然后在母液中再继续加入有机溶剂至预定的另一浓度,以沉淀另一部分蛋白质,最常用的有机溶剂为乙醇和丙酮。
(2)无机盐分级沉淀法:
由于硫酸铵的溶解度较大,对蛋白质或酶又无破坏作用,故最为常用。氯化钠、硫酸钠、硫酸铜、硫酸镁等也可使用。使用硫酸铵时,因它溶于水后呈酸性,故需注意调节pH至6~7。硫酸铵在溶液中的浓度常以饱和度表示,溶液体积及加入硫酸铵的克数,如表22-1所示。
表22-1 硫酸铵溶液饱和度
(3)pH分级沉淀法:
本法是利用蛋白质在等电点时最难溶解的特性,采取改变pH的方法,使一部分蛋白质沉淀,以达到分离纯化的目的。
用分级沉淀法所得的蛋白质,常含有无机盐或其他小分子杂质,可采用透析法除去。
色谱法包括吸附色谱、凝胶色谱和离子交换色谱等,均可用于蛋白质的分离分析。
将以沉淀法获得的总蛋白质,加硅藻土混匀后上样于吸附柱上,然后按色谱法的洗脱技术,用硫酸铵溶液作洗脱剂,可以使混合蛋白质分离,同时除去杂质,达到精制的目的。
应用凝胶色谱法即所谓分子筛分离法,通常可根据分离对象选用合适的葡聚糖凝胶,即合适的sephadex型号或交链的多聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)。凝胶依法装柱后,将欲分离的蛋白质混合物溶液上样,用合适的洗脱剂洗脱,蛋白质将按其分子的大小分别洗脱出柱,此法还可作蛋白质分子量的测定。
离子交换色谱法,除常用的各种离子交换树脂外,在分离蛋白质时应用亲水性较强的离子交换剂,例如离子交换纤维粉和离子交换凝胶。纤维粉或凝胶分子带有二乙氨乙基时能呈阴离子交换的性能,分别称为DEAE阴离子交换纤维粉和DEAE葡聚糖凝胶(如DEAE-sephadex A-50)。当纤维粉或凝胶分子带有羧甲基时,能呈阳离子交换的性能,CM为羧甲基的缩写。在作此类色谱分离时,常采用分级洗脱或梯度洗脱技术。由于洗脱物是无色的,采用分步收集的方法,用显色反应检定各部分的收集液以决定取舍,再辅以电泳法以确定收集部分中蛋白质的分离情况。
其他如超速离心法也是分离蛋白质混合物的常用技术。随着超速离心机的不断改进,转速已达每分钟100 000次以上,使重力增加数十万倍,不同分子量的沉降速度会有显著的不同,借此可使各种不同的蛋白质分开。
天花粉是葫芦科植物栝楼( Trichosanthes kirilowii Maxim.)的根,有生津止渴,除火润燥、排脓消肿等功效。天花粉蛋白是栝楼根的一种有效成分,主要用于中期妊娠引产,并用于治疗恶性葡萄胎和绒毛膜上皮癌。
临床用精制天花粉蛋白的提取分离法如下:
精制天花粉蛋白经化学分析,蛋白质含量可达80%左右,灰分在10%以下。经琼脂加羧甲基纤维素电泳鉴定,主要有1个斑点。若进行聚丙烯酰胺凝胶电泳尚有6~7条区带,但其有效蛋白含量很高,无效蛋白含量甚微。其免疫电泳可见到3条弧线,其中一条是主要的,说明这一条就是有效蛋白,其他为无效或低效蛋白。经SDS(十二烷基磺酸钠)聚丙烯酰胺凝胶电泳证明,一些无效蛋白质的分子量都比较大,一般认为分子量越大越容易引起过敏。为进一步提纯,可将天花粉蛋白粗品经两次CM-sephadex C-50色谱分离后,即得天花粉蛋白引产有效之纯品。它在免疫电泳上仅为1条弧线,经测定,其分子量约为18 000,等电点为9.4,是碱性蛋白质,并且可能含糖。
中药雷丸是多孔菌科植物雷丸菌( Omphalia iapidescens Schroet.)的干燥菌核,主要用于虫积腹痛,治疗绦虫及钩虫病,而以驱绦虫为主。其有效成分为雷丸素,是一种蛋白酶,可溶于水,不溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等。易受热破坏,在碱性环境中药性最强,酸性环境中则失效,故宜制成肠溶片。
其提取纯化方法如下:
半夏是天南星科植物半夏[ Pinellia ternate (Thunb)Breit.]的块茎,现主要用于镇咳祛痰,《本草纲目》中曾记载半夏有“堕胎”作用。经动物实验证明半夏蛋白是抑制小白鼠早期妊娠的有效成分。半夏蛋白不含有己糖,可能是分子大小、结构和性质极为相近的一组蛋白。
其提取分离方法如下。
将新鲜半夏汁加固体硫酸铵至80%饱和度,室温静置。待盐析完全后,滤取沉淀物,每5g沉淀物用50ml离子交换水溶解,然后进行透析。透析完全后取出离心,将上清液在10℃下放置过夜,次日如有沉淀再离心除去,将清液在28~30℃放置,24小时后即有结晶析出,约1周后结晶完全。取所得结晶用10%饱和度硫酸铵溶液溶解,对同浓度的硫酸铵溶液透析平衡,如有沉淀可弃去,离心后,上清液对0.008mol/L磷酸钠缓冲液(内含0.02%叠氮钠作为防腐剂)透析平衡,25~30℃放置,晶体即自上而下沿透析袋壁析出。