在临床输血治疗中,Rh血型系统的重要性仅次于ABO血型系统,也是人类33个红细胞血型系统中最复杂最富有多态性的一个系统,该系统抗原抗体不匹配可引起溶血性输血反应、新生儿溶血病和自身免疫性溶血性贫血。
1939年,Levine和Stetson观察到一位O型分娩死胎后大量失血的产妇,胎儿死于严重的新生儿溶血病,产妇输入O型血液后发生了严重的溶血性输血反应。Levine和Stetson据此推测产妇体内存在着与ABO血型毫不相干的其他抗体,抗体产生的原因是产妇被胎儿红细胞抗原致敏(遗传自父亲),产妇产生的抗体通过胎盘进入胎儿体内,引起胎儿红细胞溶解并导致胎儿死亡。当时,Levine和Stetson并未对此抗原命名。
其后不久,Landsteiner和Wiener用恒河猴(macacus Rhesus)红细胞免疫豚鼠(又名荷兰鼠、荷兰猪、天竺鼠)和家兔,得到的免疫血清可凝集85%白种人的红细胞,其余15%白种人的红细胞却不发生凝集。Landsteiner和Wiener认为呈阳性反应的红细胞表面所表达的抗原与恒河猴红细胞相同,并以恒河猴(Rhesus monkeys)的前两字母(Rh)对该血型抗原进行命名,有这种抗原的个体即为Rh阳性,否则为Rh阴性。在随后的血清学研究中发现,这种“抗恒河猴”血清的反应特征与前述产妇血清反应特征极其相似,所以就将该产妇的那位不幸死于新生儿溶血病的胎儿的血型命名为“Rh”血型。
实际上恒河猴抗血清所检出的抗原是LW抗原(为纪念Landsteiner和Wiener而命名),这种抗原在RhD阳性红细胞表面的数量要远远多于RhD阴性红细胞。虽然人源抗体和恒河猴抗血清都能检出类似的抗原,即RhD抗原和LW抗原,但RhD抗原和LW抗原是两种结构完全不同的抗原。
1941年,Fisher命名了Rh血型系统的C和c抗原,并用字母D和E命名了Rh血型系统的其他抗原。1943年,提出了以CDE命名的Fisher-Race命名法。该命名方法的遗传理论基础是:Rh血型有3个紧密相连的基因位点,每一位点有一对等位基因(D和d,C和c,E和e),这3个位点的基因是以复合体形式遗传。可产生8种基因组合,即CDe、cDE、cDe、CDE、Cde、cdE、cde和CdE,两条染色体上的8种基因组合可形成36种遗传型。但在实践中却发现CCDEE表型非常罕见,而CCdEE表型却从未发现。
基因检测技术现已证实,Fisher-Race命名法的遗传理论是错误的,Rh血型基因是由 RHD 和 RHCE 组成,但CDE命名方式在实践中却可很好地解释血清学试验结果,所以日常工作中Fisher-Race命名法仍被广泛应用。ISBT也推荐使用DCE命名法的表述方式,如DCcee、dccee等。需要说明的是,d抗原并不存在,它只是一个相对于D抗原的表达方式,代表RhD阴性。也有人认为应将无意义的“d”去掉,譬如“dce”改写为“ce”、“dCe”改写为“Ce”等。
1943年,RA Fisher提出Rh血型基因由3对(Cc、Dd和Ee)连锁基因组成,3对基因排列顺序为DCE(Fisher和Race,1946),随后的实验证实d抗原并不存在,因而推断d基因是一个无效基因。1990年, RH 基因的cDNA被成功克隆后,对Rh血型系统基因结构才有了更准确深入的认识。目前认为,Rh血型系统基因由 RHD 和 RHCE 基因组成。
RHD 和 RHCE 基因位于1号染色体短臂1P 34.3 -1P 36.1 , RHD 与 RHCE 基因紧密连锁高度同源,同源性高达96%~97%。 RHD 基因编码RhD抗原, RHCE 基因编码RhC/c和RhE/e抗原。RHD和RHCE基因全长分别为57295bp和57831bp,呈串联排列,方向相反,3'端面对面(5' RHD 3'-3' RHCE 5'),基因排列顺序为 RHDCE ,两个基因相隔约30kb。
RHD 和 RHCE 基因之间存在几个 Alu 重复序列、CpG岛和一个功能未知的小膜蛋白1基因( SMP1 基因)。 SMP1 基因方向与RHD基因相同,含有7个外显子, SMP1 基因与21号染色体的一个开放性阅读框架(open reading frame,ORF)序列同源,编码一种18kD的膜蛋白,该基因的功能尚不清楚,从该基因的位置推测SMP1基因多态性与特殊 RH 单体型紧密连锁,该基因的突变可能与特殊 RH 单体的选择压力有关。
在 RHD 基因的两侧分别有一个Rhesus盒子(rhesus box),大小约9000bp,这两个Rhesus box序列同源性高达98.6%。RHD基因上下游Rhesus box的方向与RHD基因相同,位于RHD基因5'端的上游Rhesus box长约9142bp,终止于距 RHD 起始密码子4900bp位置。位于 RHD 基因3'端的下游Rhesus box长约9145bp,始于 RHD 终止密码子后104bp位置。在Rhesus box的5701bp和7163bp之间有一个1463bp的等同区(identity region),仅在该区的多聚T尾有一个4bp的T插入的区别。 RHD 基因第1外显子与下游Rhesus box相距仅15bp,第7外显子3'端非编码区与 RHCE 第10外显子重叠。Rhesus box可能与 RHD 和 RHCE 基因的表达调控有关。例如,在高加索人种中,RhD阴性个体多由 RHD 基因缺失引起, RHD 基因高度序列同源的上下游Rhesus box发生不等交换(cross over),100%序列同源的903bp的断裂点区域位于上下游的等同区内,可产生一个新的杂交Rhesus box(rh box-hybrid)。Rh box-hybrid包含RHD基因上游Rhesus box的5'端和下游Rhesus box的3'端,上下游间的RHD基因完全缺失(图2-6)。
图2-6 RH 血型基因结构及 RHD 基因缺失示意图
RHD 和 RHCE 基因都有10个高度同源的外显子,最长的内含子是 RHD 基因第1内含子,长约11.8kb,最短的内含子是 RHD 基因第4内含子。 RHD 基因第1、2、8外显子以及第10外显子的编码区与 RHCE 基因相对应的外显子相同,不是 RHD 基因的特异性序列, RHD 基因第3、4、5、6、7、9外显子与RHCE基因相对应的外显子存在序列差异。 RHD 基因第10外显子比RHCE基因第10外显子大,两个基因的3'端非编码区存在序列差异。 RHCE 和 RHD 基因第4内含子大小分别为3131bp和426bp, RHD 基因第4内含子缺失2705bp。 RHD 基因第4内含子非缺失序列与对应的 RHCE 序列相比仅有3个核苷酸不同。
DNA链的断裂和连接会导致DNA片段的交换和重新组合,从而形成新的DNA分子。 RHD 和 RHCE 基因是两个紧密连锁的基因,在DNA断裂和连接的过程中 RHD 和 RHCE 基因可通过融合、重组等交换方式产生新的基因型。由于 RHD 和 RHCE 基因是尾对尾排列,因此基因的融合、重组是一种顺式配对的过程(图2-7)。 RHD 和 RHCE 基因的融合、重组可发生于细胞减数分裂期,现已发现 RHD 和 RHCE 基因的融合、重组多发生在第1外显子以外的其他各外显子之间,可以是 RHD 基因的一个外显子的部分碱基被 RHCE 基因相应外显子替代,也可以是RHD基因多个外显子被RHCE基因所替代。现已发现近40种 RHD 和 RHCE 基因的重组方式(表2-9)。此外, RHCE 基因外显子也可以被 RHD 基因所替代, RHCE - D - CE 的融合基因被认为是CcEe亚型产生的主要原因。
图2-7 RHD 和 RHCE 基因融合示意图
表2-9 RH 融合基因型
RHD 和 RHCE 融合基因是导致RH基因变异的重要原因,可形成 RHD - CE - D 或 RHCE - D - CE 杂交基因,原有外显子被邻近基因对应的外显子替换并表达替换后基因的氨基酸顺序。例如,D Ⅵ Ⅲ型第1~2外显子和第7~10外显子与 RHD 基因相应外显子序列相同,而第3~6外显子与 RHCE 基因相应外显子序列相同,其基因产物是一个“杂合”蛋白,虽然能够在红细胞膜上稳定表达,但与常见RhD抗原存在很大差异,缺乏许多RhD抗原表位。
RhD阴性人群分布具有显著的地域、种族特征。白种人中RhD阴性约为15%~17%,南部非洲黑人中约为3%~7%,亚洲人中约为1‰~4‰,中国人中约为3‰~5‰。不同地域、种族的人群产生RhD阴性的机制存在很大差异,产生RhD阴性的机制主要有以下几种。
1. RHD 基因缺失
RHD 基因缺失可分为RHD基因全缺失(gross deletion)和部分缺失(partial deletion)。 RHD 基因全缺失是指RhD阴性个体无 RHD 基因。例如,多数欧洲人及部分南非黑人中,RhD阴性个体通常由 RHD 基因的完全缺失引起,而且C/c、E/e抗原多为ce表型,是由单倍体Dce(R0)中D基因的缺失引起。约18%非洲人及54%美籍非裔Rh阴性个体属于 RHD 基因完全缺失。
RHD 基因部分缺失是指RhD阴性个体携有RHD基因,但与正常 RHD 基因相比,缺乏部分碱基序列。例如,Genbank序号为GU362076的 RHD 基因第8外显子第1080位出现10个碱基的缺失( RHD1080del10 ),导致阅读框架改变,在第8外显子第372位出现终止密码子TAG,致使蛋白质的合成提前终止。
2.RhD假基因( RHDψ )
RHDψ 是在 RHD 基因中都有一个37bp的重复序列,该序列包含第3内含子最后19个碱基和第4外显子前18个碱基,导致阅读框架移码突变,终止密码子在第6外显子提前出现(图2-8)。目前,尚无在携有RHDψ基因的RhD阴性个体中检出 RHD 基因转录本的报道。南非黑人RhD阴性个体中,约66%携有 RHD ψ ,约24%美籍非裔Rh阴性个体携有 RHDψ 。
图2-8 RHD ψ 基因结构示意图
3. RHD - CE - D 融合基因( RHD - CE - D S )
RHD - CE - D S 基因的第1、2、9、10外显子来自于 RHD 基因,第4~8外显子来自于 RHCE 基因。第3外显子可以是全部来自 RHD 基因,也可以是来自 RHD - RHCE 杂合基因。 RHD - CE - D S 基因不会产生RhD抗原,但由于 RHD - CE - D S 基因与编码c、e和VS的RHCE基因位于同一染色体上,故可产生异常的C抗原。约15%的非洲人RhD阴性个体是由 RHD - CE - D S 基因所致,美籍非裔Rh阴性个体也存在 RHD - CE - D S 基因。中国人Rh阴性个体约30%携带有 RHD 基因,其中大部分DEL型,约5%为 RHD - CE - D S 基因,其中约90%为 RHD - CE ( 2 - 9 )- D 融合基因型。
4. RHD 基因点突变
目前已发现十余种由 RHD 基因单碱基替换(single base substitution)而导致的RhD阴性表现型。例如, RHD 基因第48位碱基由鸟嘌呤突变为腺嘌呤(48G→A),导致原编码第16位色氨酸的密码子TGG变为终止密码子TGA,使RhD蛋白的合成提前终止,表现为RhD阴性。类似的单核苷酸突变还有 RHD 554G→A, RHD 270G→A等,均导致编码氨基酸的密码子变为终止密码子,使RhD蛋白的合成提前终止。
Rh抗原是由多个亚单位组成的复合体,复合体核心由2个Rh蛋白和2个Rh相关糖蛋白(Rh-associated glycoprotein,RhAG)亚单位形成的四聚体组成。辅助性蛋白(如CD47糖蛋白、LW糖蛋白、Duffy糖蛋白、血型糖蛋白B等)可通过非共价键与四聚体相连,以共分子的形式共同表达于红细胞表面。研究结果显示,每个红细胞表面约有(1~2)×10 5 个Rh抗原复合体。
Rh蛋白复合物具有维持红细胞膜完整及维持红细胞正常生理功能的重要作用(图2-9)。当Rh蛋白复合物存在缺陷时,会导致红细胞形态异常,且易引起不同程度的溶血性贫血。另外,红细胞膜上其他结构蛋白的缺陷也会引起Rh蛋白复合物表达异常并引起相关疾病。例如,Nicolas等的研究发现,锚蛋白-R存在缺陷时,Rh蛋白和RhAG蛋白的表达会明显减少。锚蛋白-R是一种膜受体蛋白,主要表达于红细胞表面,是红细胞膜相关蛋白与膜内蛋白骨架之间的连接桥梁。Rh蛋白和RhAG蛋白的C端可与锚蛋白-R的D2区相互作用,使Rh蛋白和RhAG蛋白在红细胞膜上得以表达。锚蛋白-R存在缺陷或表达不足时,会对膜蛋白骨架造成影响,引起红细胞增多症、球形红细胞增多症等病理改变。
图2-9 Rh蛋白复合物结构及功能示意图
Rh蛋白由RH基因编码合成,RHD基因编码RhD蛋白, RHCE 基因编码RHC/c和RHE/e蛋白。Rh蛋白是疏水的非糖基化的红细胞膜蛋白,RhD蛋白与RhCE蛋白结构相似,均由417个氨基酸组成。RhD蛋白与RhCE蛋白只有32~35个氨基酸的差异,差异取决于RhCE的组合,如ce、cE、Ce或CE。Rh蛋白分子量约为30kD,故Rh蛋白又称Rh30蛋白。RhD蛋白的功能与Rh蛋白家族(rhesus family proteins)中的RhBG、RhCG相同,属于氨及铵盐转运蛋白超家族(methylammonium-ammonium permease/ammonia transporters superfamily),起着转移NH 3 、CH 2 NH 2 的作用。而且RhD蛋白可能还是CO 2 的转运通道,该通道可能由Leu-58,Phe-61,Asp-201,Ser-204,Met-205,Ile-260,Ala-264和Asn-265组成。
表达于红细胞的Rh蛋白是Ⅳ型跨膜蛋白,以细胞膜为界可分为三个区:胞内区、跨膜区及胞外区。胞内区由分布在胞浆中的NH 2 端肽链和COOH端肽链组成,两条肽链分别由11及31个氨基酸组成。胞质内C末端呈α螺旋状结构,具有较强的游动性,游动幅度可达76Å 2 。Rh蛋白可贯穿红细胞膜12次,形成12个跨膜区,每个跨膜部分均由23个氨基酸组成。从C末端至跨膜螺旋区脯氨酸残基含量逐渐增加,在跨膜区内存在6个脯氨酸结构(Pro-82,Pro-140,Pro-216,Pro-229,Pro-306,Pro-327),该结构具有调节通道开关的作用。经过12次跨膜Rh蛋白可在红细胞膜外形成6个短环状结构的胞外区,环状结构的长度差异较大,分别由3~41个氨基酸组成,Rh抗原决定簇就位于这6个环状结构上。Rh蛋白的抗原性与 RHD 和 RHCE 基因的10个外显子编码的氨基酸所处位置密切相关(图2-10)。
图2-10 RH 基因编码的氨基酸在胞外区的位置示意图
以往认为通过选择性剪接或外显子跳跃机制, RHCE 基因编码的RhC/c和RhE/e多肽可表达在不同多肽链上,但近期研究否定了这种假设。利用细胞转染技术,把一条全长的RhcE转录本转染K562细胞,结果该细胞可同时表达Rhc和RhE抗原。另外,经免疫纯化的RhCc蛋白包含全长多肽链,而且至今未在红细胞表面发现RhC/c和RhE/e在不同多肽链上的蛋白结构。这些发现提示RhC/c和RhE/e抗原表达在同一条多肽链上, RHCE 基因只编码一条RhCE多肽链。
RhC/c抗原位于胞外区第2个环状结构,RhE/e抗原位于胞外区第4个环状结构。RhE与Rhe抗原的差异仅是由一个核苷酸不同导致一个氨基酸取代而造成的。RhE与Rhe抗原的差别体现在第226位氨基酸上,RhE抗原第226位氨基酸是脯氨酸(Pro),而Rhe抗原则是丙氨酸(Ala)。而RhC和Rhc抗原有6个核苷酸不同,可产生4个氨基酸取代,即16Cys→Trp、60Ile→Leu、68Leu→Asn和103Ser→Pro,其中103Ser→Pro对RhC/c抗原在红细胞上的表达具有至关重要的作用。与RhCE抗原相比,RhD抗原第103位氨基酸为丝氨酸,第226位氨基酸为丙氨酸(表2-10)。
表2-10 Rh蛋白的氨基酸差别
* :氨基酸位于细胞膜外
原来认为,虽然RhD和RhCE多肽氨基酸序列具有高度同源性,但RhCE抗原不表达任何RhD表位,RhD抗原也不表达RhCE的抗原性。2001年,Faas B.H.W等发现2个无正常Rhce抗原等位基因的白种人,其表型为DCCee。研究证实,Rhc抗原的表达由 RHD 基因控制编码,该 RHD 基因发生了2个点突变,第307位碱基发生了T→C点突变,导致103位氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸(103Ser→Pro),第329位碱基也发生了T→C点突变,导致110位氨基酸由亮氨酸变为脯氨酸(110Leu→Pro)。RhD多肽103位脯氨酸可诱导Rhc抗原的部分表达,将发生307T→C点突变的 RHD 基因cDNA转染K562细胞,K562细胞可表达Rhc抗原。这一试验结果否定了RhD蛋白不表达RhCE抗原的观念。
Rh蛋白的抗原性不仅取决于通过共价键相连的氨基酸残基的排列顺序,更重要的是取决于其空间构象。Rh多肽主链在氢键的作用下可形成有规则的卷曲、折叠等二级结构,并在此基础上通过疏水作用力进一步盘绕、折叠形成三级结构。Rh多肽的三级结构可与其他辅助蛋白分子结合,形成独特的四级空间结构,并起着决定Rh蛋白抗原性的作用。
Rh蛋白的抗原性与其空间结构密切相关,空间结构一旦发生改变,则可导致抗原性的改变或消失。例如,通过裂解红细胞膜直接分离提取Rh蛋白,会导致Rh抗原性的消失。通常情况下,由 RH 基因多态性引起的氨基酸改变位于胞外区时,大多可引起Rh蛋白免疫反应性的变化。若氨基酸的改变位于跨膜区或胞内区时,多数情况下不会影响Rh蛋白的免疫反应性。如果位于跨膜区或胞内区发生改变的氨基酸与其他分子间相互作用力发生改变,并导致Rh蛋白空间结构发生改变时,即使胞外区氨基酸顺序没有任何改变,同样也会导致Rh蛋白抗原性发生改变。例如,弱D15型 RHD 基因第6外显子第845碱基发生G→A突变,使282位氨基酸发生Gly→Asp改变。虽然此氨基酸的变化发生在胞内区,但使用RhD抗原不同表位单克隆抗体进行检测时,弱D15型血清学反应结果与正常表达的RhD存在明显差异(表2-11),说明弱D15型抗原性的变化与其空间结构的改变有关。同样的,DAR型与正常RhD相比有三个氨基酸的置换,但这三个氨基酸均不在胞外区。DⅢ及DAK型的氨基酸变化也发生在胞内区。
表2-11 弱D15型抗原表位检测结果
Rh相关糖蛋白(RhAG)由位于第6号染色体短臂(6P 11 -6P 21.1 )的 RHAG 基因编码。与 RHD 、 RHCE 基因相似, RHAG 基因同样也有10个外显子,第2~9外显子碱基序列与 RHD 、 RHCE 基因基本相同。提示 RHAG 基因与 RHD 、 RHCE 基因可能起源于共同的染色体,在遗传中突变转化为2个相互独立的基因座位。
RhAG蛋白是由409个氨基酸组成的糖基化蛋白,RhAG与RhCE、RhD蛋白的同源性分别为39.2%、38.5%。RhAG蛋白分子量约为50kD,因而又称为Rh50蛋白。RhAG和Rh蛋白相似,具有12个跨膜结构域(50%为α单环),RhAG有2个膜外糖基化位点,无酰基化位点。实验研究结果显示,RhAG糖基化只发生于胞外区第1环状结构中第37位氨基酸(Asn),该位点携有ABH抗原。Tilley等研究认为,RhAG蛋白的多态性与2个高频抗原[Duclos(RhAG1,030001)、DSLK(RhAG3,030003)]和1个稀有抗原[(Ola(RhAG2,030002)]的表达有关。与Rh蛋白相比,RhAG没有以蛋白质为基础的血型多态性。
在个体发生过程中,祖红细胞系出现RhAG抗原比RhD、RhC/c、RhE/e抗原早。对脐血CD34祖细胞进行培养,3~5天后可以检测到RhAG蛋白,5~7天后可检测到RhCcEe,9~11天后可检测到RhD。祖红细胞中RhAG抗原是不完全的糖基化抗原,相对分子量为32kD。
RhAG蛋白虽不表达Rh抗原,但却与Rh抗原的表达密切相关。RhAG蛋白与Rh蛋白相互结合,形成共分子后才可使Rh抗原得以表达,否则会对Rh抗原性产生明显影响。例如,Rh null 型Rh蛋白及其辅助蛋白并未发生改变,但 RHAG 基因突变导致RhAG蛋白不表达,引起Rh null 个体红细胞缺乏所有Rh血型抗原,导致球形红细胞增多、红细胞渗透脆性增强及溶血性贫血。
RhAG蛋白是氨及铵盐转运通道,近年来研究提示RhAG蛋白是CO 2 的转运通道,大约50%的CO 2 经此通道通过红细胞膜,其余经水通道蛋白1(AQP1)转运。也有学者推测RhAG蛋白可能是O 2 和NO的转运通道。目前Rh蛋白家族共发现有5种蛋白质分子,即RhD、RhCE、RhAG、RhBG和RhCG,分别由相应的基因编码。RhBG和RhCG不在红细胞膜上表达,但可表达于肾脏、肝脏、脑以及皮肤等器官,但RhBG和RhCG都与RhAG同源,与NH 4+ /NH 3 的细胞转运及代谢有关。
Rh辅助蛋白是指与Rh蛋白家族密切相关的其他Rh血型糖蛋白,包括LW糖蛋白、整合素-相关蛋白、血型糖蛋白B、Fy血型糖蛋白及带3蛋白等。Rh辅助蛋白通过与Rh蛋白复合物的相互结合,及与细胞膜骨架某些成分的相互作用,可起到促进Rh蛋白复合物在红细胞膜上的定位及抗原表达的作用。
LW糖蛋白是单次跨膜蛋白,由241个氨基酸组成,N端位于细胞膜外,是整合素LFA-1的配体。LW糖蛋白由位于19号染色体上的 LW 基因控制编码,可独立遗传,与Rh蛋白的遗传无关联性。LW糖蛋白在胎儿红细胞及新生儿红细胞表面均有表达,且表达量高于成人红细胞。在LW糖蛋白缺失型个体中,如LW(a-b-)型,Rh蛋白可正常表达。但研究发现,RhD阳性红细胞的LW糖蛋白表达量高于RhD阴性红细胞。1986年,Mallinson等对红细胞表面的LW糖蛋白位点数进行了测定,结果显示每个RhD阳性红细胞约有4400个LW糖蛋白位点,而RhD阴性红细胞约有2835~3620个。
整合素-相关蛋白(CD47)是由305个氨基酸组成的跨膜蛋白,可5次跨膜。编码CD47蛋白的基因位于3号染色体(3q13.1-q13.2)。CD47蛋白可与ABH抗原结合,但尚未发现以CD47为基础的血型抗原。CD47可能有抑制巨噬细胞信号调整蛋白α的作用,可起到防止红细胞被巨噬细胞清除的作用。例如,鼠类红细胞表面CD47蛋白有自身识别标志的作用,基因敲除而不表达CD47蛋白的鼠红细胞会很快被巨噬系统清除。CD47具有辅助调节Rh蛋白的作用,CD47缺失或结构异常会对Rh抗原产生影响。例如,Rh null 、D--个体,红细胞膜上CD47表达数量明显减少。
血型糖蛋白B(glycophorin B,GPB)是红细胞膜上重要的膜糖蛋白,可形成S、s抗原(属于MNSs血型系统)。GPB对维持Rh复合物的空间结构及在红细胞膜上的插入起着辅助作用,但并非必不可少。缺乏GPB的个体,红细胞表面Rh蛋白可正常表达,但RhAG的糖基化程度会增加。研究认为,GPB可与血型糖蛋白A形成杂合二聚体,在Rh蛋白复合物和带3蛋白/GPA复合物之间起到桥梁作用。
Fy糖蛋白属于Duffy血型系统,Fy糖蛋白与Rh蛋白复合物之间可能存在着相关性。例如,Fy(a-b-)型、Rh null 型个体红细胞表面缺乏Fy糖蛋白。
带3蛋白(band 3protein)是红细胞阴离子交换糖蛋白,在红细胞膜蛋白电泳中处于第3条带,故称为带3蛋白。带3蛋白是阴离子运载体,可转运HCO 3 - 、Cl - 等阴离子,所以带3蛋白又被称为“阴离子通道”。带3蛋白是由两个相同亚基组成的二聚体,每个亚基含有929个氨基酸,可跨膜12或14次,是维持红细胞膜结构稳定的重要蛋白,带3蛋白结构或含量的变化都可影响红细胞膜结构的完整。例如,带3蛋白及Rh蛋白表达量减少会导致椭圆形红细胞的形成。近期研究发现,转染带3蛋白的K562细胞Rh抗原表达增强,表明红细胞带3蛋白与Rh蛋白的表达正相关,但Rh null 型个体带3蛋白表达正常。
RhD抗原是Rh血型系统中免疫原性最强的抗原,其临床意义十分显著。RhD抗原在不同类型的红细胞表达强度差异非常明显,即使在常见表型中RhD抗原的表达数量也存在着很大差异。使用血清学方法进行检测,RhD阳性红细胞的凝集强度可表现为从很强的凝集到极弱的凝集,甚至不发生凝集。通常将凝集反应强度有别于常见RhD抗原阳性红细胞凝集强度的RhD抗原称为RhD变异型。不同RhD变异型均有其独特的分子生物学机制,并表现出抗原数量和(或)质量改变的特性。
1946年,Stratton发现大约0.2%~1%的白种人存在RhD抗原表达数量下降的现象,使用抗-D血清对其进行检测直接凝集反应为阴性,需用间接抗球蛋白法或流式细胞术等较为敏感的方法才能检出,故将这种弱反应性RhD抗原称为“D U ”型,最初发现的D U 型被证实可以稳定遗传。1955年,Ceppellini等提出,D U 型的抗原表达与 C 基因有关,是由于位于一条染色体上的 D 基因与另一条染色体上的 C 基因(C in trans)相互作用而导致的。例如DcE/dCe基因型样本与抗-D的凝集强度弱于DCe/dcE基因型。其后数十年间对D U 型的研究发现,大多数D U 型同时伴有C抗原( C 基因)阳性,而且位于同一条染色体上的C抗原(C in cis)也会与 D 基因相互作用,但具体机制尚不清楚。随着分子生物学和免疫学等学科的发展,发现D U 型实际上包含了多种不同形式的抗原,不存在单一的D U 型,也不存在单一的抗-D u 。20世纪90年代中后期,已抛弃了D u 型是一种特定型别的观念,现统称为弱D(week D)。弱D的显著特征是红细胞表面RhD抗原位点的显著性减少,但导致RhD抗原减少的原因却是多方面的。
有些学者认为弱D型与 RHD 基因的点突变有关。弱D型个体 RHD 基因碱基突变可引起跨膜区、胞内区氨基酸顺序的改变,这种改变虽不会引起RhD抗原性质的改变,但却会引起mRNA剪接和插入效率的下降,或引起RhD抗原与锚定蛋白-R(ankyrin-R)的结合效率下降甚至无法结合,导致红细胞膜上RhD抗原的表达下降或无法表达,表现出RhD多肽正常但数量减少致使血清学反应结果变弱或无反应的实验结果。现已发现70余种由碱基突变所致的弱D型(弱D1型至弱D73型),见表2-12。
也有学者认为弱D型与内含子或外显子的缺失有关。Wagner FF等发现,44个弱D表型的英国人中4人无第4内含子,90个弱D表型的德国北部人中有1人无第5外显子,在600多个弱D样本中约2.5%存在RhD结构不正常,所有弱D样本均存在外显子序列突变。
Rouillac C等认为弱D表型RhD抗原低水平表达既不是由RHD基因编码序列重排引起的,也不是由点突变引起的,而是由低水平RhD转录本引起的。
由于抗原的免疫原性不仅与抗原性质有关,还与抗原数量有关,故弱D表型患者需进行输血治疗时,血液品种的选择与红细胞上RhD抗原的数量密切相关。Wagner FF等提出一个RhD抗原密度400个/红细胞的临界值标准,并认为在白种人中RhD抗原密度大于此临界值的弱D表型患者输注RhD阳性血液是安全的,应用这个标准,97%弱D表型的白种人可输RhD阳性血。
表2-12 不同弱D型核苷酸及氨基酸的差异
续表
对献血者是否需要进行弱D和部分D的鉴定一直存在着争议。从卫生经济学的角度来讲,这些鉴定无疑会增加技术成本和人员成本。但许多报告显出,弱D表型可引起RhD阴性受者的免疫反应,故为保证输血安全应对供血者进行弱D的检测。目前检测弱D表型常用的方法是间接抗球蛋白法,但该法敏感性较低,易造成漏检,使用基因检测的方法可有效降低弱D表型的漏检。
部分D(partial D)与弱D的区别在于,部分D表达的RhD抗原与正常的RhD抗原相比不仅有数量上的差异,而且抗原性也有改变。RhD抗原包含9个表位(9表位模式)或30个表位(30表位模式),部分D缺乏一个或数个表位,可产生所缺乏D表位的抗体。部分D可分为六类,用D Ⅱ 、D Ⅲ 、D Ⅳ 、D Ⅴ 、D Ⅵ 、D Ⅶ 表示。D Ⅵ 是临床上最常见的部分D,缺乏大多数RhD抗原表位。用9表位模式表示,D Ⅵ 缺乏1、2和5~8表位。用30表位模式表示,D Ⅵ 缺乏1~4,7~22和26~29表位,大多数伴有自身抗-D的RhD阳性个体是D Ⅵ 型。D Ⅵ 可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型,每个红细胞表面RhD抗原位点数分别为500、2400、12000个,其基因型分别是 RHD - CE ( 4 , 5 )- D 、 RHD - CE ( 4 - 6 )- D 、 RHD - CE ( 3 - 6 )- D 。部分D可产生于基因转换或两次交换重组形成杂交的RHD-CE-D基因,如D Ⅲb 、D Ⅲc 、D Ⅳa 、D Ⅳb 、D Ⅴa 、D Ⅵ 、D DFR 和D DBT ,或产生于RHD基因的点突变,如D Ⅱ 、D Ⅲa 、D Ⅳa 、D Ⅶ 、D HMi 、D DNU 和D DHR 。
使用血清学方法对部分D进行检测易造成漏检,部分D红细胞能与一些抗-D试剂发生弱反应,但与另一些却不发生反应,这种现象在D抗原的分子结构被揭示前困扰了人们很多年。在DNA水平上,弱D型和部分D型很容易区分。通常情况下,如果改变的氨基酸位点出现在跨膜区或胞内区,则不会改变Rh蛋白的免疫反应性,这就是弱D型的分子机制。如果改变的氨基酸位点出现在胞外区,则可能影响到Rh蛋白的免疫反应性,导致抗原数量和性质都发生了改变,这就是部分D型的分子机制(图2-11)。
图2-11 几种主要弱D和部分D型的氨基酸改变位置
红色点表示部分D型氨基酸改变的位置,绿色点为弱D型的氨基酸改变位置。箭头所示为中国人中较常见的弱D15型氨基酸改变的位置(845G>A,G282D)
一些RhD阳性个体在接触到常见的RhD抗原后会产生抗-D,推测出现这一现象的原因在于该个体的RhD抗原缺少某个或某些D抗原表位,故可产生针对所缺少的抗原表位的抗体。分子水平的研究不仅证实了此推测的正确性,而且发现缺少的D抗原表位被RhCE抗原表位取代。基因序列的改变以及RhD多肽片段与RhCE多肽片段连接可导致Rh蛋白空间构象的改变,这些变化都会导致新抗原的产生。Rh抗原的改变多与RHD和RHCE基因单个或多个外显子的融合、重组有关,但单个核苷酸的改变同样会引起Rh抗原的改变,如D MH、D FW、DⅡ型。与单个核苷酸改变所致的弱D型不同的是,部分D改变的位置位于RhD蛋白胞外区环状结构上,这就可以解释为什么这些“RhD阳性”的个体把常见RhD抗原识别为不同的抗原。在临床输血治疗中,部分D个体只能接收RhD阴性血液,尤其是需要生育的女性和女童。
1984年,Okubo等发现有些使用直接凝集法确定为RhD阴性的个体,使用吸收放散法却可检出RhD抗原的存在,故将使用吸收放散法确定为RhD阳性的称为DEL血型(D-elution,DEL。有些杂志也用D el 或D el 表示)。
在不同地域、不同种族Rh阴性人群中,DEL型所占比例不同。亚洲人DEL型比例较高。在中国香港DEL型占30%,内地占20%~30%。在日本,DEL型占30%。研究显示,DEL型的形成受多种因素的影响,其形成的分子机制并非单一模式。
有学者认为DEL型的发生机制是RHD基因表达调控的结果。Sun等使用PCR-SSP、PCR-RFLP等方法对台湾地区230名RhD阴性献血者RHD基因第4、5、7、10外显子进行分析,发现所有DEL型个体均携有完整的RHD基因,但其RhD抗原的表达却明显下降。日本大阪血液中心对DEL型个体进行RHD基因检测,发现大部分个体携有完整的 RHD 基因,外显子均无缺失,因此推断 RHD 基因表达调控的差异可能是DEL的产生原因。
也有学者认为DEL型的产生是基因变异的结果。目前已发现的引起DEL型的基因变异主要有: RHD 1227A、 RHD M295I、 RHD IVS3+1A、 RHD IVS1+1A、 RHD X418L、 RHD IVS5-38del4、 RHD 第9外显子部分缺失等。欧洲多中心研究显示,白种人中 RHD M295I最为常见,频率约为1∶3700,其次为 RHD IVS1+1A,频率约为1∶18 000,而在亚洲人中 RHD 1227A及第9外显子部分缺失最为常见。 RHD 1227A是 RHD 1227G→A点突变,该突变是同义突变,野生型及DEL型的Rh蛋白第409位氨基酸均为赖氨酸。但研究显示,DEL型个体在mRNA水平上发生了第9外显子跳跃(exon 9skipping)的变异现象,原因在于 RHD 1227是RHD基因第9外显子最后一个核苷酸,G→A的突变可能导致RNA剪接改变,使mRNA的序列产生改变,并伴有RNA表达量的改变,最终导致RhD抗原表达量降低。另外,第9外显子跳跃可产生移码突变,使氨基酸顺序发生改变,并在C端形成一段额外的氨基酸顺序,降低了与Rh相关蛋白的结合效率和稳定性,导致RhD抗原在红细胞上表达下降。
也有学者认为DEL型是由多种cDNA拼接引起。正常 RHD 基因型的cDNA存在多种拼接方式,既有全长编码序列的拼接体,也有部分序列缺失的拼接体(常见第7外显子缺失)。DEL型的cDNA同样也有多种拼接体,但全长编码序列拼接体明显弱于正常RHD基因型,同时还有其他的拼接体(图2-12)。
有文献报道,DEL型红细胞表面RhD抗原表位的数量约为30个。也有文献报道,少数基因型为DEL/-型的个体,使用间接抗球蛋白法即可检出RhD抗原,说明红细胞表面有较多的RhD抗原,提示DEL型RhD抗原的表达数量同样存在着较大差异。此外,绝大多数DEL型个体RhC抗原为阳性,RhC抗原对RhD抗原的表达有负影响,但影响机制还有待于进一步研究。
图2-12 RHD 基因cDNA的扩增产物
1:常见RhD抗原表型样本。2:DEL型样本。a:全长cDNA序列。b:exon7缺失的cDNA序列
目前,对DEL型患者临床输血的研究主要集中在两个方面:一是能否将DEL型作为RhD阴性对待,而将DEL型血液输注给RhD阴性患者。但现已证实RhD阴性患者输用DEL型血液后,可产生抗-D或使体内抗-D效价升高,可引起输血反应。二是DEL型表达完整的RhD抗原,DEL型患者能否输注RhD阳性血液,从而避免因寻找RhD阴性血液而延误治疗。
1961年,Vos等描述了1例与所有Rh抗体都不反应的特殊样本,这个特殊样本的血型随后被R Ceppellini命名为Rh null 型。Rh null 型的特征是红细胞表面不仅缺乏所有Rh抗原,而且RhAG、CD47,LW糖蛋白、血型糖蛋白B等其他膜成分缺乏或明显减少。1987年,Dahr等发现Rh null 型红细胞血型糖蛋白B的表达水平只相当于正常水平的30%。编码RhAG蛋白的RHAG基因发生突变是导致Rh null 型的直接原因,当RHAG基因不能正常表达时,Rh多肽不能被转运到红细胞表面,无法形成跨膜结构,从而表现出Rh null 型。Rh null 型可伴有轻度Rh缺陷综合征,表现为慢性进行性溶血性贫血,口形和球形红细胞增多,红细胞渗透脆性增高,阳离子转运改变和磷脂结构不正常等。
此外,RHAG基因突变还可导致出现Rh mod 型。与Rh null 型相比,Rh mod 型红细胞表面只有微量的Rh抗原。与正常红细胞相比,Rh mod 型红细胞寿命有所下降,血清中常伴有弱抗-U、抗-S及抗-s。
D增强型是指红细胞表面RhD抗原表达明显增强,同时伴有RhC/c、RhE/e抗原缺失的RhD血型,如D--、Dc-、DCw-、D--、D••(也称Evans型)等。1965年,Rochna等使用多克隆IgG抗-D作为一抗,I 125 标记的抗-IgG作为二抗测定红细胞表面RhD抗原的数量,不同表型的单个红细胞RhD抗原表位数量如下:
Dccee( DCe / dce )型,9900~14 600个。
Dccee( Dce / dce )型,12 000~20 000个。
DccEe( DcE / dce )型,14 000~16 000个。
DCCee( DCe / DCe )型,14 500~19 300个。
vvDccEe( DCe / DcE )型,23 000~31 000个。
DccEE( DcE / DcE )型,15 800~33 300个。
Edgington及Masouredis分别于1971年和1976年使用多克隆IgG抗-D测定RhD抗原表位数,得到了相似的结果。Hughes-Jones等在1971年测定了4例D--/D--型红细胞表面的RhD抗原位点数约为110 000~202 000个。1979年测定的1例D••/D••型红细胞,得出的D抗原位点数约为56 000个。
D增强型产生的分子机制是由RHCE基因全缺失、部分缺失或被 RHD 基因取代引起,如D••型的RHCE基因第2~6外显子被RHD基因相应部分取代,使RhD抗原的表达出现量变和质变。从本质上讲,D增强型是核苷酸替代、缺失、基因融合、基因转换的结果,RHCE基因被RHD基因替代或插入后,由 RHCE 基因控制的RhC/c、RhE/e抗原无法表达或表达量下降。相应地,RHD基因控制的RhD抗原表达数量就会明显增多。
1971年,Hughes-Jones等测定了每个红细胞表面Rhc、Rhe和RhE抗原位点的数量:
c位点:cc型,70 000~85 000个。Cc型,37 000~53 000个。
e位点:ee型,18 200~24 000个。Ee型,13 400~14 500个。
E位点:450~25 600个(视抗-E的来源和表现型而定)。
1976年,Masouredis等使用不同方法测定了每个红细胞表面c、e和E抗原位点的数量,并得出不同结果:
c位点:dce/dce型,31 500个。DcE/DcE型,24 000个。
e位点:DCe/DC w E型,20 000个。
E位点:DcE/DcE型,27 500个。DcE/dce型,17 900个。
此外,1988年,Bloy等用单克隆IgG抗-c和抗-E得出了以下结果:DcE/DcE型红细胞,c位点数为32 000个,E位点数为38 000个。
在Rh血型系统中,RhD抗原性最强,其次为RhE、RhC、Rhc、Rhe抗原,这些Rh抗原都具有明显的剂量效应,即纯合子比杂合子者强。例如,cDe/cDe型与抗-D的反应比cDe/cde强,cdE/cde型与抗-E的反应比cDE/cde强。在世界各地报道的输血免疫病例中,抗-E的检出数量要远远高于抗-e的数量。但红细胞表面RhE抗原数量与Rhe抗原数量相差并不大,免疫原性却相差很大,这些现象尚需深入研究。
RhCE变异体与RhD变异体相比,RhCE变异体少得多。引起RhCE变异的原因主要有:① RHCE 基因点突变导致RhCE变异体的产生,如VS、V、C W 、C X 和Rh:26;② RHCE 基因外显子取代,即不同的 RHCE 基因外显子间相互交换,如r G r;③ RHCE 基因外显子被 RHD 基因相应的外显子取代,如Dc-、R O Har 、R N 和部分E。
RhE变异体有4种,即EⅠ、EⅡ、EⅢ和EⅣ变异体,用4表位模式表示则EⅠ有1,2表位,EⅡ有1,4表位,EⅢ有1,3,4表位,EⅣ有4个表位。EⅠ变异体外显子发生了500T→A点突变,EⅡ变异体第1~3外显子被 RH D基因的第1~3外显子取代,EⅢ变异体第5外显子序列(nt697-712)与 RHD 基因部分交换。