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欲将中药制成制剂，尤其是现代制剂，除了极少数用量很小并能粉碎成细粉的植物药、矿物药可直接用于制剂制造外，其余绝大部分中药，不管是植物药、动物药或矿物药都必须经过提取、分离纯化后，才能制成满足现代临床需要的安全、有效的中药制剂。尤其是中药口服液、中药滴眼剂、中药注射剂等中药液体制剂，中药都须经过提取纯化才能制得。即便是中药口服固体制剂，为改变中药“粗、大、黑”的落后状况，也必须经过提取纯化，除去绝大部分杂质（或称无效成分），才能制成片剂、胶囊剂、微丸剂等现代制剂。因此，中药提取纯化辅料的应用在中药制造中是十分重要的。
在本书的第四章中，我们讲述了中药提纯辅料和提取方法以及中药纯化辅料和纯化方法。本部分要讲述的主要内容是根据中药所含有效成分的不同类别，采用不同的提取辅料和提取方法以及不同的纯化辅料和纯化方法，将其有效地结合起来，以达到中药提取纯化有效成分或有效部位的最优化，借此阐明中药提取纯化辅料在中药制造中的应用。提纯辅料应用的总原则，首先应根据中药所含有效成分的类别，理化性质和相似相溶的原理，选择适宜的溶剂和提取方法，必要时加入浸出辅助剂，尽可能将有效成分最大限度地提取出来，同时尽可能减少杂质成分。所得提取液，应根据所含有效成分的类别和理化性质、欲制剂的剂型（口服、外用、注射等）以及纯度要求（有效成分、有效部位和一般提取物），选择适宜的分离纯化辅料和分离纯化方法，如水沉法、醇沉法、溶剂萃取法、澄清剂澄清法，吸附过滤法，色谱支持剂及相应的色谱分离法，膜分离法等，进行有效的分离纯化，以获得理想的提取物，为下步的制剂制造打下坚实的基础。
煎煮法即将原料加水煎煮取汁的方法。将原料适当地切碎或粉碎，置适宜煎煮器中，加适量水浸没原料，充分浸泡后加热至沸，保持微沸浸出一定时间，一般煎煮2～3次。分离并收集各次煎出液，经离心分离或沉淀过滤后，浓缩至规定浓度。若以乙醇作为浸出溶剂时，应采用回流提取法以免乙醇损失。
浸渍法是将原料用适当的溶剂在常温或温热条件下浸泡出有效成分的一种方法。取适量粉碎后的原料，置于有盖容器中，加入适量的溶剂密盖，搅拌或振荡，浸泡至规定时间使有效成分浸出，倾取上清液、过滤、压榨残渣、合并滤液和压榨液，过滤浓缩至适宜浓度。浸渍法有冷渍和热渍之分，冷渍适用于提取遇热易被破坏的物质及含淀粉、树胶、果胶、黏液质的样品，热渍由于提高提取成分的溶解度，故提取效果较冷渍好。
浸渍法适宜于黏性的、无组织结构的、新鲜易于膨胀的原料的浸取，尤其适用于有效成分遇热易挥发或易破坏的原料，但操作时间长，浸出溶剂用量大，往往浸出效率差，不易完全浸出，若以水作溶剂则夏季易霉变。浸渍法也不适用于有效成分含量低的原料。
渗漉法是将原料粉末湿润膨胀后装于渗漉器内，浸出溶剂从渗漉器上部添加，溶剂渗过原料层往下流动过程中将成分浸出的方法。不断加入新溶剂，可以连续收集浸提液，由于原料不断与新溶剂或含有低浓度提取物的溶剂接触，始终保持一定的浓度差，浸提效果要比浸渍法高，提取也较完全，但溶剂用量大，对原料的粒度及工艺要求较高，并且可能造成堵塞而影响正常操作。
将原料粗粉或碎片浸泡润湿后，加热蒸馏或通过水蒸气蒸馏，也可在多功能提取器中边煎边蒸馏，原料中挥发成分随水蒸气蒸馏而带出，经冷凝后分层收集。该法适用于具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏、难溶或不溶于水的化学成分的提取分离。
应用有机溶剂加热提取时，必须采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失并减少有毒溶剂对实验操作者的毒害。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器，加热前先开冷凝水。装药材量为圆底烧瓶容量的1/3～1/2为宜，溶剂浸过药材表面1～2cm，实验室多采用水浴加热比较安全。第一次提取以保持沸腾回流约1小时为宜，放冷后过滤，再在药渣中添加新的溶剂，做第二次、第三次加热回流提取，分别约半小时，或通过薄层色谱检测有效成分基本提尽为止。此法提取效率较冷浸法高，但由于操作的局限性，大量生产中也少被采用，而是多采用连续提取法。
连续提取法是实验室做中药有效成分分析时，用有机溶剂提取中药常用的方法，通常用脂肪提取器或称索氏提取器来完成。这种提取法需用溶剂量较少，提取成分也比较完全，但一般需数小时（常6～8小时）才能完成，所以遇热不稳定、易变化的中药成分不宜采用此法。尽管如此，在应用挥发性有机溶剂提取中草药有效成分时，不论小型实验或大型生产，均以连续提取法为好。
超声波提取法是利用超声波增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，提高药物成分溶出速度和溶出次数，缩短提取时间的浸提方法。
超声波是一种高频率的机械波，超声场主要通过超声空化向体系提供能量。频率范围在15～60kHz的超声，常被用于过程强化和引发化学反应，超声波在中药有效成分提取等方面已有了一定的应用。其原理主要是利用超声的空化作用对细胞膜的破坏，有助于有效成分的溶出与释放，超声波使提取液不断震荡，有助于溶质扩散，同时超声波的热效应使水温基本在57℃，对原料有水浴作用。超声波提取与传统的回流提取、索氏提取法等比较，具有提取速度快、时间短、收率高、无需加热等优点，已被许多中药分析过程选为供试样处理的手段。
超声提取的频率和时间都会影响有效成分的收率。有关专家研究了不同频率超声对提取黄芩苷成分的影响，比较在相同的提取时间内，频率分别为20kHz、800kHz、1100kHz时，从中药黄芩根中提取黄芩苷成分的收率，以20kHz下收率最高，分析原因是该频率下超声空化效应强，加之粉碎化学效应，有利于有效成分溶出和释放。他们进一步研究了该频率下不同提取时间对黄芩苷提取率的影响，曲线存在极值，可能是超声时间过长，超声波对活性成分有一定的破坏作用。
超声提取能提高有效成分的收率。郭孝武等观察了超声时间和超声频率对黄芩苷提取率的影响，结果发现用20kHz的超声波提取10分钟，黄芩苷的收率都比煎煮法提取3小时高，对化合物的结构没有任何影响。毕立君等采用80%乙醇浸泡水芹，超声30分钟，连续提取2次，总黄酮的浸出率为94.6%，而用醇提法仅为73%。郭孝武等还研究了不同频率的超声对提取大黄中蒽醌类成分的影响，无需加热，频率不同，收率也不同，尤其以20kHz的频率大黄蒽醌类成分的提取率最高。超声处理10分钟，收率为95.25%，而煎煮3小时，收率仅为63.27%。另外，有关沙棘多糖、虫草多糖、香菇多糖、猴头多糖、枸杞多糖、小檗碱、益母草总碱的超声提取研究也有报道。
中草药成分大多为细胞内产物，提取时往往需要将细胞破碎，而现有的机械或化学破碎方法有时难以取得理想的效果，所以，超声破碎在中药的提取中已显示出明显的优势。超声提取避免了高温加热对有效成分的破坏，但操作时对容器壁的厚薄、放置的位置要求比较高。目前实验研究都处于小规模阶段，要用于大规模生产，还需要解决有关工程设备的放大问题。
微波是一种非电离的电磁辐射。微波辅助提取（microwave assisted extraction，MAE）是利用微波能来提高萃取率的新发展起来的技术。被提取的极性分子在微波电磁场中快速转向及定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦引起发热，可以保证能量的快速传递和充分利用，易于溶出和释放。微波辅助提取（以下简称微波提取）的研究表明，微波辐射诱导萃取技术具有选择性高、操作时间短、溶剂耗量少、有效成分收率高的特点，已被成功应用在药材的浸出、中药活性成分的提取方面。它的原理是利用磁控管所产生的每秒24.5亿次超高频率的快速震动，使药材内分子间相互碰撞、挤压，这样有利于有效成分的浸出，提取过程中，药材不凝聚，不糊化，克服了热水提取易凝聚、易糊化的缺点。
郭振库等研究了采用微波技术从黄芩中提取黄芩苷的条件，用具有压力控制附件的MSP-100D国产专用微波制样系统，在70%微波功率（微波炉的最大功率850W）下，微波最佳提取条件为35%乙醇作溶剂，溶剂倍量30，提取压力0.15MPa、恒压时间30秒即可获得好的黄芩苷提取率。微波提取法不仅所需时间短、平行性好，而且提取率比超声波提取法高近10%。王巧娥等采用微波技术研究了从甘草中提取甘草酸。微波提取的最佳条件为0.5%氨水为提取溶剂，微波功率为2000W，体系温度升至60℃后保温提取40分钟。微波萃取54分钟与索氏提取4小时、室温冷浸44.3小时的甘草酸收率相当。
微波提取要求药物有一定的含水量，提取介质的极性对提取效果影响也大。有研究者用微波辅助提取三七中的有效成分Rd 1 ，以正丁醇-水为萃取剂，考察了不同含水量对微波提取效果的影响，发现在较低含水量下提取效果随含水量增加而增加，在20%处存在极值。
微波对某些化合物有一定降解作用，微波具有热效应和非热效应，尤以热效应特别明显，水、乙醇等中药提取常用溶剂在微波作用下均升温明显，所以，微波萃取技术有一定的局限性，只适宜于对热稳定的产物。同时微波泄漏对操作者影响很大，这对微波辅助提取的研究及应用带来了一定的困难，实验用微波装置设计的好坏对能否得到有价值的结果影响甚大。
超临界流体萃取法是利用超临界状态下的流体为萃取剂，从液体或固体中萃取中药材中的有效成分并进行分离的方法。CO 2 因其本身无毒、无腐蚀、临界条件适中的特点，成为超临界流体萃取法最为常用的超临界流体（supercritical fluid，SF）。
任何一种物质都存在气相、液相和固相3种相态。3相成平衡态共存的点叫三相点。液、气两相成平衡状态的点叫临界点。在临界点时的温度和压力称为临界温度（ T c ）和临界压力（ P c ）。高于临界温度和临界压力而接近临界点的状态称为超临界状态。不同的物质其临界点所要求的压力和温度各不相同。
超临界流体（SF）是指在临界温度和临界压力以上以流体形式存在的物质，兼有气、液两者的特点，同时具有液体的高密度和气体的低黏度的双重特性。SF有很大的扩散系数，对许多化学成分有很强的溶解性。被用作超临界流体的溶剂有二氧化碳、乙烷、乙烯、丙烷、丙烯、甲醇、乙醇、水等多种物质。
目前研究较多、最常用的超临界流体是二氧化碳，因其具有无毒、无臭、无味、不燃烧、化学性质稳定、不易与溶质反应、临界点低（ T c =31.26℃， P c =7.2MPa），临界条件容易达到、纯度高、价廉、易获得、易与溶质分离、使用安全等优点，成为中草药超临界萃取中一种较理想和使用较普遍的溶剂。在超临界状态下，CO 2 流体兼有气液两相的双重特点，既具有与气体相当的高扩散系数和低黏度，又具有与液体相近的密度和良好的溶解能力。其密度对温度和压力变化十分敏感，且与溶解能力在一定压力范围内成比例，所以，可通过控制温度和压力改变物质的溶解度。
超临界流体萃取分离过程的实现是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。当气体处于超临界状态时，成为性质介于液体和气体之间的一种特殊的单一相态的超临界流体（SF）。SF具有十分独特的物理化学性质，具有和液体相近的密度，黏度只是气体的几倍，但远低于液体，扩散系数比液体大100倍左右，因此更有利于传质，对物料有较好的渗透性和较强的溶解能力，能够将物料中某些成分提取出来。
SF具有选择性溶解物质的能力，并且这种能力随超临界条件（温度、压力）的变化而变化。在超临界状态下，将SF与待分离的物质接触，使其有选择性地溶解其中的某些组分。SF的密度和介电常数随着密闭体系压力的增加而增加，因此利用程序升压可将不同极性的成分进行分步提取。当然，对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以通过控制条件得到最佳比例的混合成分。临界点附近温度、压力的微小变化，都会引起CO 2 密度显著变化，从而引起待萃取物的溶解度发生变化。因此，可通过控制温度或压力的方法达到萃取目的，然后通过减压、升温或吸附的方法使超临界流体变成普通气体，让被萃取物质分离析出，从而达到分离提纯的目的，这就是超临界流体萃取的基本原理。这种化工分离的手段被称为超临界流体萃取。
超临界流体萃取（supercritical fluid extraction，SFE）的压力、温度、流体比、CO 2 流量、操作时间、物料粉碎的粒度、夹带剂等条件的变化，皆会影响中药有效成分的提取质量。因此，具体操作时，这些因素都需要摸索。
压力是影响SFE中最重要的参数。温度不变，随着压力的增加，流体密度会显著增加，对溶质的溶解能力也就增大，萃取效率提高。但是压力也不可以无限制增加，过高的压力会使生产成本明显提高，而萃取率的增加却有限。
温度也是影响SFE很重要的参数。随着温度的增加，流体的扩散能力加强，对溶质的溶解能力也相应增大，有利于萃取。但温度的增加使杂质的溶解度也增加，增加精制过程的难度，从而会降低产品的收率。同时，温度增加，使得CO 2 流体的密度降低，对溶质的溶解力会有所下降，产品收率会降低。
流体含量的增加，可以提高溶质在溶液中的溶解度，因此，萃取率随着流体比的增加而增加。
产品的萃取收率随物料粒度的减小而上升。粒度越小，与流体接触的总表面积越大，溶质与流体接触的机会越多，萃取收率越高。萃取操作的时间缩短。但粒度太小，其他的杂质成分也容易溶出，会影响产品的质量。
萃取时间的延长，有利于流体与溶质间的溶解平衡，使萃取收率提高。但当萃取达到一定时间后，随着溶质的减少，再增加萃取的时间，萃取收率就增加缓慢，能耗增加厉害，使成本增加。同时，时间过长，杂质溶出也增加，直接影响产品的质量。
CO 2 -SF的极性与正己烷相似，适宜萃取脂溶性成分，对于极性较大成分的萃取，一般需要加入少量极性溶剂，如甲醇、乙醇、氨水等，作为夹带剂，以改善萃取的效果。
1.CO 2 作为目前最常用的萃取剂，具有以下特点。
（1）CO 2 临界温度为31.26℃、临界压力为7.2MPa，临界条件容易达到，易于操作。
（2）CO 2 化学性质稳定，无色、无味、无毒，安全性好。
（3）价廉，纯度高，容易获得。
2.超临界CO 2 对不同溶质的溶解能力差别很大，与溶质的极性、沸点和分子质量密切相关，一般来说有以下规律。
（1）亲脂性、低沸点成分容易萃取，可在低压萃取（10Pa），如挥发油、烃、酯等。
（2）化合物的极性基团越多，就越难萃取。
（3）化合物的分子质量越高，越难萃取。
3.适宜于热敏性成分 操作温度低，并在密闭系统内进行，可以有效地防止热敏性成分的分解和易氧化物质的氧化，完整保留生物活性，而且能把高沸点、低挥发度、易热解的物质在其沸点温度以下萃取出来，解决用一般蒸馏方法分离热敏性成分时遇到的分解、结焦、聚合等难题。
4.能耗低 传统的溶剂萃取工艺必须回收溶剂，为此需要大量热能，可只有5%得到有效利用。与此相反，（CO 2 -SF）与萃取物分离后，只要重新压缩就可循环利用，因此耗能大大降低，节约成本。
5.工艺流程简单 压力和温度是调节萃取过程的重要参数。压力固定，改变温度可将物质分离；反之温度固定，降低压力使萃取物分离；因此工艺流程短、耗时少。几乎不产生新的三废，对环境无污染，真正实现生产过程绿色化。
6.无溶剂残留 超临界CO 2 流体常态下是气体，无毒，与萃取成分分离后，完全没有溶剂的残留，有效地避免了传统提取条件下溶剂毒性的残留。同时也防止了提取过程对人体的毒害和对环境的污染。
7.极性选择范围较广 流体的极性可以改变，一定温度条件下，只要改变压力或加入适宜的夹带剂即可提取不同极性的物质，可选择范围广。
目前，中药领域SFE技术的研究开发应用虽有报道，但缺乏系统性，大多只停留在单味中药有效成分或中间原料提取方面，这仅仅是用于中药的一个方面。中药的研究与开发具有特殊性，即必须具有药理临床效果，因此，SFE技术用于中药必须结合药理临床研究。只有工艺优越，药理临床效果有保证或更好，SFE技术在该领域的生命力或潜力才能真正体现。另外，我国应用历史悠久的古方、秘方、验方中的一些中成药复方，鲜有SFE技术研究报道。我们认为如果结合药理药效，采用SFE技术研究中成药、复方、验方的有效部位，进行二次开发，可能会有重要意义。
中草药的细胞壁是由纤维素构成的，其中的有效成分往往是包裹在细胞壁内，酶法就是利用纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等（主要是纤维素酶），破坏植物的细胞壁，以利于有效成分最大限度溶出的一种方法。这是一项很有前途的新技术，在国内，上海中药一厂首先应用酶法成功制备了生脉饮口服液。
有些固体物质受热后会直接汽化，遇冷后又凝固为原来的固体化合物，此现象称之为升华。中草药中有一些成分就具有升华的性质，故可采用升华法直接提取。例如从樟木中提取樟脑（camphor），是世界上最早应用升华法从中药材中提取的有效成分，这在《本草纲目》中有详细的记载。茶叶中的咖啡因在温度达到178℃以上也能升华而不被分解，所以，提取咖啡因时也常用升华法。另外，有些生物碱类、香豆素类、有机酸类成分，也具有升华的性质，例如苦马豆素、七叶内酯及苯甲酸等。
升华法虽然简单易行，但在实际提取时很少采用。因为升华所需要的温度较高，中草药容易炭化，炭化后产生的挥发性焦油状物容易黏附在升华物上，不易精制除去；其次，升华不完全，产率低，有时还伴随有分解现象。
某些中药中的有效成分含量较高且存在于植物的液汁中时，可将新鲜原料直接压榨，压出汁液，再进行提取。如从香料植物中提取精油时，可采用本法，如芸香科（Rutaceae）的植物中精油含量高，多存在于果皮中，大多采用本法抽取精油，如橙皮油、柠檬油等多采用本法榨取。
溶剂提取的效果主要取决于选择合适的溶剂和提取方法。此外，原料的粉碎度、提取温度、浓度差、提取时间、操作压力、原料与溶剂的相对运动等因素也不同程度地影响提取效果。
原料经粉碎后粒度变小，表面能增加，浸出速度加快，但粉碎度过高，样品粉粒表面积过大，吸附作用增强，反而影响扩散速度，并不利于浸出，许多不溶性高分子物质微粒进入浸出液中给过滤造成困难。样品过细在渗漉过程中易堵塞，渗漉法浸提时，原料粒度过细造成溶剂流经原料层的空隙过小，造成溶剂流动阻力大，影响传质。一般而言，粒度以20～60目为适。
温度升高可增大可溶性成分的溶解度、扩散系数。扩散速度加快有利于浸提，并且温度适当升高，可使原料中的蛋白质凝固、酶破坏而增加浸提液的稳定性。但温度过高会破坏不耐热的成分，并且导致浸提液的品质劣变。提取的杂质含量增高，给后道精制工序带来困难，一般浸出温度控制在60～100℃。
浓度差是原料组织内的浓度与外周溶液的浓度差异。浓度差越大，扩散推动力越大，越有利于提高浸出效率。当内外浓度达到平衡时，扩散停止，成分不再浸出。在浸出过程中不断搅拌、更换新溶剂或采取流动溶剂的渗漉法，可以增大扩散层中有效成分的浓度差，提高浸提效果。
原料中的成分随提取时间延长，提取收率增加，但时间过长，杂质成分溶解也随之增加，给后续提纯精制造成困难，一般而言，热提1～3小时，乙醇加热回流提取1～2小时。
此外，对于一些组织坚实的原料，浸出溶剂较难浸润时，往往施加一定的压力。增大压力虽对扩散速度没有影响，但在压力作用下使某些原料组织内细胞壁破坏，有利于有效成分的溶解。近年来，超声波、电磁场、电磁振动、脉冲技术等应用于浸提工艺中获得了良好效果。
沉淀分离是在溶液中加入溶剂或沉淀剂，通过化学反应或者改变溶液的pH、温度、压力等条件，使分离物以固相物质形式析出沉淀的一种方法。能否将分离物从溶液中析出，取决于分离物的溶解度或溶度积，关键在于选择适当的沉淀剂和控制条件。沉淀的目的在于通过沉淀使目标成分达到浓缩和去除杂质的目的，或是将已纯化的产品由液态变成固态。在应用沉淀分离技术时，需要考虑3种因素：
1.沉淀的方法和技术应具有一定的选择性，才能使目标成分得到较好分离，纯度较高。
2.对于一些活性物质（如酶、蛋白质等）的沉淀分离，必须考虑沉淀方法对目标成分的活性和化学结构是否破坏。
3.对于食品和医药原料中的目标成分的沉淀分离，必须充分估量残留物对人体的危害。
根据沉淀剂和沉淀条件的不同，沉淀分离方法大致有以下几种。
溶剂沉淀是在有机化合物（如蛋白质、酶、多糖、核酸等）水溶液中加入有机溶剂（如乙醇、丙酮等）后，显著降低待分离物质的溶解度，从而将其沉淀析出的一种方法。其机制在于溶质（待分离物质）在溶液中化学势发生变化造成溶解度的下降。其优点在于选择性好、分辨率高，因为一种有机化合物往往只能在某一溶剂狭窄的浓度范围内沉淀，溶剂易除去、易回收，但条件控制不当容易使待分离物质（如蛋白质）变性。影响溶剂沉淀的操作条件有以下几点。
合适的溶剂是溶剂沉淀的关键，溶剂必须是能与水相相溶的有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙醚、石油醚、二甲亚砜、乙烷、四氢呋喃等。其中乙醇最为常用，它能沉淀蛋白质、核酸、核苷酸、多糖、果胶和氨基酸等化合物，且安全性最高。同时，不同的有机化合物沉淀所需要的溶剂浓度有不同要求，使用不同浓度的同一种溶剂，往往可以在混合溶液中起到分级沉淀的效果。
对于蛋白质样品溶液的沉淀分离，如果样品浓度低一些，可以减少蛋白质之间的相互作用，防止共沉淀现象，但易引起蛋白变性。另一方面，如果样品浓度高一些，可以减少蛋白变性，有机溶剂的使用量也可减少，但控制不当易出现共沉淀现象，一般而言，控制蛋白质起始浓度为5～30mg/ml。
对蛋白质溶液进行溶剂沉淀分离，一般在低温条件下进行，大多数酶和蛋白质的溶解度随温度降低而降低，可以利用温度差进行蛋白质分级沉淀。如果温度过高，将促使蛋白质的分子结构松散，使得溶剂分子与一些氨基酸残基产生疏水性结合而引起蛋白质的不可逆变性。
蛋白质溶液中的溶质溶解度受pH影响，一般在等电点的溶解度最低。将pH调节到溶液中多数蛋白质带有相同的净电荷，可减少蛋白质之间的相互作用，防止共沉淀。改变溶液的pH可实现有选择的分段沉淀，另外，pH离子强度有协同作用而改变蛋白质的溶解度。
低浓度的中性盐类影响蛋白质在有机溶剂中的溶解度，并且对蛋白质具有保护作用，防止变性。要将蛋白质从低离子强度的溶液中沉淀出来往往需要更高的溶剂浓度。
在较低浓度的盐溶液中，酶和蛋白质的溶解度随盐浓度升高而增大，这称之为盐溶。当盐浓度增大至一定程度后，酶和蛋白质的溶解度又开始下降直至沉淀析出，这称之为盐析。其原理在于中性盐离子对蛋白质分子表面活性基团及水活度的影响结果。蛋白质类化合物的盐析沉淀手段通常有两种：一种是在固定蛋白质溶液的值与温度的前提下，添加盐来调节溶液离子强度以达到沉淀蛋白质的目的。此法常用于蛋白质粗制品的分级沉淀和酶制剂的制备等。另一种是在一定的离子强度下，调节溶液的pH或温度以达到沉淀蛋白质的目的，此法适用于蛋白质的提纯精制以及饱和结晶等。
盐析沉淀条件中，中性盐的合理选择至关重要。根据离子促变序列，多价盐类的盐析效果比单价的效果好；阴离子的盐析效果比阳离子的好。顺序大致如下：枸橼酸根>酒石酸根>PO 4 3- >F - >IO 4 2- >SO 4 2- >CH 3 COO - >B 2 O 3 - >Cl - >ClO 3 - >Br - >NO 3 - >ClO 4 - >I - >SCN - ；Th 4+ >A1 3+ >H + >Ba 2+ >Sr 2+ >Ca 2+ ；Mg 2+ >Cs + >Pb + >NH 4 + >K + >Na + >Li + 。
在蛋白质溶液中，一般以硫酸铵、硫酸钠应用最广。选择中性盐时注意添加盐的纯度，避免杂质带来干扰或对蛋白质的毒害。使用带金属离子的盐类时，可考虑添加一定量的金属螯合剂如EDTA（乙二胺四乙酸）等。
蛋白质或酶等物质经盐析沉淀分离后，产品夹带盐分，需脱盐处理。常用的脱盐处理方法有透析法、超滤法、电渗析法和葡聚糖凝胶过滤法等。
影响盐析效果的因素有蛋白质的浓度，盐类离子类型、离子浓度，pH，温度等。
添加某种化合物与溶液中的待分离物质生成难溶性的复合物，从而使其从溶液中沉淀析出的方法，称为沉淀剂沉淀，添加的化合物称为沉淀剂。沉淀剂沉淀分离主要有金属离子沉淀法、酸类及阴离子沉淀法、非离子型聚合物沉淀法以及均相沉淀法等。
蛋白质在碱性溶液中带负电，金属离子与蛋白质中的—COOH、—OH、—NH 2 、—SH等基团反应生成难溶性的复合盐而析出，根据金属离子与蛋白质的相互作用关系，将金属离子分成以下3类。
（1）与羧基、氨基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的金属离子有：Mn 2+ 、Fe 2+ 、Co 2+ 、Ni 2+ 、Cu 2+ 、Zn 2+ 和Cd 2+ 等。
（2）与羧酸结合而不与含氮化合物结合的金属离子有：Ca 2+ 、Pb 2+ 和Ba 2+ 等。
（3）与巯基化合物强烈结合的金属离子有：Hg 2+ 、Ag + 和Pb 2+ 等。
金属离子沉淀分离效果除与金属离子的种类、蛋白质的性质、离子化程度以及相互结合的位置等因素有关外，沉淀的复合物溶解度还与溶液的介电常数相关，介电常数减小则溶解度降低。一般而言，金属离子浓度调节在0.02mol/L左右。浓度过高，易引起共沉淀，并且产生的静电力可能影响蛋白质的二、三、四级空间结构，引起蛋白质变性。复合物中金属离子的去除，可通入H 2 S形成硫化物去除或添加螯合剂EDTA。
金属离子沉淀法：常有共沉淀现象和吸附作用，同时有一些金属盐的溶解度相对比较大，因此分离效果受到影响。实践中一般用作初步分离，并且通常是与其他分离方法配合使用。
一些含氮的有机酸如苦酮酸和鞣酸等能与有机分子的碱性基团反应生成难溶性的盐复合物析出，但这种盐复合物沉淀往往属于不可逆反应，引起蛋白质发生变性。因此，需要采取预防蛋白质变性的措施，如采用温和的反应条件，并加入一定量的稳定剂［如维生素C（抗坏血酸）等］。
许多无机杂多酸能与氨基酸、蛋白质作用形成盐类复合物沉淀，如磷钨酸、硼钨酸、硅钨酸以及磷、砷、硅的钼酸或钒酸等。反应过量的这些无机杂多酸可在无机盐溶液中由乙醚萃取出来。
一些非离子型多聚物〔如聚乙二醇、壬苯乙烯化氧、葡聚糖和右旋糖酐硫酸钠等）作为沉淀剂，能将溶液的一些有机物质沉淀分离出来，如蛋白质、酶、核酸、细菌、病毒等。
非离子型聚合物沉淀法操作条件温和，不易引起生物分子的变性，少量的沉淀剂就能沉淀大量的生物大分子物质，并且沉淀后的多聚物容易除去。
聚乙二醇（PEG）是应用较多的水溶性的非离子型多聚物，多用于沉淀蛋白质，其沉淀效果除与溶液的离子强度、pH、温度及蛋白质浓度等因素有关之外，还与沉淀剂本身的分子量及浓度有关，一般而言，聚乙二醇浓度与溶液的离子强度成反比。当pH越接近蛋白质等电点，所需PEG浓度也越低。同时在一定范围内，PEG的分子量越大，沉淀效果越好。
直接将沉淀剂加入溶液中，容易出现局部浓度过度，产生的沉淀物过于细小或者结构疏松、大小不一，易吸附杂质影响纯度，而借助于化学反应使溶液中缓慢而均匀地产生沉淀剂以获得较纯净的晶型或非晶型沉淀，这就是均相沉淀法。实现均相沉淀通常有以下手段。
（1）在溶液中加入能产生沉淀剂的化学试剂，使得通过化学反应均匀产生出沉淀剂。
（2）利用某种试剂的水解反应使溶液的pH发生变化，使pH达到一定值时就会生成沉淀。
（3）将溶液与沉淀剂在某种能与水混溶的溶剂中混合，再缓慢蒸去溶剂，使之在缓冲条件下实现均相沉淀。
另外，属于沉淀分离方法的还有等电点沉淀法、变性沉淀法和絮凝沉淀法等。等电点沉淀法主要是利用两性电解质分子在电中性时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点而进行分离的一种方法。如蛋白质、酶以及氨基酸等两性电解质，当其整体电荷为中性时，溶解度最小，控制不同的等电点，就能将不同的电解质分离。
是利用生物大分子（如蛋白质）在变性后溶解度降低而从溶液中沉淀析出，当然轻度变性的蛋白质不一定沉淀出来。变性后蛋白质能恢复原来结构与功能的过程称为可逆变性，反之称为不可逆变性。引起蛋白质变性的因素包括温度、pH以及其他的化学因素，能引起蛋白质变性的化学试剂有甲酸、醋酸、二氯醋酸、三氯醋酸等酸类；甲醇、乙醇、甘油等醇类；甲酰胺、 N -甲基乙酰胺等酰胺类；以及二脲、盐酸胍、氯仿、酚等，还有表面活性剂如十二烷基磺酸钠（SDS）等，另外，一些酶也会使蛋白质变性。
是在悬浮或胶体溶液中加入絮凝剂，使之与胶体或悬浮液中的微粒产生絮状物沉淀，有无机絮凝剂和有机絮凝剂之分。无机絮凝剂常用的有铝盐（如明矾、三氯化铝、硫酸铝、聚合氯化铝）、铁盐，如三氯化铁、硫酸亚铁、聚合硫酸铁等、有机絮凝剂都是高分子化合物，如聚丙烯酰胺（PAM）等。
许多无机杂多酸能与氨基酸、蛋白质作用形成盐类复合物沉淀，如磷钨酸、硼钨酸、硅钨酸以及磷、砷、硅的钼酸或钒酸等。反应过量的这些无机杂多酸可在无机盐溶液中由乙醚萃取出来。
一些非离子型多聚物〔如聚乙二醇、壬苯乙烯化氧、葡聚糖和右旋糖酐硫酸钠等）作为沉淀剂，能将溶液的一些有机物质沉淀分离出来，如蛋白质、酶、核酸、细菌、病毒等。
非离子型聚合物沉淀法操作条件温和，不易引起生物分子的变性，少量的沉淀剂就能沉淀大量的生物大分子物质，并且沉淀后的多聚物容易除去。
聚乙二醇（PEG）是应用较多的水溶性非离子型多聚物，多用于沉淀蛋白质，其沉淀效果除与溶液的离子强度、pH、温度及蛋白质浓度等因素有关之外，还与沉淀剂本身的分子量及浓度有关，一般而言，聚乙二醇浓度与溶液的离子强度成反比。当pH越接近蛋白质等电点，所需PEG浓度也越低。同时在一定范围内，PEG的分子量越大，沉淀效果越好。
两相溶剂萃取法是利用混合物中各种成分在两种互不相溶（或微溶）的溶剂相中分配系数的差异而达到分离目的的方法。
该法是实验室中常用的一种简便萃取技术，适用于分配系数差异较大的成分的分离，一般萃取3～4次即可。若亲水性成分易转入有机溶剂层，需增加萃取次数或更换萃取溶剂。少量萃取一般在分液漏斗中进行；中量萃取可在较大的下口瓶中进行；工业生产中的大量萃取，多在密闭萃取缸内进行。
萃取剂的选择：需根据被萃取化合物的性质而定。
如果从水提液中萃取亲脂性成分，一般选用氯仿或乙醚等亲脂性有机溶剂；如果从水提液中萃取中等极性成分，一般用乙酸乙酯、丁醇等弱亲脂性有机溶剂或在氯仿、乙醚中加入适量乙醇以增大其亲水性。应注意的是，有机溶剂的亲水性越大，与水做两相萃取的效果就越差。
例如分离某有机溶剂中酸性强弱不等的黄酮苷元，可依次选用pH由低到高的碱液如5%碳酸氢钠、5%碳酸钠、0.2%氢氧化钠、4%氢氧化钠的水溶液作萃取剂进行萃取，使成盐而达分离目的。又如分离碱性强弱不同的游离生物碱，可用pH由高至低的酸性缓冲溶液作萃取剂顺次萃取，使碱性由强到弱的生物碱分别萃取出来。
萃取溶剂第一次用量一般为水提液的1/3～1/2，以后的用量可适当减少为水提液的1/6～1/4。应遵循少量多次的原则，因为量相同的溶剂，分次萃取的效率要比一次萃取的效率高。
浓度最好在相对密度1.1～1.2之间，过稀则萃取剂用量太大，过浓则两相不易充分接触，影响萃取效率。
由于天然药物中含有表面活性剂（如皂苷、蛋白质、多种植物胶质、鞣质等），或存在少量轻质的沉淀、互溶、两液相密度相差较小和振摇等因素促使了乳状液的形成，从而使相不能清晰地分开。这时可采用旋转混合、改用氯仿-乙醚混合溶剂萃取或加大有机溶剂量等措施尽量避免乳化现象的发生。若乳化现形成，破坏乳化的方法有：①较长时间放置；②轻度乳化可用一金属丝在乳化层中搅动使之破坏；③将乳化层抽滤；④将乳化层加热或冷冻；⑤分出乳化层（有时乳化层就是所需要的成分），再用新溶剂萃取；⑥若因两种溶剂能部分互溶而发生乳化，可加入少量电解质（如氯化钠），利用盐析作用加以破坏，在两相相对密度相差很小时，也可加食盐增加水相的密度；⑦滴加数滴表面活性更强的低级醇类如乙醇、戊醇，把原来的表面活性物质顶替，达到破乳目的。
逆流连续萃取法是利用两种互不相溶的溶剂相对密度的不同，以相对密度小的溶剂相作为移动相（或分散相），相对密度大的溶剂相作为固定相（或连续相），使移动相逆流连续穿过固定相，借以交换溶质而达到分离的一种连续萃取技术。
装置由一根或数根萃取管组成（萃取管的数目可根据分配效率的需要来决定），管内用小瓷环或小的不锈钢丝圈填充，以增加液-液萃取时的接触面积。
将相对密度小的溶剂相作为移动相置高位贮存器中，而相对密度大者则作为固定相置萃取管内。例如，用氯仿从水提液中萃取脂溶性成分时，可将相对密度大的氯仿作为固定相盛于萃取管内，而将相对密度小于氯仿的水提取液贮于高位容器内，开启活塞，则高位贮存器中溶剂相在高位压力下流入萃取管，由于增加液滴上升的路程和在固定相中停留的时间，而且上升的液滴因遇瓷圈撞击分散成细滴，扩大了两相溶剂萃取的接触面积，增大了萃取接触面积，两相溶剂在萃取管内可自然分层。最后，判断萃取是否完全，可取试样用色谱、显色反应或沉淀反应等进行检査。
逆流连续萃取法操作简便，萃取较完全，适合各种密度的溶剂萃取。此法克服了简单萃取法操作的麻烦，避免了乳化现象的发生。
以分配定律为基础，混合物经仪器操作，在两相溶剂系统中进行反复多次的振摇、静置、分离、转移等萃取步骤，使分配系数不同的成分达到分离的一种新型分离方法。CCD法又称为逆流分配法、逆流分布法或反流分布法。
较少的转移次数就能达到分离目的，可在分液漏斗内进行操作；如需行多次液体转移时，多采用逆流分溶仪。
在多个分液漏斗中装入相对密度小的固定相，然后在0号漏斗中加入相对密度大的流动相，振摇使充分混合，静置分层后，分出流动相移入1号漏斗，并在0号漏斗中重新补加新鲜的流动相，分别充分振摇混合。重复上述操作反复多次，混合物中各成分即在两相溶剂相对做逆流移动，由于它们在两相溶剂中的分配系数不同而不断进行分配，经多次转移后，每一成分都应在某一管中有自己的最高浓度，从而达到分离目的。
（1）操作技术是影响分离效果的重要因素：
①操作前需将选定的两相充分振摇，使之充分混合后，放置，待两相溶剂完全分层后使用；②混合物的浓度不宜过高，因为在稀溶液中其分配系数比较稳定，易达到分离效果；③操作多采用两相溶剂等体积的方式进行；④分离操作通常可取试样（每管中两溶剂相的液体），用薄层色谱或纸色谱等方法，根据各管内两溶剂相中含有成分的情况合并相同部分。
（2）溶剂系统的选择：
两相溶剂系统的选择直接影响分离效果。适宜的系统需满足：①两相溶剂不相混溶；②混合物中各单一成分在溶剂系统分配系数差别较大；③含有溶质的两相溶剂加入混合物后能很快地分散乳化。常用的溶剂有烷烃、苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、丁醇、乙醇、水、乙酸、无机酸、缓冲液等。缓冲液是分离酸性、碱性或两性化合物的良好溶剂。
CCD法具有很强的分离混合物各组分的能力，特别适合于分离中等极性及不稳定的物质，甚至对一些用色谱法不能分离的高分子、多肽、蛋白质等都已进行成功分离。但此法不适于分离微量成分、极性过大或过小，或分配系数受温度或浓度影响过大及易于产生乳化现象的溶剂系。CCD法是一种高效率、多次、连续的两相溶剂萃取分离方法，具有条件温和、试样易于回收等优点，但操作较烦琐，消耗溶剂多，在大体积混合物中的微量成分易损失，而且反复多次振动溶剂系统易产生乳化现象。
液滴逆流分配法（droplet counter current chromatography，DCCC）又称逆流色谱法，是在逆流分溶法的基础上改进的两相溶剂萃取法。其原理在于逆流分溶法，利用混合物中各成分在两液相间分配系数的差异，让移动相以液滴的形式通过固定相的液柱，实现逆流分配，从而达到分离纯化的目的。
目前应用的液滴逆流分配装置由3部分组成。
（1）输液部分：
包括微型泵、移动相溶剂储槽和试样液注入器。
（2）萃取部分：
由300～500根内径约2mm、长度为20～40cm的萃取管连接而成。
（3）收集检出部分：
包括检出器及分步自动收集仪。
（1）操作时，首先将选择好的两相溶剂中的固定相全部充入萃取管内，然后将待分离的样品溶于两相溶剂（1∶1）中，并从加样口注入，再由微型泵注入移动相，移动相在萃取管中形成液滴，固定相在液滴和管壁间形成薄膜与液面接触，移动相与固定相不断地进行有效接触、摩擦形成新表面，促使溶质在两相溶剂中实现充分的分配，获得很好的分离效果。为避免被分离物质的氧化，在实际操作中可采用氮气驱动流动相。最后从萃取管中流出的移动相通过检出器进行分部收集，完成液滴逆流分配的全过程。
（2）影响液滴逆流分配的主要因素包括溶剂因素、送液速度、输液管口径，因为这些直接影响了能否形成大小适宜的移动相液滴及液滴间的间隔，从而影响分离效果。
（3）溶剂系统的选择与逆流分配法基本相同，但要求能在短时间内分离成两相，并能生成有效的溶液。
目前DCCC法已广泛用于皂苷、生物碱、酸性成分、蛋白质、糖类等天然产物的分离与精制，特别适用于皂苷类的分离，并取得良好的效果。如用氮气驱动移动相，此法还可用于易被氧化物质的分离。
此法使用溶剂较少，可定量回收试样，因不需振荡，故不会产生乳化现象，分离效果较CCD法好。
结晶法是分离纯化固体成分的重要方法之一，通常情况下大多数天然药物化学成分在常温下是固体物质，具有结晶的通性。若物质能够形成结晶，则代表其纯度达到了相当程度。获得结晶并制备成单体纯品，是鉴定中药有效成分、研究其分子结构的重要一步。结晶分离纯化法中溶剂的选用十分重要。
结晶与重结晶法是利用不同温度可引起物质溶解度改变的性质来分离混合物中的不同成分。不是结晶状态的固体物质处理成结晶状态的操作称为结晶。此时，形成的晶体一般还含有较多的杂质。不纯的结晶进一步精制成纯的结晶的过程称为重结晶。
选择合适的溶剂是结晶法的关键。
①不与被提纯的成分发生化学反应；②对被提纯成分的溶解度随温度不同有显著差异，热时溶解度大，冷时溶解度小；③对可能存在的杂质无论冷热，溶解度都很大或很小（冷热都能溶的杂质，在降温时被提纯的物质析出结晶后，仍留在母液中；冷热都不溶的杂质，可趁热过滤以除去）；④溶剂的沸点不宜过高或过低（过高时，附着于晶体表面的溶剂不易除去；过低时则溶解度冷热时变化不大，不利于析晶）；⑤能给出较好的结晶；⑥无毒或毒性小。
要找到合适的溶剂，一方面可査阅有关资料及参阅同类型化合物的结晶条件，另一方面也可进行一些探索，参考相似相溶的规律加以考虑。但所选溶剂的沸点应低于化合物的熔点，以免在进行热溶解时化合物分解变质（若不能选择沸点较低的溶剂，则应在比熔点低的温度下进行热溶解，以免得到混入溶剂的结晶）。常用的结晶溶剂有甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯等。若无资料可査，且不清楚被提纯物的溶解性能，需通过小量试验来摸索。取少量试样（约0.1g）置小试管中，用滴管逐滴加入溶剂，观察试样冷热时的溶解情况。若试样在1ml冷的溶剂中全部溶解或大部分溶解，则此溶剂的溶解度太大，不适宜作结晶溶剂；若试样不溶或大部分不溶，但加热至沸腾（沸点低于100℃的，则应水浴加热）时完全溶解，冷却，析出大量结晶，这种溶剂一般认为可用；若样品不全溶于1ml沸腾的溶剂中时，则可逐次添加溶剂，每次约加0.5ml，并加热至沸腾。若加入的溶剂总量达3～4ml时，样品在沸腾的溶剂中仍不溶解，表示这种溶剂不适用；反之，若样品能溶解在3～4ml沸腾的溶剂中，则将它冷却，观察有无结晶析出，还可用玻璃棒摩擦试管壁或用冰水冷却，以促使结晶析出。若仍未析出结晶，则这种溶剂也不适用；若有结晶析出，则以结晶析出的多少来选择溶剂。按照上述方法逐一试验不同的溶剂，将试验结果加以比较，从中选择最佳的溶剂。
当选择不到适当的单一溶剂时，可选用两种或两种以上溶剂组成的混合溶剂，要求低沸点溶剂对被提纯物的溶解度大，高沸点溶剂对被提纯物的溶解度小，这样在放置时，沸点低的溶剂较易挥发，比例逐渐减少，易达到过饱和状态，利于结晶的形成。选择溶剂的沸点不宜太高，要适中，可在60℃左右。沸点太低溶剂损耗大，亦难以控制；太高则不便浓缩，同时不易除去。一般常用的混合溶剂有乙醇-水、醋酸-水、丙酮-水、吡啶-水、乙醚-甲醇、乙醚-丙酮、乙醚-石油醚、苯-石油醚等。
可参照结晶所选用的溶剂，但若形成粗结晶后溶解度有所改变，则所选溶剂也相应有所不同。
通常将需结晶物质置于锥形瓶中，加入较需要量略少的溶剂，于水浴上加热至微沸。为了避免溶剂挥发及安全操作，应在装置中接上冷凝管。若未完全溶解，可逐步添加溶剂，直至所需结晶物质刚好完全溶解（要注意判断是否有不溶性杂质，以免误加过多溶剂），趁热过滤，静置，冷却析晶。然后采用减压抽滤，把结晶从母液中分离出来。晶体需用少量溶剂洗涤，以除去存在于结晶表面的母液。洗涤时，宜暂停抽气，用刮刀小心拨动，使所有晶体润湿，略静置后再行抽气。母液适当浓缩放置，又可得到一部分纯度较低的晶体。上述得到的结晶仍为粗晶，仍含有杂质，需反复进行重结晶后才可得到较纯晶体。若所得粗结晶尚含有多种成分，可用分步结晶的方法使各成分分步析出。将粗晶用适当溶剂溶解，滤过，放置析出晶体后，立即抽滤得第一批结晶；母液浓缩放置，可得第二批结晶；抽滤后再浓缩母液，经反复处理后得数批结晶。各部分结晶经过检査，相同物质可合并，最后再经多次重结晶以获得较纯的晶体。
1.趁热过滤得到的滤液应长时间静置，逐渐冷却，避免温度骤降使析晶过快而带出杂质。
2.若滤液久置仍无结晶析出，可采取的方法有：松动瓶塞，使溶剂自动挥发，可望得到结晶；或加入少量晶种（同种分子），诱导晶核形成使结晶立即增长；或用玻璃棒摩擦玻璃容器内壁，产生微小颗粒代替晶核，以诱导方式形成结晶；或用玻璃棒蘸取过饱和液，在空气中使之挥发除去部分溶剂后，再摩擦玻璃器壁；或用少许干冰或置于冰箱以降低结晶温度；或加可溶性盐类盐析。
3.因杂质的存在会阻碍结晶的形成，可通过选择适当的溶剂，或用活性炭除去有色杂质，或采用氧化铝、硅胶、硅藻土等吸附色谱法使杂质尽可能除去。
4.有些化合物本身不易结晶，可将其制备成结晶性衍生物。如生物碱可制成盐，有机酸制成钾、钠、钙、铵盐，羟基化合物制成乙酰化衍生物或苯甲酰衍生物，羰基化合物可以制成脎或腙类化合物等。分离后，再用化学方法处理使其恢复成原来化合物。
通常可依据结晶外观的色泽是否均匀、晶形一致程度和是否具有一定的熔点和较小的熔距，并结合薄层色谱或纸色谱技术，经数种不同展开系统展开是否均能得到单一近圆形的斑点来判断结晶的纯度。必要时可制备衍生物，采用高效薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱来进一步确定结晶的纯度。
色谱法按流动相分类，流动相为溶液者称为液相色谱法，流动相为气体者为气相色谱法。按固定相（色谱支持）分类，使用什么支持剂就称什么色谱法，如使用活性炭作支持剂则称为活性炭色谱法，使用氧化铝作支持剂则称为氧化铝色谱法，使用聚酰胺作支持剂则称为聚酰胺色谱法，如此等等。根据各组分在固定相中的作用原理不同，又可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱等。根据载体及操作条件的不同，又可分为纸色谱、薄层色谱、柱色谱、高效液相色谱、气相色谱等。鉴于纸色谱、薄层色谱、气相色谱主要用于分析测试，本书不予介绍。本书重点介绍柱色谱和制备高效液相色谱。
吸附色谱是选用吸附剂作支持剂，利用吸附剂对中药混合物中各种成分吸附能力的差异，从而使混合物中各成分得以分离的色谱方法。
吸附剂对被分离成分的吸附能力越强，被分离成分吸附得越牢固，在色谱中移动的速度就越慢，反之移动就快。所给的吸附剂和展开剂固定时，吸附力的大小主要取决于被分离成分的性质，成分的极性越大，被吸附得越牢固，展开的速度就慢，反之展开的速度快，据此可把极性不同的一系列化合物分离、展开或洗脱。
吸附剂的吸附作用主要由固体表面的作用力、氢键络合、静电引力、范德华力等产生，吸附剂对各成分吸附能力的大小主要取决于吸附剂本身的结构和性质、被吸附成分的结构和性质以及展开剂的极性大小。
吸附色谱有3个基本构成要素，它们是被分离成分、吸附剂（固定相）及展开剂（流动相或称洗脱剂）。
（1）被分离成分：使用亲水性吸附剂时，被分离成分极性大者吸附牢固，解吸附就困难，色谱中展开或洗脱的速度慢；反之，吸附能力弱，解吸附就容易。
化合物极性大小判断原则一般如下：分子中母核相同，极性基团越多，极性越大；分子中双键、共轭双键越多，极性越大；同系物中，分子量越小，极性越大；在同一母核中不能形成分子内氢键的化合物比能形成分子内氢键的化合物极性大。
常见的取代基极性大小比较如下：烷基（—CH 3 ）<烯基（—CH＝CH—）<醚基（—OCH 3 ）<硝基（—NO 2 ）<二甲氨基［—N（CH 3 ） 2 ］<酯基（—COOR）<酮基（—CO）<醛基（—CHO）<巯基（—SH）<氨基（—NH 2 ）<酰胺基（—NH—COCH 3 ）<羟基（R—OH）<酚羟基（Ar—OH）<羧基（—COOH）。
（2）吸附剂：是指能吸附中药有效成分或有效部位、并不与展开剂和被吸附成分起化学反应、在展开剂中不溶解的固体物质，即固定相。
（3）展开剂：是指色谱展开用的溶剂，一般需要重蒸馏或经过其他方法纯化处理，以除去干扰色谱微量杂质，是一种溶剂或两种及两种以上的溶剂组成的溶剂系统。主要作用是解吸附，在柱色谱中通常称为洗脱剂。
溶解吸附能力的大小与选择展开剂的极性和被分离成分的极性大小有关。一般来说，当选用常用的硅胶或氧化铝这类亲水性吸附剂时，展开剂的极性若顺应被分离成分的极性，解吸附能力就强，否则就弱。即被分离成分的极性大，展开剂的极性也要大，根据相似相溶的原理，这样成分才能随着展开剂移动而展开分离；反之，分离极性小的成分就要选择极性小的展开剂。
吸附色谱工艺分为薄层色谱和柱色谱。薄层色谱适用于分离小样，主要用于分离中药标准物质或用于中药有效成分的鉴别，请参考有关书籍，这里不详述。
柱色谱：适用于中药生产中分离大样，主要用于大规格分离中药有效成分或有效部位。
柱子为底部有嘴塞，在圆弧处有滤板，直径大小不等，长度（或称高度）各异，直径与长度比一般为1∶12～1∶18，柱子由玻璃、玻璃钢、工程塑料或不锈钢制成。
首先将吸附剂装入柱中，一般装入柱容积的70%～80%，吸附剂装柱分为干法装柱和湿法装柱。干法装柱是直接用漏斗将吸附剂均匀装入柱内；湿法装柱是将吸附剂用漏斗装入盛有洗脱剂的柱内，或将吸附剂与洗脱剂混合装入柱内。装柱时吸附剂应均匀和紧密，洗脱剂应保持一定液面。洗脱剂的选用可通过薄层色谱筛选，一般TLC展开时 R f 值为0.2～0.3的溶剂系统是最佳的洗脱系统，采用梯度洗脱法洗脱；收集洗脱液，每份收集量大概与所用吸附剂的量相当；用薄层色谱或纸色谱做定性检查，合并同一组溶液。柱色谱分离能力比薄层色谱更强，分离效果更佳。
（1）性质：
色谱硅胶为一多孔性物质，可用通式SiO 2 · x H 2 O表示。它具有多孔性的硅氧环（siloxane）的交键结构，由于其骨架表面具有很多游离（Ⅰ）、键合（Ⅱ）和键合-活性状态（Ⅲ）的硅醇基（silanol）基团，能够通过氢键与极性或不饱和分子相互作用，同时能吸附多量的水分。当加热活化（100～110℃）时，硅胶表面因氢键所吸附的水分能可逆地被除去。但温度高至500℃时，硅胶表面的硅醇基进一步脱水缩合转变为硅氧烷键，即硅氧环表面（a）及稠合环氧环烷化（b），从而丧失了因氢键吸附水分的活性，不再具有吸附剂的性质。若用水处理亦不能恢复其吸附活性，加热至1100℃时则结合水尽失。由于硅胶的吸附能力与硅羟基数量有关，因此活化时不宜在较高温度下进行，一般在170℃以上即有少量结合水除去。硅胶的吸附性能取决于硅胶中硅羟基的数目，其次是含水量，随着水分的增加而降低。若吸水量超过12%，吸附力极弱，不能用作吸附色谱，只可用作分配色谱的载体。硅胶的表面积、表面结构、微孔体积及微孔半径均直接影响着色谱分离的效果。另一方面因它具有弱的非特性吸附，能同样吸附极性、非极性饱和与不饱和分子，所以硅胶具有吸附色谱与分配色谱的双重性。同时硅胶又是一种弱酸，其表面的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，解离常数为10 -6 ～10 -8 ，是一种弱酸性阳离子交换剂，当遇到较强的碱性化合物时，可因离子交换作用而吸附碱性化合物。
硅胶表面的硅羟基能与各种醇如氰乙醇、正辛醇、聚乙二醇在一定温度下加热脱水后生成单分子键合固定相（Si—O—C型），与十八烷基三氯硅烷生成烷基化学键合相（—Si—O—Si—C型）。另外用SOCl 2 将硅胶表面氯化，与各种有机胺反应生成具有Si—O—Si≡N键的各种不同极性基团的化学键合相，这大大有助于提高分离选择，在液相色谱中占有极为重要的地位，并普遍用于高效液相色谱。
色谱硅胶应为中性无色颗粒，由于制备过程中接触强酸，常带有酸性，故在使用前应检查其水浸液的酸度，pH不低于5时才可使用。否则应用水洗到中性，再在110℃活化24小时。在特殊情况下，硅胶须用盐酸及氯仿等有机溶剂预洗，除去其中所含的铁离子及有机脂溶性杂质。硅胶在甲醇、水等强极性溶剂中有一定的溶解性，约为0.01%，当溶液pH>9则溶解度急剧上升，此点在选择溶剂时应注意，否则会将流分中溶解的硅胶误认为植物成分。
硅胶色谱有时可以加入一种复合试剂，以改良吸附性能，提高分离效果。通常用硝酸银处理硅胶对不饱和烃类有极好的分离作用。改良吸附剂制备一般用1%～10%复合试剂的水或丙酮溶液，与硅胶混匀，待稍干后于100℃条件下干燥即可。
硅胶色谱适用范围广，既能用于非极性化合物也能用于极性化合物，如用芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心苷、蒽醌类、酸性或酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸以及一系列合成产物的分离等。
（2）色谱柱的制备与加样：
硅胶装柱一般用湿法，即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌，待柱中溶剂气泡除去后，连同溶剂一起倾入色谱柱中，色谱柱中硅胶段直径与长度之比一般为1∶（20～30）。若硅胶的颗粒较细，且粒度分布范围窄，则可采用短柱（1∶5），这样不仅增大了截面积，而且也增加了样品的载量。硅胶最好一次倾入，否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一，使硅胶柱有明显的分段现象，影响分离效果。亦可采用干法装柱，将所需硅胶一次倾入柱中，然后墩紧至硅胶高度不改变为止。欲分离样品与吸附剂的比例为1∶（30～60），若作为分配色谱时比例应加大，主要根据分离物质的难易来确定。
当采用分配色谱时，应先将预先选定的固定相溶剂如水、缓冲液或极性溶剂加入硅胶中，一般比例为1∶（0.5～1）较为适中，搅拌混合均匀，倾入预先选定的流动相溶剂中并激烈搅拌，使两相互相饱和达到平衡。色谱柱中事先放入用固定相溶剂剧烈振摇饱和后的流动相，将上述吸附着固定相的硅胶按湿法装柱，不断轻敲管壁，使其均匀紧密。另外亦可采用加硅胶于固定相饱和的流动相中，按湿法装柱，然后用固定相饱和的流动相通过硅胶柱，使其达到色谱稳定时的平衡条件。
样品上柱可采取两种方式，如样品能溶于流动相，可用少量流动相溶解，从柱顶加入，尽可能保留加样色带狭窄，再行展开；如样品难溶于流动相，则可将其溶于适当的溶剂，拌于干燥硅胶上，待溶剂挥发后，加适量的流动相拌匀再上柱，并在上面覆盖一薄层纯净的砂，然后用流动相展开。
（3）色谱溶剂的选择：
色谱过程中溶剂的选择，对组分分离关系极大。一般没有可循的规律，通常是根据物质的极性，采用相应的极性溶剂来洗脱。在实际吸附色谱中是采用从低极性逐步递增极性的梯度洗脱方式，溶剂的洗脱力随介电常数增高而增大。往往借助于硅胶薄层色谱的结果来摸索分离条件，基本上可以用于柱色谱。两者不同之处在于样品与硅胶的用量比例，通常柱色谱所用的溶剂比薄层色谱展开剂极性略偏小。再者可参阅前人分离同类型物质时所用的溶剂系统条件。如采用分配色谱可先用纸色谱方法探索分离条件。
（4）硅胶的再生：
硅胶的再生一般可用乙醇或甲醇洗涤，除去溶剂，烘干、活化处理后即可使用，必要时用0.5%氢氧化钠水溶液浸泡洗涤，过滤，水洗，再以5%～10%盐酸浸泡洗涤，后用蒸馏水洗至中性，在110℃时活化、过筛即可。
氧化铝是最常用的吸附剂之一，是由氢氧化铝直接在高温下（约600℃）脱水制得，主要形成r晶格（或x晶格）。由于制造关系常带有微碱性，对于分离植物中的碱性成分如生物碱颇为理想，但不宜用于醛、酮、酯和内酯等类型酸性化合物的分离，因为碱性铝可与上述成分发生化学反应，如发生异构化、氧化和消除反应等。除去氧化铝中的碱性杂质可用水洗氧化铝至中性，再活化可得中性氧化铝。若用5%醋酸溶液甚至用5%盐酸浸泡处理，再用水洗到弱酸性或中性，此时氧化铝颗粒表面带有阴离子，具有离子交换剂的性质并可避免由于碱性引起的副反应。目前除了生物碱等碱性物质外，很少用氧化铝色谱，基本上被硅胶色谱所取代，但硅胶对杂质的吸附能力较差，样品处理量相应地比氧化铝低。
（1）氧化铝的活性及活性测定：
氧化铝的活性与含水量有关，一般在200℃左右加温4～6小时活化，除去其中水分，即得Ⅰ-Ⅱ级氧化铝；若要降低活性，可加入一定量的水。活化时氧化铝表面的氧能与水分子结合形成羟基，具有离子交换性质，但温度不宜过高（>400℃），否则会引起氧化铝晶格的改变，形成不可逆的吸附力下降，而不能供色谱用。通常色谱用氧化铝宜用Ⅲ级，吸附性过高使吸附的选择性能差，有时亦可加适量醋酸来降低活性。
活性测定通常用柱层法、板层法及毛细管法3种。柱层法是分别吸取10ml，每种含0.04%（质量/体积）染料混合液［石油醚（沸点60～90℃）∶苯=4∶1，体积比］于内5cm高待测氧化铝柱［1.5×（10～15）cm］的顶端，然后用20ml相同的混合溶剂冲洗展开，观察色带在氧化铝柱中的位置来判断活性。
板层法是预先分别称取对甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红Ⅲ、对氨基偶氮苯等各20mg及偶氮苯30mg溶于四氯化碳（经氢氧化钾干燥）中。取玻璃板，将待测氧化铝按一般方法铺在板上，然后将颜料溶液按薄层色谱点样方法点在色谱点样线上，以氢氧化钾干燥过的四氯化碳展开至10cm处立即取出，观察各颜料的位置。测得各种颜料的比移值（ R f ）。本法对高活性氧化铝其结果偏低。
毛细管法通常用来测定氧化铝及硅胶的活性。先分别配制0.02%～0.05%的对氨基偶氮苯及对二甲氨基偶氮苯的苯溶液，前者供测定氧化铝活性用，后者供测定硅胶活性用，另取内径为3mm，长为105～110mm的细玻璃管，一端用棉花塞住，使空玻璃管长100mm，玻璃管的另一端套上有小孔的塑料瓶塞，通过它将吸附剂装入。另取一蘸有上述颜料溶剂的毛细管，将颜料溶液滴在玻璃管中棉花上，然后放入小试管，以苯展开，当溶剂上升到顶端时取出。观察颜料色带在细玻璃管内的位置即比移值。
（2）色谱洗脱用的溶剂：
吸附在氧化铝上物质的洗脱能力与氧化铝活性、被吸附物质的性质、温度及溶剂的性质有关。就溶剂而言，如同硅胶色谱，极性溶剂的洗脱能力较非极性溶剂大，所以逐步递增溶剂的极性，可使吸附在氧化铝柱上的不同化合物依极性大小依次洗脱，达到分离的目的。在实际操作中主要根据薄层色谱的展开情况来判断。
（3）氧化铝的再生：
使用后的氧化铝可先弃去柱顶端加样部位，然后倾倒入烧杯中，用甲醇、稀乙酸、稀氢氧化钠溶液和水依次洗涤，再经高温（200℃）活化以后，可重复使用。
活性炭色谱是分离水溶性物质的主要方法之一。对植物中的某些苷类、糖类及氨基成分具有一定的分离效果。由于它来源容易，价格便宜，因此适用于大量制备性分离。
活性炭一般分为动物炭、植物炭和矿物（煤）炭3种，分别采用动物的骨头、木屑、煤屑高温炭化而成。目前市售的医药用活性炭及色谱用活性炭多以木屑作原料，加氧化锌700～800℃高温下炭化、活化，经适当处理除去杂质而制成。通常呈粉末状或颗粒状、粉末状活性炭颗粒极细，吸附力强，流速慢，色谱过程中需要加压或减压操作，否则难以达到理想的流速。因此色谱用活性炭通常是颗粒状，虽然总表面积减少，但流速易于控制。
活性炭的吸附作用在水溶液中最强，在有机溶剂中较弱，故用有机溶剂脱吸附。例如以乙醇-水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加，有时亦用稀甲醇、稀丙酮、稀醋酸溶液洗脱。活性炭对芳香化合物的吸附力大于脂肪族化合物；对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物；对极性基团（如—COOH，—NH 2 OH等）多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物。因此可以利用这些吸附性能的差别，将水溶性芳香族化合物与脂肪族化合物、氨基酸与肽、单糖与多糖分开。使用前先应将活性炭于120℃加热4～5小时，使所吸附的气体除去。使用过的活性炭可用稀酸、稀碱交替处理，然后水洗，加热活化。有时将粉末状活性炭制成颗粒状锦纶活性炭（1∶2）或与硅藻土（1∶1）混合后装柱，以增加流速，但颗粒状活性炭吸附性能要比粉末状活性炭低。
聚酰胺（polyamide）是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化合物，分子中含有丰富的酰胺基，可与酚类、酸类、醌类、硝基等化合物以氢键形式结合而被吸附，与不能形成氢键的化合物分离，化合物分子中酚羟基数目越多，则吸附力越强。芳香核、共轭双键多的吸附力也大，易形成分子内氢键的化合物，会使化合物的吸附力减少。从聚酰胺柱上洗脱被吸附的化合物是通过一种溶剂分子取代酚性化合物来完成的，也就是说以一种新的氢键代替原有氢键的脱吸附而完成的。通常脱吸附剂（洗脱剂）是在水中递增甲醇或乙醇的含量。如黄酮体苷元与苷的分离，当用稀醇作洗脱剂时，黄酮体苷比其苷元先洗脱下来；而非极性溶剂洗脱其结果恰恰相反，即黄酮体苷元比苷先洗脱下来，这表明聚酰胺具有“双重色谱”的性能，因聚酰胺分子中既有非极性的脂肪键，又有极性的酰胺基团。当用含水极性溶剂为流动相时，聚酰胺作为极性固定相，其色谱行为类似反相分配色谱，所以黄酮体苷比苷元容易洗脱。当用非极性氯仿-甲醇为流动相时，聚酰胺则作为极性固定相，其色谱行为类似正相分配色谱，所以苷元比其苷容易洗脱。故聚酰胺色谱除了上述化合物外，亦可用于分离萜类、甾体、生物碱及糖类。
色谱中常用的聚酰胺是由己内酰胺聚合成的尼龙-6及由己二酸与己二胺聚合而成的尼龙-66。既亲水又亲脂，性能比较好。可分离水溶性物质，又可分离脂溶性物质。它可溶于浓盐酸、甲酸，微溶于醋酸、苯酚等溶剂，不溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿和苯等常用有机溶剂，对碱较稳定，对酸的稳定性较差，尤其是无机酸，在温度高时更敏感。
制备柱时是将颗粒状聚酰胺混悬于水中湿法装柱，在用非极性溶剂系统色谱时，则用组分中低极性的溶剂装柱。样品一般每100ml乙聚酰胺可上样1.5～2.5g，实际上样比例视具体情况而定。样品先用洗脱剂溶解，浓度为20%～30%。若不溶解于洗脱剂，可选用易挥发的有机溶剂溶解，拌入干粉中后将溶剂减压蒸去，湿法装入柱顶。洗脱剂常采用水，递增乙醇至浓乙醇液或氯仿、氯仿-甲醇，递增甲醇至纯甲醇。若仍有物质未洗脱下来，可采用稀氨水或稀甲酰胺溶液洗脱，分段收集。使用过的聚酰胺一般用5%NaOH洗涤，然后水洗，再用10%乙酸液洗，最后用蒸馏水洗至中性。
聚酰胺薄膜色谱是检出上述化合物的重要手段，它是将聚酰胺溶于甲酸中涂布在涤纶片基上所制成的膜片，待甲酸挥发干燥后即可使用，可用作聚酰胺柱色谱探索分离条件，又可检查色谱各流分的成分和纯度。聚酰胺薄膜色谱常用溶剂系统见表8-1。
表8-1 聚酰胺薄膜色谱常用溶剂系统
若在各种溶剂系统中加入少量酸或碱，可克服色谱中“拖尾”现象，使斑点清晰。
分配色谱是以吸附剂或无吸附作用的中性纤维素粉末作色谱支持剂，是利用分配原理，即混合物中各成分在固定相（s）和移动相（m）之间分配系数（ K ）的差异使混合物中各成分得以分离的色谱方法。
分配系数为在一定的温度和压力下，溶质在两相间分配达到平衡时，溶质在固定相和移动相之间分配的浓度的比值。
式（8-1）中， C s 为某成分在固定相中的分配浓度； C m 为某成分在流动相中的分配浓度。
混合物中某成分在两相间的分配系数越大，说明该成分在固定相中的分配浓度越大；反之，在两相间的分配系数越小，则该成分在固定相中的分配浓度越小。分离效果主要取决于分配系数的差异，一般来说，分配系数相差越大，成分越容易分离。
按工艺可分为纸色谱、分配薄层色谱和分配柱色谱。按相的选择极性不同分为正相色谱和反相色谱。正相色谱是指固定相极性大于流动相极性的分配色谱，在正相色谱中极性小的成分先被展开或洗脱；反相色谱是指固定相极性小于流动相极性的分配色谱，在反相色谱中极性大的成分先被展开或洗脱。分配纸色谱和分配薄层色谱：只适用于有效成分的小量分离，仅用于分离制备有效成分标准品以及有效成分的鉴别，不能用于中药的大生产。
分配柱色谱是利用混合物在互不相溶的两相中分配系数不同而将混合物分离开。将作为固定相的溶剂吸附于某种惰性固体物质的表面，这些惰性物质主要起到支持这种溶剂的作用，称为支持剂，而溶剂就叫固定液相。通常作为固定相的都是极性大的溶剂，如水、缓冲溶液、甲醇、甲酰胺、丙二醇、甘油等。将吸有固定液的支持剂装入色谱柱中，加上欲分离的混合物，用与固定液相不相溶的溶剂进行洗脱，这种溶剂称为流动相。流动相则常为亲脂性溶剂。混合物就在流动相和固定相之间不断进行分配，不同的物质由于分配系数的差异而在柱上得以分开。分配柱色谱所用的仪器、操作过程都与一般吸附柱色谱相同。
作为分配柱色谱的支持剂需要具备以下条件：①中性多孔粉末，无吸附作用，不溶于色谱的溶剂系统；②能吸附尽量大的固定相，流动相能自由通过。通常用的支持剂有硅胶、硅藻土、纤维素粉等。
按是否加压分为常压柱色谱和加压柱色谱，根据对流动相（洗脱剂）加压从小到大的顺序可分为快速色谱、低压液相色谱、中压液相色谱和高压液相色谱；按相相极性不同分为正相分配柱色谱和反相分配柱色谱。
反相分配柱色谱是用亲脂性溶剂作固定相，极性溶剂作流动相的分配方法，因和上述两相系统的极性相反，故称反相分配色谱或逆相分配。硅胶、硅藻土、纤维素都是亲水性的物质，一般的亲脂性有机溶剂不易被牢固地吸附于其表面。在反相分配中，通常用硅油或液状石蜡作固定相；支持剂则是将硅胶中的羟基酯化，增强它们的亲脂性。或将硅藻土加热到110℃，冷却后置于含有二氯二甲基硅烷的干燥器中，经如此处理后就可与非极性溶剂混合，而获得一牢固的固定液相。
由于这两种分配色谱的固定相和流动相的极性正好相反，所以它们的分配对象完全不同。正常的分配色谱适于亲水性物质，如生物碱、苷类、酚性物质、有机酸、糖类等，而反相分配色谱则用于亲脂性物质的分离。
大孔树脂色谱是以不同类型的大孔树脂作支持剂（固定相）的色谱法。选用不同型号和性质的大孔树脂作支持剂，可以分离纯化多种中药有效成分或有效部位。
大孔吸附树脂是一类不含离子交换基团的有机交联聚合物吸附剂，具有大孔网状结构和较大的比表面积，是一种多孔道、大孔径的高分子吸附分离材料，也是一种亲脂性物质。多为白色球状颗粒，粒度为20～60目，化学性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物有浓缩、分离作用且不受无机盐类及强离子、低分子化合物的干扰。其化学结构不带或带有不同极性的功能基。根据树脂的表面性质，可分为非极性、中极性、极性和强极性4种类型。非极性吸附树脂适宜于从极性溶剂（如水）中吸附非极性物质，极性吸附树脂适宜于从非极性溶剂中吸附极性物质，而中极性吸附树脂则对上述两种情况都具吸附力。大孔树脂规格和性能见表8-2，表8-3和表8-4。
表8-2 大孔树脂规格和性能表
续表
表8-3 国内大孔树脂规格与性能表
续表
表8-4 大孔树脂规格和性能表
大孔吸附树脂可以有效地吸附具有不同化学性质的各种类型化合物。其吸附作用是通过表面吸附、表面电性或形成氢键等，根据被吸附对象的极性和相对分子质量大小以及在不同溶剂中的溶解度差异，通过物理吸附可以大量、迅速、选择性地吸附或解吸化学成分，从水溶液中选择性地吸附有机物，达到有机化合物的分离和提纯。例如疏水性的聚苯乙烯，能将低极性有机化合物吸附，主要依靠分子中的亲脂键、偶极离子及氢键的作用，这种吸附的特点是解吸容易。当吸附过程是以亲脂键为主时，随着被吸附的分子量加大，吸附量也随着增加。吸附剂的表面积越大，吸附量越高。通常大孔吸附树脂的比表面积可达100～600m 2 /g，因此它又具有吸附容量大的特点，但对一些有机分子立体结构较大的化合物要考虑树脂的孔径，使分子能进入颗粒间隙。
大孔吸附树脂根据树脂孔径、比表面积、树脂结构、极性差异等分为许多类型，在实际生产应用中，要根据分离要求加以选择。针对不同中药有效部位选择适用的树脂并采用合理的实验设计和测定方法评价具体工艺条件，才能充分发挥大孔吸附树脂处理技术在中药提取中的作用。
大孔吸附树脂对水溶性化合物的分离有独特效果，具有选择性好、机械强度高、吸附容量大、再生处理方便、吸附迅速、解吸容易等优点，因此适用于从水溶液中分离低极性或非极性化合物，组分间极性差别越大，分离效果越好。混合组分在大孔树脂吸附后，一般依次用水、含水甲醇、乙醇或丙酮10%，20%…（体积比）洗脱，最后用醇或酮洗脱。此方法已在中药有效成分的分离和提取中被广泛应用。
大孔吸附树脂是一种不含交换基团，具有大孔结构的高分子吸附剂。其吸附性能与活性炭相似，之所以具有吸附性，与范德华力或氢键有关。树脂本身由于范德华力或氢键作用具有吸附性，又因具有网状结构和很高的比表面积，而有筛选性能。所以是一类不同于离子交换树脂的吸附和筛选性能相结合的分离材料。其具有各种不同的表面性质，例如疏水性的聚苯乙烯能将低极性的有机化合物吸附，主要依靠分子中的亲脂键、偶极离子及氢键的作用。由于是分子吸附，因而解吸容易。因此，欲分离的天然产物可依其分子体积的大小及吸附力的强弱，在一定规格的大孔吸附树脂上，以适当的溶剂洗脱而达到分离的目的。
（1）大孔吸附树脂的预处理：
大孔吸附树脂在一次试验中使用时间较长，必须保证树脂不受霉菌污染，因为市售的树脂在出厂前一般用氯化钠及硫酸钠处理过，但树脂内部存在未聚合的单体，残余的致孔剂、引发剂、分散剂等，且一般用水润湿保护，使其不致破碎及改变其内部结构（如塌孔），但暴露在空间过久易成干态。新购的树脂，用前必须去掉残余的致孔剂、引发剂、分散剂等。装柱前应将其放在烧杯中并加入足量的去离子水，使其溶胀至体积不再增加为止，以脱除树脂内残存的致孔剂及低聚物。将湿态树脂装柱后，先用水漂洗，再加入高于树脂层10cm的乙醇浸泡淋洗。洗至洗涤液在试管中用水稀释不混浊时为止，然后用水淋洗至乙醇含量小于1%或无明显乙醇气味后，即可使用。也可以将柱子进行反洗，可除去吸附于树脂内部的气体及黏着在树脂表面上的悬浮物，可冲去破碎及过小的树脂，并可将树脂颗粒按大小依次沉降（颗粒大的在柱底，小的在柱上部），这样可以减少树脂床的压差，影响吸附树脂流速。
也可在洁净的分离柱内放入已经去除杂质、体积恒定的大孔吸附树脂，再加入相当于树脂体积0.4～0.5倍的乙醇或甲醇，浸泡24小时。然后用两倍柱体积的乙醇或甲醇流过柱子，用水冲洗至流出液pH为7，再用5%盐酸、2%NaOH溶液重复以上步骤。
（2）上样：
大孔吸附树脂采用湿法上样，为保护树脂，提高分离效果，上样液应当对样品进行一定的预处理，如过滤除去干扰分离的杂质。加入样品液后，需要对柱的饱和性进行检查，可以用HPLC、TLC等手段进行检测，亦可针对试验进行简单的检查，如在用大孔吸附树脂分离大豆异黄酮的试验中，取上样后的流出液两滴，滴在白瓷板上，加入冰醋酸1滴、1%硫酸亚铁溶液1滴，如溶液为深蓝色或黑色，则表示柱已饱和，如不变色，则柱尚未饱和。
（3）洗脱
1）洗脱剂的选择：最常用的洗脱剂是水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。对非极性大孔吸附树脂，洗脱剂极性越小，洗脱力越强。对极性大孔吸附树脂和极性较大的化合物，则用极性强的溶剂才能进行更好的分离。为了达到满意的效果，可用几种不同浓度的洗脱剂洗脱，并根据分离物的极性、溶解性来确定最佳洗脱浓度，如用大孔吸附树脂分离提取赤芍总苷中的芍药苷，在大孔吸附树脂上加样后，用水洗脱至还原糖的反应呈阴性，再改用20%乙醇洗脱。
2）洗脱：洗脱剂加入树脂后，应有一段时间进行平衡，根据样品多少以及树脂能确定具体时间，洗脱时速度控制在0.5～5ml/min，对洗脱液分别进行回收，经检测后，再将相同组分合并。
3）树脂柱的再生：树脂柱经过反复使用后（一般使用3～5个周期），树脂表面或内部残留着许多非吸附性成分或吸附性杂质，使柱颜色变深，柱效降低，这时需要进行树脂的再生，可用适量5%NaOH溶液处理一次；当树脂受到严重污染时，可先用3%HCl，继用5%NaOH溶液对树脂做深度处理，或按应用工艺要求进行，可先用水或95%乙醇洗柱，而后进行大孔吸附树脂的预处理。如果有悬浮的不洁物或破碎的树脂颗粒，可以用反洗法去除，即使液体逆洗脱液方向进行冲洗。
树脂用于新药研究应考察一定内容：包括树脂型号的选择、吸附容量的考察、药材-树脂比例的考察、色谱柱的径高比考察、洗脱溶剂的考察、吸附流速和洗脱流速考察、收集洗脱液量考察、树脂的使用寿命考察以及工艺放大试验等。
（4）影响大孔树脂法分离纯化中药化学成分的因素：
大孔树脂是20世纪60年代发展起来的一类有机高聚物吸附剂，具有良好的吸附性能，近十余年来逐渐被应用于中草药化学成分的提取分离和中药新药的开发研制。它作为一项提取分离纯化的新技术，已得到了极大重视，这有利于解决中药提取分离中长期以来存在的诸多问题，可大大加快中药产业现代化发展的进程。但由于目前使用的大孔吸附树脂种类众多，型号各异，性能差异较大，对中草药化学成分的吸附分离受诸多因素影响，加之应用时间较短，目前对其性能和吸附分离规律的认识尚显粗浅。为了更好地了解、应用和规范这一新技术，作者总结了近年来有关的研究文献，对影响大孔吸附树脂吸附分离中草药化学成分的因素进行了归纳和总结。
1）被分离成分性质
A.极性：分子的极性大小直接影响分离效果。极性较大的分子一般适于在中极性的树脂上分离，极性小的分子适于在非极性树脂上分离。如用极性的S 28 树脂、弱极性的AB 28 树脂和非极性的H 107 树脂吸附分离银杏叶黄酮，S 28 与AB 28 树脂的吸附量很大，分别达126.7mg/g和102.8mg/g，而H 107 树脂只有47.7mg/g。这是由于银杏叶黄酮具有多酚结构和糖苷链，具有一定的极性和亲水性，有利于弱极性和极性树脂的吸附。
B.分子大小：有机物通过树脂的网孔扩散到树脂网孔内表面而被吸附，因此树脂吸附能力大小与分子体积密切相关。分子体积较大的化合物选择较大孔径的树脂，否则将影响到分离效果。例如，银杏总黄酮的平均相对分子质量为760，其分子体积较大，使用孔径较大的树脂S 28 （孔径为28.0～3.0nm）进行吸附，吸附量为126.7mg/g，而使用孔径较小的树脂D 4006 （孔径为6.5～7.5nm）时，吸附量仅为19.0mg/g。
2）上样溶液性质
A.溶剂对成分的溶解性：通常一种成分在某种溶剂中溶解度大，则在该溶剂中，树脂对该物质的吸附力就小，反之亦然。故在上样溶液中加入适量无机盐（如氯化钠、硫酸钠、硫酸铵等）可使树脂的吸附量加大。用D 101 型树脂吸附分离人参皂苷时，若在提取液中加入3%～5%的无机盐，不仅能加快树脂对人参皂苷的吸附速度，而且吸附容量明显增大。这是由于加入无机盐降低了人参皂苷在水中的溶解度，使人参皂苷更易被树脂吸附。
B.溶剂pH：一般而言，酸性化合物在酸性溶液中进行吸附，碱性化合物在碱性溶液中进行吸附，中性化合物可在近中性的情况下进行吸附。用D型树脂对汉防己碱等生物碱的酸水溶液进行吸附，其吸附作用很弱。将黄芩素、金丝桃苷、葛根总黄酮的碱性水溶液在D型树脂上进行吸附试验，亦有相同现象。而在中性及酸性条件下，树脂对它们的吸附力增大。用D 140 型树脂吸附分离银杏总黄酮，随pH的增加，吸附量增加，但到pH=4以后，吸附量则随pH的增加而减小，最适合的pH条件为3～4。绞股蓝总苷在碱性（pH 9～10）条件下可较好地被树脂吸附，而其他杂质成分形成较强的离子型化合物，随溶液流出，有利于绞股蓝总苷的纯化分离。
C.上样溶液浓度：树脂吸附量一般与上样溶液浓度成反比，通常以较低浓度进行吸附较为有利，如果上样溶液浓度偏高，则吸附量会显著减小。用NKA 29 树脂对绿茶浸提液中的茶多酚进行吸附分离时，随上样溶液中茶多酚浓度的增加（分别为10mg/ml，15mg/ml，20mg/ml，25mg/ml），吸附量逐渐降低（30.3mg/ml，29.4mg/ml，26.5mg/ml，24.8mg/ml）。
D.吸附流速：对于同一浓度的上样溶液，吸附流速过大，树脂的吸附量就会下降。例如，对同一浓度的银杏黄酮溶液，用D 140 树脂进行吸附，吸附流速分别为1BV/h，2BV/h，3BV/h，其吸附率分别为56.14%，53.79%和51.97%。但吸附流速过小，吸附时间就会增加，在实际应用时，应综合考虑来确定最佳吸附流速，既要使树脂的吸附效果好，又要保较高的工作效率。
3）洗脱剂性质
A.洗脱剂种类：常见的洗脱剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，在实际工作中，乙醇应用较多。可根据吸附力强弱选用不同的洗脱剂及浓度。对于非极性树脂，洗脱剂极性越小，其洗脱能力越强；对于中极性和极性树脂，则用极性较大的洗脱剂为宜。为了达到满意的效果，可设几种不同浓度的洗脱剂洗脱，以确定最佳的洗脱剂浓度。例如，用不同浓度乙醇对芍药苷进行梯度洗脱，结合HPLC检测，发现10%、20%乙醇洗脱液中均含有芍药苷，而30%以上浓度的乙醇洗脱液中未检出，故选用20%乙醇洗脱，即可将芍药苷全部洗脱下来。再如，用70%乙醇可洗脱吸附在D 101 树脂上的银杏黄酮醇苷，用30%乙醇可洗脱吸附在AB 28 树脂上的阿魏酸和川芎嗪，用70%乙醇可洗脱吸附在D 101 树脂上的葛根总黄酮。
B.洗脱剂的pH：洗脱剂的pH对其洗脱能力有显著影响。通过改变洗脱剂的pH，可使吸附物形成较强的离子化合物，很容易被洗脱下来，从而提高洗脱率。例如，黄连生物碱被树脂吸附后，若用50%、70%、100%甲醇洗脱，小檗碱的收率低，为24.31%～83.46%，若用含0.5%H 2 SO 4 的50%甲醇洗脱，则小檗碱收率可达100.03%。
C.洗脱流速：一般控制在0.5～5ml/min为宜。例如，用50%乙醇洗脱毛冬青总皂苷时，流速为1.5ml/min；用50%乙醇洗脱川乌总生物碱时，流速为3ml/min。
总之，由于大孔吸附树脂在中草药化学成分纯化分离中的应用时间还比较短，许多应用规律尚未完全清楚，而且目前该分离技术在工业化进程中还存在一些实际应用问题。例如，国产树脂型号众多，质量变化较大，无统一药用标准；刚性不强，易破碎，混入药液易造成二次污染；致孔剂等合成原料或溶剂不易去除，安全性有待评价；对于树脂预处理方法、再生条件、树脂吸附和解吸附性能判断、残留物检查等，还缺乏工艺条件研究的规范性方法和技术要求等。因此，该技术尚有许多不足和欠缺，还有待于进一步完善和规范化。
离子交换色谱是以不同酸碱性质的离子交换树脂作支持剂的色谱。有些中药成分分子中具有酸性、碱性及两性基团，在水中多呈解离状态，由此可根据解离度不同采用离子交换树脂进行色谱分离。
离子交换柱色谱（ion exchange chromatography）是以离子交换树脂为固定相，以水或含水溶剂为流动相，当上样后流动相流过交换柱时，中性分子和具有与离子交换基团相反电荷的离子将不被交换，从柱子下端随流动相一起流出，而具有与离子交换基团相同电荷的离子则被交换吸附到柱子上，用适当流动相洗脱下来，即可达到混合物分离的目的。
离子交换树脂是一种不溶、不熔的高分子化合物，外形为球形颗粒，不溶于水，但可在水中膨胀。离子交换树脂由母核部分和离子交换部分组成，母核部分是苯乙烯通过二乙烯苯交联而成的大分子网状结构，网孔大小用交联度表示（加入交联剂的百分数）。交联度越大，则网孔越小，越紧密，在水中膨胀越小；反之亦然。不同交联度适于分离不同大小的分子。离子交换基团有磺酸基（—SO 3 H）、羧基（—COOH）、氨基（—NH 2 ）等。根据交换基团的不同，分为阳离子（酸性）交换树脂和阴离子（碱性）交换树脂两种类型。
（1）阳离子（酸性）交换树脂：
含有活泼的酸性基团，能交换阳离子。根据其活性基团的解离度不同，可进一步细分为强酸型、弱酸型和中等酸型。强酸型含有强酸性离子交换基团，通式为：R—SO 3 H；中等酸型含有中等酸性离子交换基团，通式为：R—COOH，R—PO 3 H 2 ；弱酸型含有弱酸性离子交换基团，通式为：R—OH，R—SH。
（2）阴离子（碱性）交换树脂：
含有活泼的碱性基团，能交换阴离子。根据碱性强弱，可分为强碱型、弱碱型和中等碱型。强碱型含有强碱性离子交换基团—季铵基团［—N + （CH 3 ） 3 ］，通式为：R—NR 1 R 2 R 3 OH；弱碱型含有弱碱性离子交换基团——伯胺、仲胺或叔胺基团，通式为：R—NH 3 OH，R—NH 2 ROH，R—NHR 1 R 2 OH；中等碱型主体结构上既结合有强碱性离子交换基团，又结合有弱碱性离子交换基团。
亲水性离子交换剂与离子交换树脂不同，它是由葡萄糖聚合而成的大分子物质，分子中含有很多羟基，通过化学反应引入能够释放离子的基团，从而具有离子交换的性质。常见的有离子交换纤维素和离子交换葡聚糖凝胶，见表8-5。
凝胶离子交换剂既有离子交换性质，又具有凝胶的非特异性吸附，不易使蛋白、多糖等变质的优点，且有分子筛的作用，因此可用于植物蛋白、多糖和生物碱的分离。生物碱在这类阳离子交换剂上容易洗脱。用0.1mol/L稀酸水溶液或20%甲醇液即可洗出。它是分离水溶性成分的良好工具。
（1）溶液的酸碱度：
离子交换剂可以简单地理解为一种高分子不溶性酸或碱。因此溶液的酸碱度对离子交换有很大的影响。当交换溶剂中氢离子的浓度显著增高时，因同离子效应，抑制了阳离子交换剂中酸性基团的解离，故离子交换反应就很少进行，甚至不进行。通常强酸性交换剂交换液的pH应大于2，弱酸性交换剂的交换液pH应在6以上。同样在阴离子交换剂中，当溶液的pH增大时，亦会发生同样的情况，故强碱性交换剂交换液的pH应在12以下，弱碱性交换剂交换液的pH应在7以下。
表8-5 亲水基质（纤维素、葡聚糖凝胶）离子交换基类型
（2）对交换离子的选择性：
离子交换剂对交换化合物来说，主要取决于化合物解离离子的电荷、半径及酸碱性的强弱。解离常数大，酸碱性强者容易置换，但洗脱相对来说较难。解离离子价数越高，电荷越大，它的吸附性越强，越易交换在交换树脂上。碱金属、碱土金属及稀土元素还与它们的原子序数有关，前者原子序数大，则交换吸附就强，稀土元素的原子序数小，其交换吸附弱。
（3）被交换物质在溶液中的浓度：
欲交换分离的化合物，离子交换操作通常是在水溶液或含有水的极性溶剂中进行，这样有利于解离与交换。浓度低的溶液对离子交换剂的选择性大。在高浓度时解离度会趋向减少，有时会影响吸附次序及选择性；浓度过高时，亦会引起树脂表面及内部交联网孔收缩，影响离子进入网孔，所以一般实验操作时，所用的溶液的浓度应略高，有利于提取分离。
1）温度的影响：稀溶液温度的改变对交换的性能影响不大，但在0.1mol/L以上浓度时，温度升高对水合倾向大的离子容易交换吸附，同时离子的活性系数增大。对弱酸、弱碱交换剂来说，其交换率有较大的影响，一般温度增高，离子交换速度加快，在洗脱时亦可提高洗脱能力。但对不耐热的交换剂应注意提高温度的条件，避免引起交换剂的破坏。
2）溶剂的影响：通常在水中进行交换，亦可采用含水的极性溶剂。但在极性小的溶剂中难以进行交换或不进行交换，而且选择性也减少或消失。
此外对交换树脂本身来说，交联度大，结构中的网眼较小，大分子离子就不容易进入。反之交联度小，交联网孔直径大，则易于离子的扩散与交换，因此交联度的大小可以增加交换树脂对被交换物质的选择性。树脂颗粒的大小亦会影响交换速率，颗粒小，表面积大，有利于与溶液中的离子接触，增加交换速度。强酸和强碱性的交换树脂交换基团的解离能力强，则容易与溶液中的离子交换。
在离子交换树脂中，强酸型和强碱型的应用范围最广。在中药成分方面，可用于氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等的分离纯化。首先，应该先根据分离物质的电荷性质选择离子交换树脂的类型，如果待分离物质是阳离子，则选择阳离子交换树脂；如果是阴离子，则选择阴离子交换树脂。其次，根据样品分子的大小，选择合适的网孔孔径。在分离大分子的情况下，一般选用交联度小，网孔较大的离子交换树脂，而分离生物碱、有机酸、氨基酸等小分子时，则选用交联度大，网孔较小的离子交换树脂。
分离生物碱时，可用强酸型树脂，以氨水或氨性乙醇洗脱。对有机酸的分离，可将粗提液直接通过强碱型离子交换树脂。
凝胶色谱是使用不同类型的凝胶作支持剂（固定相）的色谱方法。凝胶是具有许多孔隙的网状结构的固体，有分子筛的性质。当被分离物质的分子大小不同时，它们进入到凝胶内部的能力也不同。凝胶中的孔隙大小与分子大小有相仿的数量级。当混合物通过凝胶相时，比孔隙小的分子可以自由进入凝胶内部，而比孔隙大的分子就不能进入，因此在移动速度方面就发生了差异。大分子不被迟滞而随溶液走在前面，小分子则由于向孔隙内扩散或移动得到滞留，所以落后于大分子而得到分离，此法称为凝胶色谱（gel chromatography）。
凝胶色谱分离机制可用式（8-2）表示：
式（8-2）中， V R 为洗脱体积，即保留体积（或保留容积）； V 0 为柱床内存在于凝胶外面的水相体积，称为外水体积； V i 为凝胶颗粒内部所含的水相体积，称为内水体积； k 为质量分配系数。
设 k =1，则 V R = V 0 + V i ，这说明溶质分子相当小，能自由进入凝胶颗粒内部，而且对凝胶的“内水”和“外水”亲和力相等，此时洗脱体积 V R 就等于“空隙体积”与“内水体积”之和。若 k =0，则 V R = V 0 ，说明溶质分子很大，以致完全排阻于凝胶颗粒之外，此时洗脱体积就等于“空隙体积”。在通常情况下， k 为一个常数（0< k <1），洗脱体积 V R 大于 V 0 ，小于（ V 0 + V i ），大分子首先被洗脱。如果仅按照物质分子的大小进行分离，那么 k 值应小于1。但实际情况是 k 值往往大于1，则洗脱体积就大于 V 0 + V i ，这表明凝胶不完全是惰性的，而溶质与凝胶之间具有特殊的吸附力，这种吸附力来自分子间的氢键或离子交换作用。
（1）亲水性凝胶：
目前最常用的亲水性凝胶是葡聚糖凝胶，也称交联葡聚糖凝胶，是由葡聚糖（右旋糖酐）和甘油基通过醚桥（—O—CH 2 —CHOH—CH 2 O—）相交联而成的多孔性网状结构。交联结构直接影响凝胶网状结构中孔隙的大小，交联度越大，网状结构遇水时膨胀的程度也越大。根据交联度的不同，所能分离成分分子的大小也不同，交联度可用“吸水量”或“膨胀重量”来表示。即每克干凝胶所吸收的水分质量，由这个量比较交联度，英文字母G代表葡聚糖凝胶，后面的阿拉伯数字表示凝胶的吸水量再乘以10的值，如G-25的吸水量为2.5ml/g，各种型号交联葡聚糖凝胶的性质见表8-6。
表8-6 交联葡聚糖凝胶的性质
此外还有聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺与交联剂 N ， N '-亚甲基二丙烯酰胺共聚得到，商品名称为Biogel，另琼脂糖凝胶是由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖相结合的链状多糖，商品名称为Sepharose，这些均适合于较大分子化合物的分离。
（2）疏水性凝胶：
在交联葡聚糖分子上引入一个基团增大其亲脂性，成为疏水性凝胶。譬如在Sephadex G-25上引入羟丙基基团成醚链的结合状态：R—OH→R—O—CH 2 CH 2 CH 2 OH，即葡聚糖凝胶LH-20。从而使它不仅具有亲水性能，而且可以膨胀，这就扩大了它的应用范围，适用于难溶于水的亲脂性成分及水溶性成分的分离。表8-7列举了它在不同溶剂中浸泡的膨胀体积（床体积）。
表8-7 葡聚糖凝胶LH-20在各种溶剂中浸泡的膨胀体积（床体积）
在一般情况下，欲分离分子量彼此极为悬殊的物质时，可用100～140目颗粒慢速洗脱，即可达到目的。若仅仅为了脱盐可采用Sephadex G-25，亦有用Sephadex G-10或Sephadex G-15。对相对分子质量彼此比较接近的物质，选择的颗粒则要细些，可用200目，但颗粒大小要近乎均一。柱的大小根据需要而定，为使柱装得均匀，尽量采用一次装柱，维持恒压、恒速，使冲洗液通过，沉降致密，至色谱床表面不再下降即可。色谱柱是否均匀对分离效果起决定作用。校正方法是用0.2%蓝色葡聚糖200（Blue Dextran 2000）的0.02mol/L氯化钠溶液，其平均相对分子质量为2×10 6 （200万，使用体积为0.51ml/cm 2 柱横截面）。将此染料溶液仔细地加到床表面，用0.02mol/L氯化钠溶液洗脱，在此过程中可以从蓝色区带移动的情况知道色谱床的均匀程度，并可计算出床体积，即当染料开始色谱展开时直到染料开始流出时的体积。
加样前必须用洗脱液充分平衡（3～4倍量体积），然后加样，但体积要小。通常是将样品溶于少量的洗脱液中，采用线性梯度缓冲液洗脱，可获得满意的结果，所收集的流分如果其中化合物对热不稳定可用冷冻干燥。
一般来说，使用过的凝胶不需经任何处理，只在色谱完毕后用缓冲液平衡，即可进行下一次色谱。若加样处颜色较深，可将此部分挖掉，必要时可用0.02mol/L氢氧化钠（内含0.5mol/L氯化钠）处理，再用水洗净。经常使用的凝胶以湿态保存，并加入0.02%叠氮钠（NaN 3 ）防止发霉。亦可浸泡于乙醇中脱水，再用乙醚洗涤过滤，于60℃左右干燥。
选用不同型号和性质的凝胶作支持剂的色谱法可以分离多种中药有效成分。选用亲水性凝胶作支持剂的凝胶色谱可用于分离纯化多糖类成分，选用疏水性凝胶作支持剂的凝胶色谱可用于分离纯化黄酮类、皂苷类、生物碱类、香豆素类、有机酸类等有效成分。其优点是可将相近结构的有效成分分离，可制得纯度较高的单一有效成分。