第十八章
中药提纯辅料在多糖类成分的提取和分离纯化中的应用

第一节　多糖类成分概述

多糖为一大类天然产物，广泛存在于动物、植物、微生物等有机体中。由于多糖多种多样的生物活性及在功能食品和临床上的广泛应用，使得多糖生物资源的开发利用和研究日益活跃，成为天然药物、生物化学、生命科学的研究热点。到目前为止，已有300多种多糖类化合物从天然产物中被分离出来，其中从植物，尤其是从中药中提取的水溶性多糖最为重要。糖类又称为碳水化合物（carbohydrates），是植物光合作用的初生产物，是一类最丰富的天然产物，除了作为植物的贮藏养料和骨架之外，植物中的绝大部分成分还需通过它们进行合成。糖类在中草药中分布十分广泛，常常占植物干重的80%～90%。一些具有营养、强壮作用的药物，如山药、何首乌、黄精、地黄、白木耳、大枣、枸杞子等皆含有大量糖类。糖类与核酸、蛋白质、脂肪一起合称生命活动所必需的四大类化合物。由于它在生物合成反应以及在细胞间的识别、受精、胚胎形成、神经细胞发育、激素激活、细胞增殖、病毒和细菌感染、肿瘤细胞转移等许多基本生命过程中的重要作用，其研究一直十分活跃。事实证明许多中草药的活性与糖及其衍生物有着密切的关系，尤其是糖与非糖物质结合的苷（glycoside），不少都具有生理活性。同样在动物、微生物机体内的一些内源性多糖亦被证明具有多种活性。如调节免疫功能，具有抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗凝血、降血糖、降血脂作用等。

多糖的结构分类沿用了对蛋白质和核酸的分类方法，单糖是糖类的组成单元，单糖之间脱水形成糖苷键，并以糖苷键线性或分支连接成寡糖和多糖。一般将少于20个糖基的糖链称为寡糖，多于20个糖基的糖链称为多糖。

一、植物多糖

1.淀粉（starch）

包括由α（1→4）连接的D-吡喃葡聚糖构成的直链淀粉（amylose）和α（1→4）连接的D-吡喃葡聚糖及α（1→6）构成支链的支链淀粉（amylopectin）。

2.纤维素（cellulose）

由β（1→4）结合的直链葡聚糖构成。

3.半纤维素（hemicellulose）

为一类不溶于水而能被稀碱溶出的酸性多糖的总称，包括由木糖β（1→4）连成主链，C ₂ 位或C ₃ 位处由L-阿拉伯糖和D-葡萄糖醛酸分支糖链构成的木聚糖，还有由D-甘露糖β（1→4）连成主链，C ₆ 位处由末端为D-半乳糖支链构成的甘露聚糖（mannan）等。

4.果聚糖（fructan）

比如菊淀粉（inulin），由约35个D-果糖β（2→1）连接成，末端再接D-葡萄糖。

5.树胶（gum）

比如阿拉伯胶（acacia gum），为以D-半乳糖β（1→3）连成主链，C ₆ 位处有分支，支链上由L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸等所构成。

6.黏液质（mucilage）和黏胶质（pecticsubstance）

比如人参果胶即为一种酸性杂多糖。

7.其他葡聚糖

比如黄芪多糖和一些真菌多糖，如从树舌［ Ganoderma applanatum （Pers.ex Wallr）Pat.］中分离到两种葡聚糖CF ₁ 和CF ₂ 。

二、动物多糖

1.糖原（glycogen）

α（1→4）连接的葡聚糖及α（1→6）分支糖链，和支链淀粉结构相似，但聚合度比淀粉低。

2.甲壳素（chitin）

为N-乙酰葡萄糖胺以β（1→4）反向连接的直线状结构。

3.酸性黏多糖（acid mucopolysaccharide）

自然界存在一大类由氨基己糖和糖醛酸组成重复单元的杂多糖，统称酸性黏多糖（acid mucopolysaccharide）或糖胺聚糖（glycosaminoglycan），包括以下几种：①肝素（heparin）；②硫酸软骨素（chondroitin sulfate）；③透明质酸（hyaluronic acid）；④硫酸角质素（keratan sulfate）、硫酸肝素（heparin sulfate）：寡糖和多糖的结构也可分为一级结构、二级结构、三级和四级结构。

第二节　多糖类成分的理化性质

多糖一般难溶于水，不溶于乙醇及其他有机溶剂，多数多糖无甜味，少数多糖如黄芪多糖有些许甜味。有部分多糖可溶于水，稀碱溶液。部分多糖在一定条件下可被酸或碱水解成单糖。

第三节　多糖类成分的提纯辅料及其应用方法

一、多糖类成分的提纯辅料

多糖类成分的提纯辅料包括溶剂（常用水、乙醇提取，用乙醚、石油醚、丙酮、乙醇等溶剂脱脂和分离纯化）、酸碱类、酶类、色谱支持剂（常用葡聚糖凝胶、活性炭、硅藻土、离子交换树脂等）、分离膜类、助滤剂及过滤材料等几大类。

二、多糖类成分提纯辅料的应用方法

（一）提取辅料的应用方法

首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同，决定在提取之前是否做预处理，对于动物多糖一般采用丙酮、乙醚、乙醇回流提取，即预处理，目的是脱脂。脱脂后的残渣或不需要脱脂的原料常用水作溶剂来提取多糖，此外也可用碱性溶液、氯化钠溶液作提取溶剂，也有用水、3%的碱溶液、10%的碱溶液依次回流或煮沸提取，所得的多糖提取液有的可直接过滤或者用离心法除去不溶物，应该注意尽量避免在酸性条件下提取，以防引起糖苷键的断裂，稀酸提取时，时间宜短、温度不宜超过50℃。

由于水提时间长且效率低，酸碱提取易破坏多糖的立体结构及活性，现在有的采用酶法提取多糖，即采用复合酶-热水浸提相结合的方法，复合酶多采用一定比例的果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶。此法具有条件温和、杂质易除、得率高等优点。

（二）分离纯化辅料的应用方法

1.除蛋白

除蛋白的技术主要应用于动物多糖的提取，以新鲜组织或丙酮脱脂脱水的组织为原料，可用水或盐溶液提取部分黏多糖。但因大部分黏多糖是与蛋白质结合的，需用酶降解蛋白质部分或（和）用碱使多糖蛋白质间的键裂开，以促进黏多糖在提取时的溶解。在碱性提取的同时用蛋白酶处理组织，可将提取过程简化。多糖中的游离蛋白质可用蛋白沉淀剂如三氯乙酸、鞣酸等除去，少量蛋白则用Sevag法除去；对于微生物多糖则用三氟三氯乙烷法，而植物多糖可用三氯乙酸法脱游离蛋白质。

2.透析法或柱离子交换法去离子

去离子是为以后进一步纯化及色谱分析做准备，最古老的去离子方法是透析法，必须选择一种规格适宜的透析膜以免样品损失。透析方法不仅能去盐，也可以除去各种小分子物质。使用柱离子交换法如用Sephadex G-25以达到去离子作用。本法比较简单，但是增大了溶液的体积，影响多糖的沉淀结果。

纤维滤器透析法是根据膜技术而新发展起来的，以这种方式对大多数样品进行浓缩速度很快，而且温和，所以即使发生失活也是很小的。利用不同孔径的膜有可能使大小不同的分子分级，但该方法的分辨率要比分子筛色谱可能达到的小得多。

3.乙醇沉淀

乙醇沉淀是一种从溶液中定量回收多糖的简单方法。由于不同性质或不同分子量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它同样也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离。要根据具体情况使用不同浓度的乙醇，其中需要考虑的包括多糖的浓度及盐浓度。

常用的分级沉淀法是在混合多糖的浓水溶液中逐步加入乙醇，收集不同醇浓度下析出的沉淀。为了多糖的稳定，常在pH=7时进行。但酸性多糖在pH=7时—COOH多以—COO ^- 离子形式存在，故需在pH 2～4时进行分离。为防止酸水解苷键，操作宜迅速。分级沉淀也适用于多糖的衍生物，如甲醚、乙酸乙酯，在醇溶液中分次加乙醚等极性更低的溶剂，各次沉淀需经反复溶解与醇析，直至测得物理常数恒定，最常用的是旋光度测定和电泳检查。含盐溶液沉淀法中常用的沉淀剂有乙醇、钡盐或锌盐（用于硫酸皮肤素）、乙酸钾等。

4.利用电离性质不同的沉淀分离法

多糖分子中的可电离基团有羟基及硫酸基，而且p K 、立体结构位置及硫酸基相连的基团不一，不同的羟基及硫酸基的p K 又有微小不同。与此同时，各种多糖中的羟基及硫酸基数量也存在差别，这些差别成为多糖分离的重要依据。常用的有以下两种方法：①季铵盐络合法（季铵氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性多糖形成不溶性沉淀，常用于分离酸性多糖。而它与中性多糖不生成沉淀，需要调高pH，使某些OH基解离，或加硼酸缓冲液提高糖的酸度使中性糖沉淀。常用的季铵氢氧化物如CTA-OH/cetyl trimethyl ammonium hydroxide和CP-OH/cetylpyridum hydroxide均可在酸性、中性、微碱性和碱性条件下分级沉淀分离多糖）。②电泳分离。

5.柱色谱法

（1）凝胶柱色谱法：

由于多糖富含氢键，沉淀法易造成多糖絮凝而使结果产品相对分子质量分布过大，难以得到特定分子质量或较纯的多糖，而凝胶过滤法则可按分子质量分离出令人满意的多糖，成为工业上较常用的手段。常用于分离多糖的凝胶有葡聚糖凝胶（sephadex G）、琼脂糖凝胶（sepharose，Bio-gel A）和聚丙烯酰胺凝胶（bio-gel P）等。

（2）活性炭柱色谱法：

活性炭吸附量大、效率高，是分离水溶性成分的常用吸附剂。柱色谱时活性炭中常拌入等量的硅藻土作稀释剂，以增加溶液的流速。含糖的水溶液上柱后，先用水洗脱无机盐、单糖等，继而在水中增加乙醇的浓度，逐步洗出二糖、三糖以及更大的低聚糖。由于市售的活性炭中混入金属离子，因此应该预处理除去。一般可用0.2mol/L枸橼酸缓冲液洗涤炭粉或用2～3mol/L盐酸煮沸几次，再用蒸馏水反复洗至中性。

（3）离子交换柱色谱法：

阳离子和阴离子交换树脂对除去水提液中的酸、碱性成分和无机离子十分有效，除去这些杂质后的中性糖及其苷再做进一步分离。但强碱性的树脂能与还原糖结合，用水不能洗脱，而且易进一步引起糖的异构化和降解。而强酸性的树脂易使不稳定的苷键裂解，尤其是呋喃糖苷键更易被裂解。所以在分离糖和苷时，宜采用弱酸/弱碱型交联度比较小的离子交换树脂。

将纤维素改性，使离子交换和纤维素色谱结合起来制成一系列离子交换纤维素，用于分离糖类，获得良好效果。常见的阳离子交换纤维素有CM-cellulose、P-cellulose、SE-cellulose、SM-cellulose，阴离子交换纤维素有DEAE-cellulose、ECTEOLA-cellulose、PAB-cellulose和TEAE-cellulose等。

中性糖与硼酸形成络合物后，可以增加其酸性，所以经硼酸处理的强碱性阴离子交换树脂可起到选择性交换的作用，然后用不同浓度的硼酸盐溶液洗脱。此法对单糖和低聚糖的分离效果较好，但洗脱体积很大，给后处理带来较大麻烦。

第四节　多糖类成分提纯辅料及其应用方法的实例

一、香菇中多糖成分的提取分离

本品为侧耳科植物香菇 Lentinus edode s（Berk）Sing.的子实体。主产于浙江、福建、江西、安徽、广西、广东等地。具有益胃气、托痘疹之功效。

（一）主要成分及理化性质

香菇含香菇精、香菇素、腺嘌呤（adenine）、香菇嘌呤（lentinacin），子实体含核糖核酸酶。此外含白蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、18种以上氨基酸，还含有脂肪、糖类、多种维生素、香菇多糖等。

（二）主要成分的提取分离

1.鲜香菇中香菇聚糖的提取分离

2.干香菇中水溶性、酸溶性、碱溶性香菇多糖的提取分离

（1）水溶性香菇多糖的提取分离

（2）酸溶性香菇多糖的提取分离

（3）碱溶性香菇多糖的提取分离

3.复合酶解法提取香菇多糖蛋白

二、茯苓中多糖成分的提取分离

本品为多孔菌科真菌茯苓 Poria cocos （Schw）Wolf的干燥菌核。主产于河北、河南、山东、安徽、浙江等地。具有渗湿利水，益脾和胃，宁心安神之功效。治小便不利、水肿胀满、痰饮咳逆、呕哕、泄泻、遗精、淋浊、惊悸、健忘等症。

（一）主要成分及理化性质

茯苓中含有多糖、三萜和脂肪酸类成分。其中茯苓糖（pachymose）为主成分，含量84.2%。另有报道β-茯苓聚糖（β-pachyman）为主成分，约占干品的93%。三萜类成分有茯苓酸（pachymic acid）、土莫酸（tumulosic acid）等。脂肪酸类有辛酸（caprylic acid）、月桂酸（lauric acid）等。其他尚含有麦角甾醇（ergosterol）、树胶、甲壳质、蛋白质、脂肪、卵磷脂等成分。

（二）主要成分的提取分离

1.茯苓多糖的提取分离

2.茯苓酸的提取分离

三、黄芪中有效成分的提取分离

别名：绵芪、绵黄芪。为豆科植物膜荚黄芪 Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.及蒙古黄芪 Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.var. mongholicus （Bge.）Hsiao的根。前者分布于黑龙江、吉林、辽宁、河北、山西、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏、青海、山东、四川和西藏等省区，后者分布于黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西和西藏等省区。本品性微温、味甘，具有补气固表、托疮生肌之功效，主治体虚自汗、久泻、脱肛、子宫脱垂、慢性肾炎、体虚浮肿、慢性溃疡、疮口久不愈合。

（一）主要成分及理化性质

根含香豆素、甜菜碱、胆碱、皂苷类成分。此外，还从中分离出2'，4'-二羟基-5，6-二甲氧基异黄烷及降压有效成分γ-氨基丁酸。又从根中分得芒柄花素、毛蕊异黄酮、β-谷甾醇。根部含以环黄芪醇为皂苷元的乙酰黄芪皂苷，黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ，异黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ及以大豆苷元B为皂苷元的黄芪皂苷Ⅷ和大豆皂苷Ⅰ。

蒙古黄芪根含β-谷甾醇、亚油酸及亚麻酸。还分离得到12种结晶成分，21种氨基酸和α-、β-天冬素，还证明含有胡萝卜苷、二十九烷、胆碱和蔗糖等，又提取到一种具有免疫促进作用的黄芪多糖，经水解后证明它是葡萄糖与阿拉伯糖的多聚体、分子量在2万以下，现又分离到降压的有效成分γ-氨基丁酸。另据报道，蒙古黄芪含棕榈酸、羽扇豆醇、β-谷留醇、黄芪皂苷、黄芪异黄烷苷、α-联苯双酯、天冬酰胺、大豆皂苷Ⅰ、刺芒柄花素和毛蕊异黄酮。

1.黄芪多糖（astragalan）

白色粉末，［α］ +123°（H ₂ O）。

2.黄芪甲苷（astragalosideⅣ）

又称黄芪皂苷。分子式C ₄₁ H ₆₈ O ₁₄ ，分子量784.98。为三萜苷，无色针晶，mp.299～301℃，［α］ +24.4°（C=0.23，甲醇）。

（二）主要成分的提取分离

1.黄芪多糖的提取分离

（1）水提醇沉法

（2）超滤法

2.黄芪多糖AG-1、AG-2、AH-1、AH-2的提取分离与纯化

四、猪苓中多糖类成分的提取分离

为多孔菌科植物猪苓 Polyporus umbellatus （Pers）Fr.的菌核。我国大部分地区均有分布。猪苓性味甘、平，具有利尿、渗湿之功效，主治水肿、小便不利、泌尿系感染、腹泻。

（一）主要成分及理化性质

含麦角甾醇，粗蛋白7.8%，苹果酸，维生素H，可溶性糖分，多糖及2-羟基廿四酸，水溶性多糖为葡聚糖（glucan），名为猪苓多糖。

（二）主要成分的提取分离

猪苓中猪苓多糖的提取分离 +Mf7WC5XmJLdrykw18xFdpYIzewWhWrCUP5rVEtZJ6SgB7zz5ZMuvjA48kgUS5Tc