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1. 立方依据 健脾清化方的立方依据为根据以上关于慢性肾脏病、肾纤维化脾虚湿热证产生机制的探讨及李东垣“火与元气不两立，一胜则一负，脾胃气虚则下流于肾，阴火得以乘土位”的论述，可以归纳出由于脾胃“中气式微”引起“阴火乘土，正虚与湿热之毒胶着对垒，三焦壅塞”而导致慢性肾脏病、肾纤维化的脾虚湿热机制，同时流行病学显示脾虚湿热在慢性肾脏病、肾纤维化病程中长期普遍存在，故应选用益气健脾及清热化湿的药物，从“脾”论治肾纤维化；其次，慢性肾脏病、肾纤维化病位在脾肾两脏，且肾虚亦是其常见病机之一，但是肾如“薪火”、脾如“鼎釜”，先天之本需要后天滋养方能生化无穷，同时，由于肾病患者中焦不利，故益肾气则易壅滞气机，养肾阴则滋腻碍胃，常常虚不受补，而调理脾胃则避开了这一弊端，使脾气健旺得以散精，来实现对肾的濡养支援，故治疗肾病应取道中焦以济下焦，看似不补肾而实为补肾；第三，中焦为气机枢纽，司一身之升降开合，可升清降浊，慢性肾脏病、肾纤维化患者常表现为蛋白精微不摄而水浊潴留，恰与中焦气机乖戾、升清降浊功能失常完全契合，《素问·六微旨大论》有云“出入废则神机化灭，升降息则气立孤危”，故正如名医刘渡舟所指出的“要给肾脏松绑，开其郁，利其气，恢复其升降出入的能动作用”，“松绑”的关键就是恢复中焦气化枢纽的正常运行，故应斡旋中土气机，健脾以升清，清热化湿以降浊，重新建立人体升降秩序，使下焦肾的活动开合有度，逐渐走向正轨。基于以上三点，我们着眼于中焦脾胃，拟定益气健脾、清热化湿的治疗原则来治疗慢性肾脏病、肾纤维化。在选方用药上，由于李东垣的补脾胃泻阴火升阳汤即是为脾虚湿热而设，故何氏在补脾胃泻阴火升阳汤基础上进行加减化裁而创立以益气健脾、清热化湿为主要治疗原则的健脾清化方。何氏通过对古今四位医家遣方择药的分析研究，发现其用药习惯颇为相似，益气健脾药首推黄芪、党参，而清热药多选黄连，燥湿药多选用苍术，恰与健脾清化方选用黄芪、党参、黄连、苍术四味不谋而合，这表明健脾清化方的方药其实体现着多位名医的临床心得。
2. 组方分析 健脾清化方由补脾胃泻阴火升阳汤去升麻、柴胡、石膏、黄芩、甘草、羌活等诸药，人参改为党参，加草果、制大黄而成，方中共有六味中药：生黄芪、党参、制大黄、黄连、苍术和草果。黄芪味甘性微温，具有益气健脾、补肺固表止汗、养阴生津、通脉行滞、行水温阳、托毒排脓、生肌之功，《本草汇言》言其能“补肺健脾，卫实敛汗，驱风运毒”，《本经逢原》则称之“能补五脏诸虚，治脉弦自汗，泻阴火，去肺热，无汗则发，有汗则止”，正因为黄芪可补益全身之气，治五脏虚损，故清医黄宫绣称赞黄芪为“补气诸药之最”。党参味甘性平，可补气健脾益肺，生津养血，《本草从新》称其能“补中益气，和脾胃除烦渴”，《本草正义》则赞其“力能补脾养胃……其尤可贵者，则健脾运而不燥，滋胃阴而不湿，润肺而不犯寒凉，养血而不偏滋腻，鼓舞清阳，振动中气，而无刚燥之弊”。大黄味苦性寒，功具清热通腑、活血化瘀、凉血解毒、利湿退黄、通经，《神农本草经》载其能“主下瘀血、血闭、寒热，破癥瘕积聚，留饮宿食，荡涤肠胃，推陈致新，通利水谷，调中化食，安和五脏”。黄连味苦性寒，具有清热泻火、解毒化湿之功，《药类法象》言其“泻心火，除脾胃中湿热，治烦躁恶心，郁热在中焦，兀兀欲吐。治心下痞满必用药也”，《本草发挥》则云“苦入心，寒除热。大黄、黄连之苦，以导泻心下之虚热”。苍术味辛苦性温，能发表散寒，燥湿运脾，祛风明目，《本草从新》称其“燥胃强脾，发汗除湿，能升发胃中阳气，止吐泻，逐痰水”。草果味辛，性温，有温中燥湿、截疟化痰之功，《本经逢原》言其能“除寒，燥湿，开郁，化食，利膈上痰”，《本草正义》则称赞草果“善除寒湿而温燥中宫，故为脾胃寒湿主药”。
在健脾清化方中，生黄芪、党参味甘性温以益气培土、扶正治本，脾气健旺则水湿可化，生黄芪、党参还可兼益肺气、固表止汗，防止外邪侵袭人体，且黄芪能行水消肿；黄连、大黄味苦性寒以直折阴火、清热燥湿，草果、苍术味辛性温燥以搜荡湿浊、燥湿运脾，制大黄尚可通腑泻浊、活血化瘀，六药合用，共奏益气健脾、清热化湿之功效。全方补中有泻，泻火燥湿而不伤正，益气扶正而不助邪，能使正气渐旺，湿热消退，适用于慢性肾脏病、肾纤维化脾虚湿热证患者。
临床研究显示健脾清化方能改善患者的蛋白尿、肾功能、血脂水平，降低患者超敏C反应蛋白水平和炎症因子白细胞介素 17和干扰素γ水平，具有抗炎、提高细胞免疫功能，从而改善肾功能的作用。在对Platt模型大鼠和多柔比星所致FSGS模型大鼠的实验研究发现，健脾清化方可明显改善大鼠蛋白尿、血脂异常和肾功能，降低肾小管间质FN mRNA、Col-Ⅳ mRNA、Col-Ⅲ mRNA表达水平，从而抑制ECM的合成及TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA表达，抑制肾纤维化进程；健脾清化方可升高肾组织超氧化物歧化酶活性，降低肾组织丙二醛、游离脂肪酸含量，降低ATⅡ及NADPH氧化酶的表达，从而改善慢性肾衰竭大鼠的氧化应激反应，延缓肾纤维化进程。能降低模型鼠脾淋巴细胞CD4 ＋ ／CD8 ＋ 值，抑制T淋巴细胞的激活，降低肾组织TNF-α、IL-6、IL-10水平，降低MCP-1、ICAM-1的表达，从而抑制细胞通路中的NF-κB和MAPK炎症通路，改善大鼠的炎症损伤，延缓肾纤维化。体外研究显示，健脾清化方中的中药单体可以抑制活化的肾成纤维细胞株和系膜细胞株的增殖以及TGF-β的分泌，有效防治肾纤维化。其中黄芪甲苷对活化的两种细胞株抑制效果最好，其次是大黄酚和大黄素，再次是黄芪皂苷Ⅰ、党参炔苷。抑制活化的两种细胞株TGF-β的分泌效果最好的是黄芪甲苷和黄芪皂苷Ⅰ，其次是党参炔苷、盐酸小檗碱、大黄酚和黄芪皂苷Ⅱ，再次是大黄酸、四氢小檗碱和大黄素。
湿热、血瘀是贯穿慢性肾衰疾病始终的重要病理产物，而脾肾气虚是CRF发生的重要因素。因此在清热利湿、活血化瘀治疗的同时，健脾补气益肾为重要治法，如果单用补养之法，可谓补不敷失，欲塞流，须澄源，运用活血清热之法能达通因通用之功，以达“去菀陈莝”，实现虚实并治；如果单用活血清热法，有可能祛邪太过而伤正，所以应该在活血基础上结合补养，以达到健脾补气益肾、活血清热利湿的作用，切中慢性肾衰的关键病机，体现了中医学“辨证论治”“审因论治”的精髓。
慢性肾功能衰竭是指各种原发性或继发性慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患者进行性肾功能损害所出现的一系列症状或代谢紊乱的临床综合征，其最终结局终末期肾脏病的全球发病率呈现上升趋势。Liu等在Lancet杂志上发表中国的CKD总患病率为10.8％，出现蛋白尿的比率为9.4％。Ortiz等报道，人类慢性肾功能衰竭发生风险在40岁时为2％。慢性肾脏病病势迁延，治疗形势严峻，消耗医疗资源巨大，严重危害人类生命健康，加重社会经济负担，已经成为临床亟待解决的重要课题。中医学根据慢性肾脏病相关临床症状，只有“虚劳”“腰痛”“水肿”“癃闭”“关格”等病名，其病理机制涉及“虚、瘀、湿、毒”。其基本过程缠绵难愈、反复发作，除脾肾亏损外，湿热瘀毒已成为突出矛盾，故健脾气、清湿热已成为慢性肾脏病中医治疗的重要手段。西医学就CKD疾病过程中出现的症状行对症处理，或配合激素、免疫抑制剂进行治疗，不但无益于脾虚湿热中医临床证候的改善，还有耗气潴湿之弊。CKD3期患者的治疗及预后影响慢性肾功能不全的疾病转归，其治疗手段在病程中尤为关键，因此寻求疗效显著的中药复方对脾虚湿热型CKD3期患者行辨证施治为中医药治疗慢性肾脏病的重要方面。健脾清化方为何氏研制的立论于“补脾气”“降阴火”，治疗早中期脾虚湿热型慢性肾脏病的有效中药复方。多项动物实验、临床研究已从免疫炎症、信号通路、抗肾纤维化等角度证实了健脾清化方的确切疗效。为进一步测试治疗的有效性，本研究就脾虚湿热型CKD3期患者行大样本、多中心、前瞻性、随机对照、双盲、双模拟研究。
（一）研究对象和方法
1. 对象 本研究是多中心临床研究，研究时间为2012年1月1日至2014年9月30日，研究对象来自6个研究中心：上海中医药大学附属曙光医院、上海交通大学附属仁济医院、上海市第六人民医院、上海中医药大学附属普陀医院、上海中医药大学附属岳阳医院、上海中医药大学附属上海市中医医院。
2. 诊断标准 根据肾脏病预后质量指南（kidney disease outcome quality initiative，K／DOQI）推荐的肾损害的分级标准CKD3级［肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）：30～59 ml／（min·1.73 m 2 ）］。
（1）中医辨证分型标准：参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》诊断标准：①脾虚证。主症：神疲乏力；次症：食少纳呆、口淡不渴、脉细；舌质：边有齿痕。②湿热证。主症：小便短赤或口苦黏腻；次症：口干、渴不多饮；舌苔：黄腻。
（2）纳入病例标准：符合慢性肾脏病西医诊断标准的CKD3级患者，签署知情同意书；中医辨证为脾虚湿热患者；24h尿蛋白定量为0.5～2.0 g；高血压、严重感染、水、电解质及酸碱平衡紊乱等得到有效控制，血K ＋ 在正常范围内；年龄为18～70岁。
（3）排除病例标准：继发性慢性肾脏病包括系统性红斑狼疮、糖尿病肾病、高血压肾病和药物性肾损害等；合并有心、脑、肝和造血系统等严重原发性疾病者；肾移植术后、精神病患者；急性肾功能衰竭患者；妊娠或哺乳期妇女；已知对所用药物过敏的患者；正在参加其他药物临床试验者或3个月内参加过其他临床试验者或用过西药糖皮质激素、免疫抑制剂、雷公藤制剂；如用过血管紧张素转换酶抑制剂，需洗脱2周后才可入选；血压≤90／60 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）。
3. 病例随机分配方法 采取随机、双盲、双模拟平行对照法。用SAS软件产生分层随机数表（1～400），包括15％的脱落。产生相应随机编号，根据患者临床就诊顺序由每个研究单位到统计人员处领取相应随机编号。
4. 分组 本研究重点是在饮食营养、降压、调脂等基础治疗上的CKD3期的优化中医治疗方案，共入组270例患者，替米沙坦＋中药模拟剂组91例、中药＋替米沙坦模拟剂组89例、替米沙坦＋中药组90例，随访中脱落30例，最终替米沙坦＋中药模拟剂组79例、中药＋替米沙坦模拟剂组80例、替米沙坦＋中药组81例。
5.治疗方法
（1）基础治疗：主要包括饮食营养、控制血压、血脂等。饮食营养：参照我国《慢性肾脏病蛋白质营养治疗专家共识》，蛋白质摄入量为每日0.8～1.0 g／kg，其中高生物价蛋白＞50％。控制血压：对血压增高者，参照美国高血压预防治疗指南7和K／DOQI推荐标准，根据尿蛋白定量，分别将血压降至130／80 mmHg及125／75 mmHg以下。控制血脂：对血脂增高者，参照1997年我国血脂防治建议和美国2001年5月公布的“国家胆固醇教育计划第三次报告”标准，使总胆固醇＜5.72 mmol／L（＜220 mg／dl），低密度脂蛋白胆固醇＜3.64 mmol／L（＜140 mg／dl），三酰甘油＜2.26 mmol／L（＜200 mg／dl）。
（2）中医优化治疗方案。替米沙坦＋中药模拟剂组：替米沙坦40 mg／d；中药模拟剂每次1袋，每日2次。中药＋替米沙坦模拟剂组：健脾清化方免煎颗粒，每次1袋，每日2次；替米沙坦模拟剂40 mg／d。替米沙坦＋中药组：健脾清化方免煎颗粒，每次1袋，每日2次；替米沙坦40 mg／d。药物信息：健脾清化方：由党参15 g、生黄芪15 g、草果仁6 g、苍术10 g、黄连3 g、制大黄9 g组成，制成免煎颗粒剂，每次1袋，每日2次。中药模拟剂：与中药颗粒剂外观一致的安慰剂，每次1袋，每日2次。所有中药及中药安慰剂均委托江苏省江阴天江药业有限公司制成免煎颗粒剂。替米沙坦及其模拟药：替米沙坦（40 mg／d）和替米沙坦模拟药均为宜昌长江药业有限公司产品，如研究中血K ＋ ＞6.0 mmol／L或血压≤90／60 mmHg时均需暂停用药进行针对性治疗，待血K ＋ 、血压正常后继续使用，如连续停药超过2周即退出临床试验。疗程：6个月为1个疗程。每4周访视1次。
6. 观察指标 疗效性观察。
（1）中医证候学观察指标：体格检查，症状、舌、脉象，在治疗前及治疗后每4周检查1次。根据Stanghellini标准按症状轻重分为4级。0分：无症状；1分：偶有症状但不明显，不影响日常工作生活；2分：症状较为常见，轻度影响日常工作生活；3分：症状严重，频繁出现，且影响工作及生活。
（2）肾功能指标观察。①血肌酐值：因男、女血肌酐值差异及各中心血肌酐参考值差异，故将计量资料根据实际临床意义转化为等级资料，分别为：正常、高于正常。在治疗前及治疗后每4周各测定1次。②血清尿素氮：在治疗前及治疗后每4周各测定1次血清尿素氮。
（3）安全性观察。一般项目：血、尿、大便常规加隐血检查；在治疗前及治疗结束时分别查1次肝功能、心电图；治疗前及治疗后每4周检查1次血钾。
7. 统计学处理 采用SPSS 18.0进行统计分析，一般资料组间均衡性检验及中医证候得分组间均衡性检验根据情况分别采用Pearson Chi-square检验、单因素方差分析及Kruskal-Wallis H检验。中医证候得分比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Nemenyi检验，治疗前后肝功能及血肌酐异常率比较均采用Pearson Chi-square检验。各次访视间的中医证候得分比较采用重复测量资料的方差分析。
（二）结果
一般情况共纳入患者270例，其中替米沙坦＋中药模拟剂组91例、中药＋替米沙坦模拟剂组89例、替米沙坦＋中药组90例。脱落30例，脱落率为11.1％。其中，上海中医药大学附属曙光医院103例，脱落1例；上海交通大学附属仁济医院39例，脱落7例；上海市第六人民医院4例；上海中医药大学附属普陀医院62例，脱落10例；上海中医药大学附属岳阳医院22例，脱落6例；上海中医药大学附属上海市中医医院40例，脱落6例。其中施行肾穿刺患者为87例，肾穿率为32.2％。经Pearson Chi-square检验得：3组性别构成差异无统计学意义（χ 2 ＝0.146， P ＝0.930），3组性别构成比均衡。经ANOVA检验：3组年龄比较差异无统计学意义（ F ＝0.949， P ＝0.572），具有可比性。采用Pearson Chi-square检验得：3组体重指数差异无统计学意义（χ 2 ＝3.782， P ＝0.706），3组体重指数分类均衡可比。
1. 脾气虚证总得分 脾气虚证基线总得分：替米沙坦＋中药模拟剂组、中药＋替米沙坦模拟剂组和替米沙坦＋中药组的平均秩次分别为126.58、123.62和111.49，经Kruskal-Wallis H检验显示，脾气虚证中医证候基线得分组间比较差异无统计学意义（χ 2 ＝2.160， P ＝0.340），脾气虚证中医证候基线得分具有可比性。
不同访视点脾气虚证总得分：访视1、访视2、访视3、访视4、访视5、访视6各时间点组间比较差异均有统计学意义（ P 均＜0.001）。
治疗前后脾气虚证总得分：随着治疗时间延长，所有患者脾气虚证总得分呈显著性变化，即随着治疗时间的延长，脾气虚证总得分均数呈下降趋势。随着治疗时间延长，中药＋替米沙坦模拟剂组与替米沙坦＋中药组患者脾气虚证总得分下降趋势相近，替米沙坦＋中药模拟剂组在基线期至访视1时脾气虚证总得分上升，至访视2下降，随后呈平稳趋势。
2. 湿热内蕴证总得分 湿热内蕴证基线总得分：替米沙坦＋中药模拟剂组、中药＋替米沙坦模拟剂组和替米沙坦＋中药组的平均秩次分别为126.34、118.55和116.73，经Kruskal-Wallis H检验显示，湿热内蕴证中医证候基线得分组间比较差异无统计学意义（χ 2 ＝0.870， P ＝0.650），湿热内蕴证中医证候基线得分具有可比性。
不同访视点湿热内蕴证总得分：访视1、访视2、访视3、访视4、访视5、访视6各时间点组间比较差异均有统计学意义（ P ＜0.001），经多重比较可得各访视时间点替米沙坦＋中药模拟剂组与中药＋替米沙坦模拟剂组、替米沙坦＋中药组比较差异均有统计学意义（ P 均＜0.001）。
治疗前后湿热内蕴证总得分：随着治疗时间的延长，所有患者湿热内蕴证总得分呈显著性变化，即随着治疗时间延长，湿热内蕴证证候得分均数呈下降趋势。随着治疗时间的延长，中药＋替米沙坦模拟剂组与替米沙坦＋中药组湿热内蕴证总得分下降趋势相近，异于替米沙坦＋中药模拟剂组。
3. 血肌酐值 血肌酐基线值：替米沙坦＋中药模拟剂组肌酐值正常5例、高于正常74例，平均秩为121.91；中药＋替米沙坦模拟剂组肌酐值正常9例、高于正常71例，平均秩为117.50；替米沙坦＋中药组肌酐值正常6例、高于正常75例，平均秩为122.09。经Kruskal-Wallis H检验显示，血肌酐值组间比较差异无统计学意义（χ 2 ＝1.078， P ＝0.583），血肌酐值具有可比性。
不同访视点血肌酐值：各访视点3组患者血肌酐值差异无统计学意义（ P ＞0.05），肌酐值高于正常的人数从基线的220例下降至访视6的198例，经Pearson Chi-square显示，治疗前后肌酐异常率差异有统计学意义（χ 2 ＝8.960， P ＝0.003）。
4. 血清尿素氮 各时间点的总体血清尿素氮水平差异有统计学意义（ F ＝2.990， P ＝0.020），3种治疗方法对血清尿素氮无影响（ F ＝0.651， P ＝0.520）。3个治疗组各时间点血清尿素氮的变化趋势无差异（ F ＝1.260， P ＝0.270）。治疗前后，入组患者的总体血清尿素氮值无变化。
5. 治疗前后肾小球滤过率变化 各时间点患者的总体eGFR水平差异有统计学意义（ F ＝4.062， P ＝0.015）。治疗时间与组别不存在交互作用（ F ＝1.664， P ＝0.151）。随着治疗时间延长，3组患者的eGFR值均出现了先上升后相对稳定的变化趋势，其中替米沙坦＋中药模拟剂组与替米沙坦＋中药组的变化趋势相近。
6. 安全性评价 经Pearson Chi-square检验，治疗前和治疗后6个月，3个治疗组血常规、尿常规、粪常规、肝功能、心电图未见明显异常，3组比较差异无统计学意义（ P ＞0.05）。
7. 肝功能评价 治疗前，有1例患者肝功能异常（谷丙转氨酶59 IU／L），治疗后出现2例肝功能异常，分别为中药＋替米沙坦模拟剂组（谷丙转氨酶111 IU／L）、替米沙坦＋中药模拟剂组（谷丙转氨酶179 IU／L），经Pearson Chi-square检验，χ 2 ＝0.340， P ＝0.560，其异常率差异无统计学意义。此外，谷草转氨酶和血清总胆红素在240例患者的治疗前后均正常。
8. 血钾监测 随访期间，患者每4周测定1次血钾，未发现患者血钾＞6.0 mmol／L，第6次访视结束后，有3例患者血钾异常，均为中药＋替米沙坦模拟剂组。替米沙坦＋中药组在治疗前后血钾下降趋势较大，而替米沙坦＋中药模拟剂组和中药＋替米沙坦模拟剂组的血钾变化趋势相对平稳。
（三）讨论
本研究针对脾虚湿热型CKD3期患者进行健脾清化方治疗的多中心、随机对照临床观察，结果显示各访视点替米沙坦＋中药模拟剂组与中药＋替米沙坦模拟剂组、替米沙坦＋中药组比较差异均有统计学意义，其脾气虚证、湿热内蕴证总分均大于其他两组。随着治疗时间延长，中药＋替米沙坦模拟剂组与替米沙坦＋中药组的脾胃气虚证和湿热内蕴证总得分下降趋势相近，异于替米沙坦＋中药模拟剂组。治疗后患者总体肌酐异常率降低，可以认为综合优化治疗能够降低血肌酐值，保护肾功能，延缓CKD疾病进展。同时，3组患者的eGFR值均出现了先上升后相对稳定的变化趋势，明确了药物的肾功能保护作用。肝功能、血钾的监测结果反映了健脾清化方、替米沙坦的药物安全性。
综上所述，慢性肾脏病患者大多存在恶心、纳差、呕吐、口苦、口中黏腻等湿热表现，或有程度差异，与患者生存质量、疾病状态及预后密切相关，西医学往往针对CKD出现的临床表现进行降压、调脂，纠正贫血、电解质紊乱等对症处理，或常应用激素、免疫抑制剂，不但无益于改善上述湿热证候，往往还会加重其临床表现程度，使得湿热成为新的致病因素，反复胶着。因此，寻找既能改善CKD常见的脾虚湿热证候表现又能保护肾功能、延缓病情进展或提高生存率的中药复方亟待展望。本研究通过大样本、多中心的研究力证健脾清化方所具有的显著临床疗效。结果表明，单用或联合替米沙坦应用健脾清化方均能有效减轻慢性肾脏病3期患者脾气虚证和／或湿热内蕴证的中医临床证候表现，疗效优于单用替米沙坦。并且在接受健脾清化方治疗的6个月内，随着时间推移，患者脾胃气虚证和湿热内蕴证的中医临床证候表现逐渐改善。因此，在临床准确辨证的基础上，针对慢性肾脏病3期患者，健脾清化方或可成为中西医结合综合治疗慢性肾脏病的又一良方，本研究结果或可为慢性肾脏病的中医药治疗提供新的循证医学证据。
（一）对局灶节段性肾小球硬化模型大鼠的影响
健脾清化方临床疗效研究，结果显示该方能有效改善慢性肾病患者临床症状及肾功能水平，并能明显降低其肾纤维化指标，故本研究将健脾清化方应用于动物模型，在实验动物体内进一步研究和验证该方的改善肾功能的作用。
健脾清化方由益气健脾药物和清热化湿药物组成，为了了解两类药物在健脾清化方中改善肾功能、血脂、炎症指标、纤维化指标方面的权重，从而指导不同类型药物在组方时的剂量比例调整，获取更好的临床疗效，本研究将健脾清化方拆方为益气健脾方（党参、黄芪）和清热化湿方（黄连、大黄、草果、苍术），分别观察其疗效。
尿毒清是临床上市的治疗慢性肾衰的药物，治则为健脾利湿、通腑降浊、活血化瘀，由大黄、黄芪、桑白皮、苦参、白术、茯苓、制何首乌、白芍、丹参、车前草诸药组成，大量临床及动物实验证明该方可有效降低肌酐、尿素氮，稳定肾功能，延缓透析时间，疗效已获得国内同行公认。故本研究将之设定为对照组，对于判定健脾清化方的各项疗效非常有说服力。用于研究肾纤维化的动物模型主要包括单侧输尿管梗阻肾纤维化模型、肾大部切除所致的慢性肾衰模型、肾切除联合多柔比星诱导局灶节段性肾小球硬化模型、缺血-再灌注模型和腺嘌呤肾病模型。其中肾切除联合多柔比星诱导局灶节段性肾小球硬化模型的病变特点与人类的局灶节段性肾小球硬化（FSGS）最为相似，且模型的制备稳定而均衡，故在肾病研究领域得到广泛应用，成为目前研究慢性肾纤维化公认的动物模型。多柔比星属蒽醌类广谱抗生素，目前广泛应用于癌症化疗中，但其副作用严重，制作FSGS大鼠模型即是利用其肾脏毒性，其具体造模机制为：多柔比星可引起肾小球脏层上皮细胞损伤，导致肾小球结构功能异常，滤过率改变，由此产生的大量尿蛋白刺激肾脏细胞释放多种炎症因子及细胞因子，导致肾小球系膜细胞和肌成纤维细胞增殖，大量分泌细胞外基质（ECM）成分堆积于系膜、肾间质，分别产生肾小球硬化和肾间质纤维化。考虑到FSGS大鼠模型在5种常见模型中病理表现最接近人类肾纤维化，且在模型制备上亦具有优势，故采用肾切除联合多柔比星诱导局灶节段性肾小球硬化模型进行研究。
（1）实验材料
1）实验动物：健康雄性SD大鼠84只，2月龄，清洁级，体重（200±20）g，购自上海西普尔-必凯实验有限公司，动物合格证号：SCXK（沪）2008—0016，在上海中医药大学实验动物中心SPF级喂养，在室温25℃、相对湿度45％、人工12 h昼／夜循环照明环境中分笼饲养，设备使用证号：SCXK（沪）2009—2069，自由进食标准饲料和饮水。
2）实验药物：健脾清化方及其拆方的制备。
健脾清化方由党参15 g、生黄芪15 g、草果仁6 g、苍术10 g、黄连3 g、制大黄9 g组成；益气健脾拆方由党参15 g、生黄芪15 g组成；清热化湿拆方由草果6 g、苍术10 g、黄连3 g、制大黄9 g组成。以上药材由上海中医药大学附属曙光医院东院中药房统一进货。根据健脾清化方授权专利规定进行煎制：以陶制砂锅，煎前冷水浸泡30 min，水量略高出药物3.3 cm，二汁则用水相应减少，用文火久煎，头汁煎25 min，二汁煎20 min，头、二汁混合，每次100～150 ml，药中大黄头煎完成前10 min放入，然后加入7倍量9％乙醇热回流1h，得提取液，药渣加入7倍量50％乙醇热回流1h，再得提取液，两次提取液合并浓缩至每毫升含生药2 g。
尿毒清颗粒，购自广州康臣药业有限公司（国药准字Z1097122）。
（2）实验方法
1）肾切除联合多柔比星诱导局灶节段性肾小球硬化模型的制作：将84只SD大鼠适应性喂养1周，若生长情况良好则进行造模。采用抽签法将所有大鼠随机分为3组，12只大鼠为正常组；60只为造模组，均建立左侧肾切除联合多柔比星诱导局灶节段性肾小球硬化模型：2％戊巴比妥钠30 mg／kg腹腔注射麻醉，备皮及常规消毒，左侧背部纵向切口，暴露左肾，剥离肾脏周围脂肪及肾上腺，结扎左肾门血管后切除左肾，缝合切口；12只为假手术组，不结扎血管且不切除左肾，余操作同模型组。造模组大鼠于手术1周后尾静脉注射多柔比星溶液3 mg／kg，手术5周后再次尾静脉注射多柔比星溶液3 mg／kg；假手术组注射同等体积的生理盐水。以血肌酐显著高于正常组（ P ＜0.05）为造模成功的标准。
2）实验分组：模型制作成功时已有5只造模组大鼠死亡，成模后根据血肌酐值将造模组大鼠分为5组（模型组、健脾清化方组、益气健脾组、清热化湿组、尿毒清组， N ＝11），使5组间血肌酐差异无统计学意义（ P ＞0.05）。
3）给药方法及标本采集：健脾清化方组、益气健脾组、清热化湿组、尿毒清组分别以对应治疗药液按60 kg正常人20倍剂量（分别为1.9 g／100 g、1.0 g／100 g、0.95 g／100 g、1.35 g／100 g）灌胃，每日1次，正常组、假手术组和模型组以同体积生理盐水灌胃，连续灌胃8周后处死。处死前1日代谢笼留取24h尿液，无菌取血及残余肾组织，血液在取样后迅速以每分钟300 r离心10 min，采集上层血清分装并置于－80℃冰箱中保存以检测相关指标，肾组织分为两份，一份放入10％甲醛固定，用于制作病理切片，另一份放入液氮保存以检测相关指标。
（3）检测指标。一般情况：观察大鼠一般状态，有无精神萎靡、少动、厌食、毛发、光泽、腹泻、体重下降等表现，观察大鼠存活情况。
血肌酐测定（除蛋白法），血尿素氮测定（脲酶法），血尿酸测定，24 h尿蛋白测定（CBB法）。
总胆固醇测定（酶法），三酰甘油测定（酶法），低密度脂蛋白（LDL）测定（选择性沉淀法），极低密度脂蛋白（VLDL）测定（ELISA法）。
血清补体C3测定（免疫浊度法），血清补体C4测定（免疫浊度法），血清IgG测定（ELSA法），血清IgA测定（ELSA法），血清IgM测定（ELSA法）。
肾组织染色及观察：制作肾组织病理切片，肾组织HE染色，PAS染色，PAS染色的半定量分析，Masson染色与观察，Masson染色的半定量分析，免疫组织化学法检测肾组织Col-Ⅳ、LN、FN、α-SMA的表达，Western blot法检测肾组织TGF-β1的表达，透射电镜检测肾组织超微结构：透射电镜2％戊二醛固定肾组织2 h，缓冲液清洗10 min×3次，1％锇酸固定2 h，缓冲液清洗10 min×3次，脱水，10％丙酮浸透，包埋，切片，染色，透射电镜摄片。
血清白细胞介素 6（IL-6）测定（ELSA法），肾组织IL-6水平测定（Western blot法）；肾组织IL-10、IL-18、肿瘤坏死因子（TNF-α）水平测定（ELISA法）；肾组织IL-6mRNA、IL-10mRNA、IL-18mRNA、TNF-mRNA水平测定（Real-time PCR法）。肾组织NF κBp65、TRAF6mRNA水平测定（Real-time PCR法）。
定量RT-PCR检测肾小管间质α-SMAmRNA、Col-ⅢmRNA，肾小球及肾小管间质FNmRNA、Col-ⅣmRNA水平。
Western blot法检测各组大鼠肾组织P NF κBp65、肾小管间质TNF α、TRAF6的表达。
蛋白质印迹检测肾小管间质IL 6、MCP 1、ICAM 1水平，免疫荧光检测肾小管间质MCP-1、ICAM-1荧光强度表达。
定量RT-PCR检测肾组织中IL-17AmRNA的表达，流式细胞术检测大鼠脾脏淋巴细胞CD4 ＋ 、CD8 ＋ 、Th17。
1.对局灶节段性肾小球硬化模型大鼠肾功能 、 蛋白尿的影响
（1）研究结果
1）各组大鼠一般情况观察：正常组和假手术组大鼠一般情况较好，精神状态正常，反应灵敏，活动自如，未发现饮食减少、腹泻，体重随时间推移逐渐增加，毛色有光泽。造模期间共有5只造模大鼠死亡，模型制作成功后的药物治疗期间，模型组、益气健脾组分别有5只大鼠死亡，两组各剩余6只，健脾清化方组清热化湿组尿毒清组分别有4只大鼠死亡，3组各剩余7只。模型组和各治疗组大鼠均有不同程度的精神萎靡、反应迟钝、运动减少、厌食、体重减轻和腹泻、毛发杂乱无光泽等表现，其中模型组及益气健脾组以上症状较重，而其余各治疗组上述症状则较轻。
死亡原因分析：造模期间，造模组大鼠共有5只死亡；模型制作成功后至处死所有大鼠期间，模型组、益气健脾组分别有5只死亡，死亡率为45.5％，健脾清化方组清热化湿组、尿毒清组分别有4只死亡，死亡率为36.4％。死亡大鼠体型羸瘦，体重均低于150 g，死亡前一般情况较差，进食量少、精神萎靡，死亡均发生在夜间，无呼吸道、消化道出血痕迹，剖腹检查亦未发现饮食过量引起的胃肠胀气，肾脏病理可见肾脏结构系肾小球硬化超过70％，肾小管内存在大量管型，肾间质炎症浸润程度较为严重，综合考虑认为多柔比星毒性引起的肾组织严重损伤可能是其死亡的原因。
2）各组大鼠肾功能水平比较：与正常组相比，假手术组大鼠血清Scr、BUN及UA水平无明显升高，模型组血清、BUN及UA水平较之正常组均明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组血清Scr、BUN水平显著下降（ P ＜0.01），清热化湿组血清Scr亦显著下降（ P ＜0.01），同时BUN降低（ P ＜0.05），尿毒清组大鼠血清Scr水平降低（ P ＜0.05），且BUN明显下降（ P ＜0.01），益气健脾组血清Scr、BUN水平均无明显下降（ P ＞0.05）；各治疗组血清UA水平较模型组均无明显下降（ P ＞0.05）；与健脾清化方组相比，益气健脾组血清Scr水平明显较高（ P ＜0.01），清热化湿组和尿毒清组血清Scr水平亦高于健脾清化方组，但无统计学意义（ P ＞0.05），同时，益气健脾组、清热化湿组血清BUN水平高于健脾清化方组，但无统计学意义（ P ＞0.05），尿毒清组血清BUN水平则与健脾清化方组接近；与益气健脾组相比，清热化湿组血清Scr水平明显较低（ P ＜0.05），其血清BUN水平亦低于益气健脾组，但无统计学意义（ P ＞0.05）。
3）各组大鼠24 h尿蛋白定量（24 hUpr）水平比较：与正常组相比，假手术组大鼠24 hUpr水平无明显升高；模型组24 hUpr水平与正常组相比明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组24 hUpr水平明显下降（ P ＜0.01），尿毒清组24 hUpr水平亦降低（ P ＜0.05），清热化湿组和益气健脾组24 hUpr水平无明显降低（ P ＞0.05）；与健脾清化方组相比，益气健脾组24 hUpr水平明显较高（ P ＜0.05），清热化湿组24 hUpr水平亦高于健脾清化方组，但无统计学意义（ P ＞0.05），尿毒清组24 hUpr水平与健脾清化方组接近；与益气健脾组相比，清热化湿组24 hUpr水平较低，但无统计学意义（ P ＞0.05）。
（2）讨论与分析
1）健脾清化方的疗效探讨：由于慢性肾脏病、肾纤维化具有正气虚衰与邪实相互交错的病理特点，目前治疗此类疾病的中药复方多同时使用扶正和祛邪药物。部分学者通过文献回顾发现，清热解毒化湿药物和扶正药物对于改善肾功能衰竭、逆转肾组织损伤均有不同程度的作用，针对慢性肾脏病脾虚湿热证，采用益气健脾与清热化湿相结合的方法进行组方。一方面，益气健脾药物除了可以补益中气之外，还能通过扶助正气、健运脾胃使脾主运化水湿的功能恢复正常，湿邪得以运化则湿热减轻，从而达到清热祛湿的目的；另一方面，脾喜燥恶湿，且火邪最易伤脾胃元气，运用清热利湿药可使热之邪速去，邪去则正气自复，脾气因而健旺，因此也能间接实现益气健脾；故益气健脾药物和清热化湿药物均可不同程度改善脾虚湿热证，两者作用相辅相成，理论上两者配伍使用的效果应优于单独使用。研究结果显示，模型组大鼠血肌酐、尿素氮、尿酸及24 h尿蛋白定量水平较正常组明显升高，提示单侧肾切除联合多柔比星诱导局灶节段性肾小球硬化模型制作成功；进行药物干预后，健脾清化方组血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白定量水平较模型组明显下降（ P ＜0.01），说明健脾清化方能够有效改善模型大鼠的肾功能，延缓慢性肾脏病的进展；同时，健脾清化方在降低血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白定量水平方面均不同程度地优于益气健脾组和清热化湿组（ P ＜0.05），说明益气健脾法与清热化湿法联合使用确实优于两种方法单独使用；以上结果从动物实验方面验证了健脾清化方组方的合理性和科学性。
对照组使用药物尿毒清为获得国内公认的治疗慢性肾衰的中成药，由大黄、黄芪、桑白皮、苦参、白术、茯苓、制何首乌、白芍、丹参、车前草等药物组成，方中黄芪、白术益气健脾，桑白皮、大黄清热降浊，苦参、茯苓、车前草燥湿利湿，丹参、白芍活血养血，何首乌补肾填精，故除了益气健脾、清热利湿作用外，尚具有活血化瘀、补肾的作用。尿毒清的治则较之健脾清化方看似更为全面，然而本研究结果显示，尿毒清组与健脾清化方组血清Scr由于数据离散度较大的原因，两组间尚无统计学差异，但尿毒清组血清Scr均值明显高于健脾清化方，提示健脾清化方在降低血肌酐方面优于尿毒清颗粒。究其原因，可能是因为中药使用讲究配伍精当、效专力宏，经典的配伍往往疗效肯定，能够胜过面面俱到的时方、大方，如经方的使用就是很好的例子。研究中尿毒清颗粒由十味药组成，选药较多，兼顾活血化瘀、补肾填精，故药力分散，而健脾清化方配伍结构精简，针对脾虚湿热证药力专一，故在改善血肌酐方面获得了更好的疗效。
2）健脾清化方的主要起效药物：在慢性肾脏病、肾纤维化的治疗上，不同医家配伍使用祛邪和扶正药物的剂量比例差异很大，目前并没有相关实验研究对两类药物的效果差异进行比对。部分中医学者认为若能祛除浊邪则正气容易恢复，浊邪久积则疾病必然难以医治，从理论角度提出治疗该类疾病应采取“清除秽浊为主，扶正为辅”的手段，在组方时应确立祛邪药物的主体地位。因此本研究从对比扶正、祛邪两类药物的治疗权重入手，设立健脾清化方的拆方，将益气健脾与清热化湿药物完全分开，从而比较两者改善肾功能的疗效差异。结果显示益气健脾方组血肌酐、尿素氮、24h尿蛋白定量虽然相对模型组比较也有不同程度的下降，但并无明显统计学差异，组内大鼠的一般情况也与模型组基本相似，反观清热化湿方组，虽然其24 h尿蛋白定量与模型组相比亦无明显改变（ P ＞0.05），但血肌酐、尿素氮水平与模型组相比明显下降（ P ＜0.01或 P ＜0.05），且组内大鼠一般情况较好。研究结果提示，清热化湿类药物对于纠正该模型大鼠的氮质血症、改善肾功能恶化作用更加显著，而益气健脾类药物则在该方中扮演从属角色，这恰可印证本段前述之中医观点。究其原因，中医理论认为，痰湿壅滞中焦时不宜单独使用党参、黄芪等补益药物，使用不当的话不仅不能益气健脾，还会助邪，并加重中焦气滞，导致湿热难去，研究中益气健脾药物疗效不佳的原因可能是因为模型大鼠体内湿热状态较为严重，并不适合单独及大量使用益气健脾药，所以应用益气健脾药后对脾虚湿热的改善作用较差，相反，单独使用清热化湿药物却能够快速祛除湿热，湿热祛则正气自复，故对于改善脾虚湿热及肾功能作用明显。根据此实验结果，在将来进一步的研究中，可以对方内清热化湿药物的剂量和数量进行增加，以期更好地延缓或逆转功能衰竭，使肾病患者最大程度地获益。因此健脾清化方能明显改善FSGS模型大鼠的血肌酐、尿素氮及24h尿蛋白定量水平，保护肾脏功能，延缓慢性肾功能衰竭的进展。在FSGS模型中，清热化湿药物在纠正氮质血症、改善肾功能恶化方面优于益气健脾药物。清热化湿法、益气健脾法的联合使用在改善肾功能方面优于两种治法单独使用。
2. 对局灶节段性肾小球硬化模型大鼠血脂及体液免疫的影响 健脾清化方能够有效改善FSGS大鼠的肾功能，这与前期临床研究中健脾清化方改善慢性肾衰患者的肾功能的结果是一致的。那么，除肾功能之外，健脾清化方是否能够对其他血液指标也产生影响，从而影响慢性肾脏病进程呢？大量研究表明，脂质代谢紊乱和体液免疫损伤是慢性肾脏病发生和发展的重要因素，且脂质代谢紊乱与湿热密切相关，同时体内免疫与脾虚密切相关。因此，采用酶法、选择性沉淀法及ELSA法观察模型大鼠血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白的变化，采用免疫浊度法观察血清补体C3、C4的变化，采用ELISA法观察血清免疫球蛋白的变化，并研究健脾清化方干预后各指标的变化，从而明确健脾清化方是否可以通过调节模型大鼠的脂质代谢及体液免疫反应对慢性肾脏病起到积极的干预作用。
（1）研究结果：与正常组相比，假手术组血清TC、TG、LDL及VLDL水平无明显差异，模型组血清TC、TG、LDL及VLDL水平均明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、清热化湿组及尿毒清组血清TC、TG、LDL及VLDL水平明显下降（ P ＜0.01），益气健脾组血清TC、TG及VLDL水平明显下降（ P ＜0.01），但LDL水平无明显下降（ P ＞0.05）；与益气健脾组相比，清热化湿组血清TC、TG、LDL、VLDL水平有不同程度的下降（ P ＜0.01）；健脾清化方组血清TC、TG、LDL及VLDL水平明显低于益气健脾组、清热化湿组（ P ＜0.01或 P ＜0.05），其TC、TG、VLDL均值水平亦低于尿毒清组，但无统计学差异，其LDL水平则与尿毒清组近似。
血清补体C3、C4水平比较：假手术组大鼠血清C3、C4水平较正常组无明显差异；模型组血清C3水平较正常组明显下降（ P ＜0.01），C4水平较正常组明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、尿毒清组血清C3水平均明显升高（ P ＜0.01），C4水平均明显下降（ P ＜0.01），清热化湿组血清C3水平升高（ P ＜0.05），C4水平下降（ P ＜0.01），益气健脾组血清C4水平亦明显下降（ P ＜0.01），而C3水平则无明显升高（ P ＞0.05）；健脾清化方组与尿毒清组血清C3、C4水平组间比较无明显差异（ P ＞0.05），健脾清化方组血清C3水平高于益气健脾组、清热化湿组，C4水平低于益气健脾组、清热化湿组，但无统计学差异；与益气健脾组相比，清热化湿组血清C3水平较高，但无统计学差异，C4水平则与益气健脾组近似。
血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA水平比较：假手术组血清IgG、IgM、IgA水平与正常组相比无明显差异；模型组血清IgG水平较正常组明显下降（ P ＜0.01），IgM、IgA水平较正常组明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、尿毒清组血清IgG水平均明显升高（ P ＜0.01），IgM、IgA水平均明显下降（ P ＜0.01），清热化湿组、益气健脾组血清IgG水平有不同程度的升高（ P ＜0.05），IgM、IgA水平亦有不同程度的下降（ P ＜0.01或 P ＜0.05）；与益气健脾组相比，清热化湿组IgM水平下降更为明显（ P ＜0.05），IgA水平亦有下降，但无统计学意义，IgG水平则与益气健脾组近似；健脾清化方组血清IgG水平明显高于益气健脾组、清热化湿组（ P ＜0.01或 P ＜0.05），IgM、IgA水平低于益气健脾组、清热化湿组（ P ＜0.01）；与健脾清化方组比较，尿毒清组升高程度更大，IgM降低程度更大，IgA降低程度则不如健脾清化方组，但均无统计学意义。
（2）讨论与分析
1）健脾清化方对FSGS大鼠脂质代谢紊乱的干预作用：随着“脂质肾毒性”于1982年被Moorhead等人首次揭示，脂代谢紊乱作为肾小球硬化独立的危险因素开始走入研究者的视野，它既是慢性肾脏病的常见表现，又参与慢性肾脏损害的过程，大量的科学研究证实脂质可以参与MAFK信号通路的调节、促进肾脏固有细胞损伤和系膜细胞增殖、刺激促纤维化细胞因子的分泌、介导炎症反应影响细胞外基质（ECM）合成与降解的平衡，因此可与其他因素共同推进慢性肾脏病及肾纤维化的进展。有研究发现，在原发性肾小球疾病中，湿热证患者的血清总胆固醇和三酰甘油水平明显高于非湿热证患者，该结果提示脂质代谢紊乱与中医湿热证密切相关；而现代临床及药理研究发现，诸多中药可改善脂质代谢紊乱，如黄芪中所含黄芪多糖、大黄中所含大黄多糖可以降低血清TC、TG及LDL，黄连中所含小檗碱可以明显降低血清TC、TG及VLDL，且降脂药物多为清热化湿类中药，这亦从侧面证明了脂质代谢紊乱与湿热的关系。
研究结果显示，模型组各项血脂指标与正常组比较均明显上升，提示FSCS模型大鼠体内发生了明显的脂质代谢紊乱。经药物治疗后，健脾清化方组大鼠的各项血脂水平均较模型组明显降低（ P ＜0.01），结合其肾功能改变，提示该方能够通过干预脂质代谢改善肾脏功能，从而影响肾脏病发展的进程。其拆方清热化湿方、健脾益气方也能有效降低模型大鼠的TC、TG、VLDL水平（ P ＜0.01），但益气健脾组LDL水平较模型组无明显降低（ P ＞0.05），而清热化湿方则能有效降低模型大鼠的LDL水平（ P ＜0.01）：同时，与益气健脾组相比，清热化湿组TC、TG、VLDL水平均有不同程度的降低（ P ＜0.01），以上结果提示健脾清化方中清热化湿药物和益气健脾药物均能不同程度干预脂质代谢紊乱，但清热化湿药物对于降低血脂水平起主要作用，此结果符合前段关于脂质代谢紊乱与湿热关系的认识。另外，健脾清化方组各项血脂指标均明显低于益气健脾组和清热化湿组（ P ＜0.01），提示在干预脂质代谢紊乱方面，益气健脾法、清热化湿法的联合运用比采用单一治法具有更好的疗效。临床常用药物尿毒清因含有益气健脾、清热化湿药物，故亦可有效降低模型大鼠的血脂水平（ P ＜0.01），但健脾清火方组TC、TG、VLDL的均值较尿毒清组更低，由于数据离散度的原因，两组间尚无统计学差异，此结果提示在脂质代谢紊乱方面健脾清化方优于尿毒清颗粒。
2）健脾清化方对FSGS大鼠体液免疫的干预作用：免疫学说是慢性肾脏病和肾纤维化成因的重要学说之一，众多研究已揭示体液免疫反应参与了慢性肾脏病的发生和发展，中医学认为，体液免疫与中医脾虚证密切相关，如《灵枢·师传》有云“脾者，主为卫”，《金匮要略》则指出“四季脾旺不受邪”，皆表明中医脾与人体抵御外邪的功能息息相关，脾气健旺则免疫系统功能正常，人体不易患病，若脾气亏虚则人体免疫反应亦出现异常，导致各种疾病的发生。近年来临床研究发现，脾虚患者体内存在血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA水平及补体C3、C4表达的异常，而动物实验则表明，益气健脾药物黄芪能提高血清IgG水平和补体C3的含量，土人参根能够升高脾虚大鼠IgM、IgG、C3、C4水平，而具有益气健脾作用的复方如补中益气汤、四君子汤则能提升脾虚证小鼠B淋巴细胞增殖的能力，以上结果均从实验角度证明了中医脾虚证与体液免疫之间具有密切的关系。实验结果显示，模型大鼠血清IgA、IgM及C4水平较正常组明显增高，表明单侧肾切除联合多柔比星诱导的FSCS模型大鼠体内存在体液免疫功能的亢进，同时模型组血清C3明显降低，说明体液免疫反应导致C3在补体系统激活时被大量消耗。本实验还发现模型大鼠血清IgG明显下降，这与其他研究中对血清免疫球蛋白测定的结果一致，分析其原因可能为以下两点：一是免疫复合物形成中消耗了部分的IgG；二是IgG分子量相对较小，FSGS大鼠模型中有大量蛋白从损伤的肾小球漏出，因此，IgG从尿液中大量丢失。经健脾清化方干预后，FSGS模型大鼠血清IgA、IgM及C4水平明显下降（ P ＜0.01），IgG、C3水平明显升高（ P ＜0.01），表明健脾清化方具有调节体液免疫的作用。IgG的升高则可能跟肾脏损伤减轻后尿中丢失减少有关。实验结果还显示，益气健脾方和清热化湿方亦可不同程度的降低模型大鼠血清IgA、IgM及C4水平（ P ＜0.01或 P ＜0.05），升高血清IgG、C3水平（ P ＜0.05），提示健脾清化方中益气健脾药物与清热化湿药物均能有效干预体液免疫。同时清热化湿组IgM、IgA的降低较益气健脾组更为明显（ P ＜0.05），提示在FSGS模型中，清热化湿药物在调节体液免疫方面比益气健脾药物具有更多的贡献，该结果与改善肾功能方面的作用比较结果相一致，究其原因，可能是该模型中大鼠的湿热状态较为严重，在不能祛除湿热的情况下，单独使用益气健脾药物无法有效发挥其功能，而清热化湿药物能够有效祛除湿热，使邪去而正复，间接起到了益气健脾的作用，因而获得了良好的调节体液免疫的作用。健脾清化方在改善免疫球蛋白水平方面，疗效明显优于其拆方益气健脾方和清热化湿方（ P ＜0.01或 P ＜0.05），提示益气健脾法、清热化湿法相结合在调节体液免疫反应上优于两种方法单独使用。另外，对照组药物尿毒清亦可有效提高模型大鼠血清IgG、C3水平（ P ＜0.01），降低其IgA、IgM及C4水平（ P ＜0.01），提示尿毒清同样具有调节体液免疫的作用，与健脾清化方比较，尿毒清对IgM、IgG、C3均值的影响稍优于健脾清化方，在对IgA均值的影响上则不如健脾清化方，由于数据离散度较大，以上各数据两组间均无明显统计学差异，该结果提示两者在调节体液免疫功能方面疗效类似。因此，健脾清化方能明显降低FSGS模型大鼠血清TC、TG、LDL、VLDL水平有效干预脂质代谢紊乱而延缓慢性肾脏病进展。健脾清化方能明显降低FSCS模型大鼠血清IgA、IgM及C4水平，升高IgG、C3水平，有效调节体液免疫功能。健脾清化方中的清热化湿药物对于调节脂质代谢紊乱、体液免疫反应起主要作用，其疗效优于益气健脾药物。清热化湿法、益气健脾法的联合使用在调节脂质代谢紊乱、体液免疫反应方面优于两种治法单独使用。
3. 对局灶节段性肾小球硬化模型大鼠肾组织病理及纤维化指标的影响 健脾清化方能够改善单侧肾切除联合多柔比星诱导局灶节段性肾小球硬化模型大鼠的肾功能、脂质代谢紊乱及体液免疫水平。通过前期临床研究还发现健脾清化方能够降低慢性肾衰患者的肾纤维化指标尿TGF β，那么，健脾清化方除了影响FSGS模型大鼠的肾功能、血脂等血液指标的水平，是否也可以改善FSGS模型大鼠的肾纤维化指标对抗肾纤维化进程呢？因此，采用HE染色、PAS染色、Masson染色的方法观察模型大鼠的肾组织病理变化，采用免疫组化观察肾纤维化指标四型胶原（Col Ⅳ）、层粘连蛋白（LN）、纤维连接蛋白（FN）、α平滑肌肌动蛋白（α SMA）及采用Western blot的方法观察TGF β1的变化，并研究健脾清化方的干预作用，从而明确健脾清化方是否可以在FSGS模型大鼠中发挥抗肾纤维化的作用。
（1）研究结果：各组大鼠肾组织病理改变。
1）HE染色：正常组、假手术组肾脏组织结构基本正常，未见肾小球局灶节段性硬化，肾小球毛细血管襻开放良好、面积正常，系膜区无增宽，系膜细胞无增生，基底膜无明显增厚、断裂，肾小管结构完整，上皮细胞排列整齐，间质无明显炎性浸润，偶见成纤维细胞；模型组肾脏组织结构紊乱，可见肾小球局灶节段性硬化，肾小球代偿性肥大、部分萎缩，毛细血管襻开放不良、面积减少甚至完全闭塞，系膜区增宽，系膜细胞增生，基底膜增厚、断裂，肾小管扩张、肿浊、部分灶状萎缩甚至闭塞，上皮细胞颗粒变性、空泡变性、坏死，肾小管内可见大量管型及红细胞，肾间质炎性浸润、纤维组织增生；健脾清化方组、尿毒清组病变明显轻于模型组，肾小球、肾小管结构较为完整，肾小球硬化明显减轻，系膜轻度增生，肾小管间质病变轻浅，小管内管型明显减少，纤维组织轻度增生；清热化湿组病变相对模型组亦有一定程度的改善，但不如健脾清化方组、尿毒清组明显；益气健脾组病变程度较模型组轻微改善，肾小球呈明显局灶节段性硬化，间质纤维化及炎性浸润程度较为严重。
2）PAS染色及半定量分析：正常组、假手术组肾小球系膜区、基底膜及肾小管基底膜的基质被染成紫红色，肾小球结构正常，系膜、基底膜基质无明显增生；模型组肾小球出现节段性硬化，系膜基质重度增生，基底膜及肾小管、间质内亦有不同程度的基质增生；健脾清化方组、尿毒清组病变较模型组明显减轻，系膜基质轻度增生，基底膜及肾小管、间质内基质增生也有一定程度的改善；清热化湿组系膜基质轻中度增生；健脾组系膜基质中、重度增生，相对模型组轻微改善。
半定量分析：与正常组相比，假手术组肾组织基质表达无明显差异；模型组肾组织基质表达水平与正常组相比显著升高（ P ＞0.01）；各治疗组肾组织基质表达水平与模型组相比均显著降低（ P ＞0.01），且健脾清化方组基质水平明显低于益气健脾组、清热化湿组（ P ＞0.01）；与益气健脾组相比，清热化湿组肾组织基质表达水平下降得更为明显（ P ＞0.01）；尿毒清组肾组织基质与健脾清化方组相比无明显差异（ P ＞0.01）。
3）Masson染色及半定量分析：正常组、假手术组肾小球系膜区、基底膜及肾小管基底膜的胶原成分被染成蓝色，胶原纤维无明显增多，其余肾组织未出现阳性染色；模型组肾小球系膜区胶原纤维大量沉积，肾小管和肾小管基底膜明显增厚，间质中亦可见胶原纤维增多；健脾清化方组、尿毒清组系膜区、小球基底膜和小管基底膜胶原轻度增多，胶原沉积程度较之模型组有明显改善，间质胶原亦少于模型组；清热化湿组肾小球、肾小管及间质中胶原纤维沉积与模型组比较有一定改善，但程度不如健脾清化方组、尿毒清组；益气健脾组改善则更轻微，肾小球系膜区、间质内均有大量胶原纤维沉积。
半定量分析：与正常组相比，假手术组肾组织胶原纤维表达无明显差异；模型组肾组织胶原纤维表达水平与正常组相比显著升高（ P ＜0.01）；各治疗组肾组织胶原纤维表达水平与模型组相比均显著降低（ P ＜0.01）；健脾清化方组肾组织胶原纤维水平明显低于益气健脾组、清热化湿组（ P ＜0.01）；清热化湿组肾组织胶原纤维表达水平与益气健脾组比较下降得更为明显（ P ＜0.01）；尿毒清组肾组织胶原纤维的表达水平与健脾清化方组相比无明显差异（ P ＜0.01）。
4）各组大鼠肾组织Col-Ⅳ、LN、FN、α-SMA的表达：与正常组相比，假手术组肾组织Col-Ⅳ、LN、FN、α-SMA表达无明显差异；模型组肾组织Col-Ⅳ、LN、FN、α-SMA水平与正常组相比明显升高（ P ＜0.01）；各治疗组肾组织Col-Ⅳ、IN、FN、α-SMA表达水平与模型组相比均明显降低（ P ＜0.01或 P ＜0.05）；健脾清化方组Col-Ⅳ、LN、FN水平明显低于益气健脾组、清热化湿组（ P ＜0.01或 P ＜0.05），其α SMA水平低于益气健脾组（ P ＜0.01）；与益气健脾组相比，清热化湿组肾组织Col Ⅳ、LN、FN及α SMA水平下降得更为明显（ P ＜0.01或 P ＜0.05）；尿毒清组肾组织Col-Ⅳ、LN、FN、α-SMA表达水平与健脾清化方组相比无明显差异（ P ＜0.01）。
5）各组大鼠肾组织TGF-β1的表达：与正常组相比，假手术组肾组织TGF-β1表达无明显差异；模型组肾组织TGF-β1水平与正常组相比明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组肾组织TGF β1水平显著下降（ P ＜0.01），清热化湿组、尿毒清组肾组织TCF-β1水平亦降低（ P ＜0.05），益气健脾组TGF-β1水平稍有下降，但无统计学意义（ P ＞0.05）；与益气健脾组比较，清热化湿组肾组织TGF β1表达水平明显下降（ P ＜0.05）；健脾清化方组TGF β1表达水平明显低于益气健脾组，其均值亦低于清热化湿组，但无统计学意义（ P ＞0.05），尿毒清组与健脾清化方组在TGF-β1表达水平上近似，组间比较无统计学差异（ P ＞0.05）。
6）扫描电镜观察各组大鼠肾脏病理：正常组、假手术组足突排列整齐，基底膜连续无增厚，上皮细胞连续排列整齐，线粒体无肿胀；模型组基底膜明显增厚，足突广泛融合，微绒毛排列紊乱，正常肾小球结构消失，大量间质细胞浸润；健脾清化方组基底膜稍有增厚，毛细血管壁轻度塌陷，肾小球结构紊乱；健脾方组系膜基质增生，毛细血管壁塌陷，线粒体肿胀，足突融合；清化方组毛细血管塌陷，基底膜增厚，内皮脱落，空泡形成，足细胞排列紊乱；尿毒清组基底膜增厚，足突融合，毛细血管塌陷，除正常组、假手术组，各组病理改变较健脾清化方组明显。
（2）讨论与分析
1）健脾清化方对模型大鼠肾脏病理的疗效：HE染色显示，模型组大鼠肾组织出现肾小球和肾小管的病理损伤，间质发生炎症反应，有明显的系膜和基底膜改变，PAS、Masson染色和Masson的半定量分析结果则显示模型组大鼠肾组织存在明显细胞外基质（ECM）积聚、胶原纤维沉积，且细胞外基质积聚的轻重程度与肾脏病理损伤的严重程度基本平行，提示模型造模成功，出现肾小球硬化及肾间质纤维化。与模型组相比，健脾清化方、尿毒清能够明显改善模型大鼠肾小球、小管及间质的结构，减轻炎症状态，减少ECM的积聚、胶原纤维的沉积和管型，故两者皆可有效改善肾脏病理损伤并对抗肾纤维化，在对病理改变的疗效方面健脾清化方、尿毒清效果接近。健脾清化方的拆方清热化湿方对于改善肾脏病理、抗肾纤维化的效果明显优于益气健脾方，与清热化湿方与益气健脾方对肾功能和蛋白尿的疗效基本相似，提示方中清热化湿药物对于改善肾脏病理损伤、纠正肾纤维化起主要作用。健脾清化方组改善肾脏病理、抗肾纤维化的效果优于益气健脾方和清热化湿方，提示清热化湿法、益气健脾法的联合使用在改善肾脏病理方面优于两种治法单独使用。
2）Col-Ⅳ、LN、FN与肾纤维化的关系及健脾清化方的干预作用：研究结果显示，模型组大鼠肾组织Col-Ⅳ、LN、FN的表达较正常组明显升高，提示模型大鼠肾组织存在明显的ECM增生，出现肾纤维化；经健脾清化方干预后，肾组织Col-Ⅳ、LN、FN水平明显降低（ P ＜0.01），表明健脾清化方能够改善模型大鼠肾脏Col-Ⅳ、LN、FN等纤维化指标，具有抗肾脏纤维化的作用；其拆方清热化湿方组、益气健脾组与模型组相比也有明显差异（ P ＜0.01或 P ＜0.05），但清热化湿组疗效优于益气健脾组（ P ＜0.01或 P ＜0.05），提示清热化湿法、益气健脾法均可改善模型大鼠的ECM积聚，但清热化湿药物的贡献更为突出；清热化湿方组、益气健脾组在改善Col Ⅳ、LN、FN表达上均不如健脾清化方组（ P ＜0.01或 P ＜0.05），提示清热化湿法、益气健脾法的结合使用在对抗肾纤维化方面起到相辅相成的作用，优于两种治法单独使用。另外，尿毒清组肾组织Col Ⅳ、LN、FN水平相对模型组亦明显降低（ P ＜0.01），且与健脾清化方组相比无明显差异（ P ＜0.01），提示尿毒清亦具有抗肾脏纤维化的作用。
3）α-SMA与肾纤维化的关系及健脾清化方的干预作用：研究结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肾组织α-SMA的表达明显升高，提示模型组大鼠肾组织存在明显的肌成纤维细胞的活化和增殖，在健脾清化方给药后，模型大鼠肾组织α SMA表达明显降低（ P ＜0.01），提示健脾清化方可以通过下调α SMA的表达抑制肌成纤维细胞的活化、增殖，从而达到抗肾纤维化的最终效果。其拆方清热化湿方、健脾益气方均可降低模型大鼠肾组织α SMA的表达（ P ＜0.01），但清热化湿组疗效优于益气健脾组（ P ＜0.05），提示方中益气健脾药物、清热化湿药物均可抑制肌成纤维细胞活化和增殖，但清热化湿药物对于抑制肌成纤维细胞活化、增殖作用更为显。尿毒清组肾组织α SMA水平相对模型组亦明显降低（ P ＜0.01），且与健脾清化方组相比无明显差异（ P ＜0.01），提示尿毒清也可以通过下调α SMA的表达来抑制肌成纤维细胞的活化、增殖，达到抗肾纤维化的目的。
4）TGF-β1与肾纤维化的关系及健脾清化方的干预作用：研究结果显示，模型大鼠肾组织TGF-β1较之正常组显著升高（ P ＜0.01），提示模型组大鼠存在明显的肾纤维化；经健脾清化方干预后，模型大鼠肾组织TCF-β1水平明显降低 P ＜0.01），提示健脾清化方可以有效影响TGF β1的表达水平，改善肾脏纤维化；其拆方清热化湿方、益气健脾方可不同程度降低模型大鼠肾组织TGF β1的表达水平（ P ＜0.01），但清热化湿组的TGF β1水平明显低于益气健脾组（ P ＜0.05），提示方中益气健脾药物、清热化湿药物均可通过抑制TGF β1的表达改善肾纤维化，但清热化湿药物在对抗肾纤维化的作用上更具优势。尿毒清组肾组织TGF β1水平相对模型组亦明显降低（ P ＜0.05），且与健脾清化方组相比无明显差异（ P ＜0.01），提示尿毒清也可以通过抑制TGF-β1的表达对抗肾纤维化的进程。因此健脾清化方能明显改善FSGS模型大鼠肾脏组织病理损伤，并能改善肾组织基质成分和胶原纤维增生等肾纤维化相关的病理特征，健脾清化方能明显降低FSGS模型大鼠肾组织Col-Ⅳ、LN、FN、α-SMA及TGF-β1等纤维化指标的表达，对抗肾纤维化的进程，健脾清化方中的清热化湿药物对于抗肾纤维化起主要作用，其疗效优于益气健脾药物，清热化湿法、益气健脾法的联合使用在对抗肾纤维化方面优于两种治法单独使用。
5）足细胞与肾纤维化的关系及健脾清化方的干预作用：透射电镜观察发现模型组和健脾方组均出现不同程度的足突融合，甚至模型组肾小球结构消失，健脾方组线粒体肿胀，清化方组和尿毒清组也出现上述不同病理表现，而健脾清化方组大鼠病理改变则明显减轻，仅见基底膜稍有增厚、毛细血管壁轻度塌陷、肾小球结构紊乱。说明健脾清化方在保护足细胞，保持肾小球内皮细胞功能的完整性，维持足突与基膜之间相互作用的平衡，保护细胞骨架，抑制MC增生的作用优于尿毒清及健脾方。
因此，足细胞损伤在肾小球疾病发生中起关键作用。MC有吞噬清除免疫复合物异常蛋白质等异物的能力。健脾清化方改善模型大鼠FSGS可能与该方保护足细胞，维持足细胞正常功能，抑制MC增生的作用有关。
4. 对局灶节段性肾小球硬化模型大鼠炎症因子的作用 健脾清化方不仅能够改善FSGS大鼠的肾功能状况，还可以改善肾脏组织病理损伤，影响多项肾脏纤维化指标的表达，具有良好的对抗肾纤维化的作用。那么，健脾清化法为何能够治疗肾纤维化，其中的具体机制如何，是否与改善模型大鼠炎症状态有关，其途径是单一的还是多元的？因此进一步采用ELISA、Western blot及Real-time PCR的方法，从蛋白及基因水平对血清及肾组织的部分炎症因子、核因子及其调控因子等进行观察研究，挖掘健脾清化方对抗FSGS模型大鼠肾纤维化的可能机制。
（1）研究结果
1）血清IL-6水平比较：与正常组相比，假手术组血清IL-6水平无明显升高，模型组血清IL-6水平明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，各治疗组血清IL-6水平均显著下降（ P ＜0.01）；健脾清化方组血清IL-6水平明显低于益气健脾组（ P ＜0.01），且其血清IL 6均值低于清热化湿组和尿毒清组，但尚无统计学意义（ P ＞0.05）；与益气健脾组比较，清热化湿组血清IL 6水平明显降低（ P ＜0.01）。
2）肾组织IL 6蛋白、IL 6mRNA水平比较：与正常组相比，假手术组肾组织IL 6蛋白、IL 6mRNA水平无明显升高，模型组肾组织IL 6蛋白、IL 6mRNA水平明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、清热化湿组、尿毒清组肾组织IL 6蛋白、IL 6mRNA水平明显下降（ P ＜0.01），益气健脾组肾组织IL 6蛋白水平亦有一定程度的下降，但无统计学意义（ P ＞0.05），IL-6mRNA水平明显下降（ P ＜0.01）；与益气健脾组相比，清热化湿组肾组织IL 6mRNA水平明显下降（ P ＜0.01），肾组织IL 6蛋白水平亦下降，但无统计学意义；健脾清化方组肾组织IL 6蛋白水平明显低于益气健脾组（ P ＜0.05），亦低于清热化湿组，但无统计学意义，IL 6mRNA水平明显低于益气健脾组、清热化湿组（ P ＜0.01或 P ＜0.05）；与健脾清化方组相比，尿毒清组IL 6蛋白水平较低，IL-6mRNA水平偏高，但无统计学意义。
3）肾组织IL 10蛋白、IL 10mRNA水平比较：与正常组相比，假手术组肾组织IL 10蛋白、IL 10mRNA水平无明显升高，模型组肾组织IL 10蛋白、IL 10mRNA水平明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，各治疗组肾组织IL 10蛋白、IL 10mRNA水平明显下降（ P ＜0.01）；与益气健脾组相比，清热化湿组肾组织IL 10蛋白水平明显下降（ P ＜0.01），IL 10mRNA水平无明显差异；健脾清化方组肾组织IL 10蛋白、IL-10mRNA水平明显低于其余各治疗组（ P ＜0.01或 P ＜0.05）。
4）肾组织IL 18蛋白、IL 18mRNA水平比较：与正常组相比，假手术组肾组织IL 18蛋白、IL 18mRNA水平无明显升高，模型组肾组织IL 18蛋白、IL 18mRNA水平明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、清热化湿组、尿毒清组肾组织IL 18蛋白、IL 18mRNA水平明显下降（ P ＜0.01），益气健脾组肾组织IL 18蛋白水平亦有下降（ P ＜0.05），IL 18mRNA水平明显下降（ P ＜0.01）；与益气健脾组相比，清热化湿组肾组织IL 18蛋白、IL 18mRNA水平明显下降（ P ＜0.01）；健脾清化方组肾组织IL 18蛋白、IL 18mRNA水平明显低于益气健脾组、清热化湿组（ P ＜0.01）；与健脾清化方组比，尿毒清组IL 18蛋白、IL 18mRNA的均值水平稍高，但无统计学意义。
5）肾组织TNF α蛋白、TNF αmRNA水平比较：与正常组相比，假手术组肾组织TNF α蛋白、TNF αmRNA水平无明显升高，模型组肾组织TNF α蛋白、TNFαmRNA水平明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、清热化湿组、尿毒清组肾组织TNF α蛋白、TNF αmRNA水平明显下降（ P ＜0.01），益气健脾组TNF α蛋白、TNF-αmRNA水平有一定程度下降，但无统计学意义（ P ＞0.05）；与益气健脾组相比，清热化湿组肾组织TNF α蛋白、TNF αmRNA水平明显下降（ P ＜0.01或 P ＜0.05）；健脾清化方组肾组织TNF α蛋白、TNF αmRNA水平明显低于益气健脾组、清热化湿组（ P ＜0.01）；与健脾清化方组相比，尿毒清组TNF αmRNA均值稍高，但无统计学意义。
6）肾组织P NF κBp65蛋白、NF κBp65mRNA水平比较：与正常组相比，假手术组肾组织P NF κBp65蛋白、NF κBp65mRNA水平无明显升高，模型组肾组织P NF κBp65蛋白、NF κBp65mRNA水平明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、尿毒清组肾组织P NF κBp65蛋白、NF κBp65mRNA水平明显下降（ P ＜0.01或 P ＜0.05），清热化湿组NF κBp65mRNA水平明显下降，P NF κBp65蛋白水平亦有一定程度下降，但无统计学意义，益气健脾组肾组织P NF κBp65蛋白无降低，其NF κBp65mRNA水平稍有下降，但无统计学意义（ P ＞0.05）；与益气健脾组相比，清热化湿组肾组织NF κBp65mRNA水平明显下降（ P ＜0.01），P NF κBp65蛋白水平亦有一定程度下降，但无统计学意义；健脾清化方组肾组织P NF κBp65蛋白水平明显低于益气健脾组（ P ＜0.01），其均值亦低于清热化湿组，但无统计学意义，其NFκBp65mRNA水平明显低于益气健脾组、清热化湿组（ P ＜0.01）；尿毒清组肾组织P NF κBp65蛋白、NF κBp65mRNA水平稍高于健脾清化方组，但无统计学意义。
7）肾组织TRAF6蛋白、TRAF6mRNA水平比较：与正常组相比，假手术组肾组织TRAF6蛋白、TRAF6mRNA水平无明显升高，模型组TRAF6蛋白、TRAF6mRNA水平明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、尿毒清组TRAF6 蛋白、TRAF6mRNA水平明显下降（ P ＜0.01或 P ＜0.05），益气健脾组、清热化湿组TRAF6蛋白水平有不同程度的下降，但无统计学意义（ P ＞0.05），TRAF6mRNA水平均明显下降（ P ＜0.01）；与益气健脾组相比，清热化湿组TRAF6蛋白、TRAF6mRNA水平稍低，但无统计学意义；健脾清化方组TRAF6mRNA水平明显低于益气健脾组、清热化湿组（ P ＜0.01或 P ＜0.05），TRAF6蛋白水平亦稍低于益气健脾组、清热化湿组，但无统计学意义；与健脾清化方组相比，尿毒清组TRAF6蛋白、TRAF6mRNA水平稍高，但无统计学意义。
（2）讨论与分析
1）致炎因子能够启动和促进肾脏的炎症损伤，抗炎因子能够促进炎症消散和组织修复，无论是致炎因子、抗炎因子或是具有双向调节功能的炎症因子在炎症反应的发生发展中均发挥着关键的作用。本研究选用目前研究较多的TNF-α、IL-6及研究较少的IL 10、IL 18进行观察，结果发现，模型组大鼠血清IL 16水平和肾组织中IL 6蛋白、IL 10蛋白、IL 18蛋白、TNF α蛋白及IL 6mRNA、IL 10mRNA、IL 18mRNA、TNF-αmRNA的水平与正常组相比明显升高，提示单侧肾切除联合多柔比星诱导局灶节段性肾小球硬化模型大鼠外周血及肾组织存在明显的炎症反应，肾组织中IL 10蛋白、IL 10mRNA水平的升高还表明在炎症反应过程中，致炎因子和抑炎因子表达水平均有上调，两者在相对平衡中共同参与肾脏疾病过程；经药物干预后，健脾清化方组各炎症指标均明显下降，提示健脾清化方能通过降低IL-6、IL-18、TNF-α等炎症介质的表达来改善模型大鼠的全身及肾组织的炎症损伤。由于炎症损伤的改善，抗炎因子IL 10亦相应分泌减少。其拆方清热化湿方、益气健脾方对于改善以上炎症因子亦有不同的疗效（ P ＜0.01或 P ＜0.05），与益气健脾方相比，清热化湿方在降低大多数炎症指标上有更明显的效果（ P ＜0.01或 P ＜0.05），此结果提示清热化湿药物在通过降低炎症介质来改善肾脏炎症状态方面具有比益气健脾类药物更好的疗效。另外，健脾清化方组炎症介质的表达明显低于益气健脾组和清热化湿组（ P ＜0.01或 P ＜0.05），提示益气健脾法、清热化湿法联合运用对于改善肾脏炎症优于采用单一治法。尿毒清组各炎症指标亦明显下降，但大部分炎症指标均高于健脾清化方组，由于数据离散度较大，两组间并无明显统计学差异，该结果提示尿毒清亦可以通过降低炎症介质来改善肾脏炎症状态，但其作用不如健脾清化方。
2）脂质代谢紊乱与炎症的关系及健脾清化方的干预作用：健脾清化方及其拆方清热化湿方、健脾益气方、尿毒清能够有效降低FSGS模型大鼠各项血脂指标，结合炎症因子的改变情况，提示健脾清化方及其拆方、尿毒清能够通过干预脂质代谢紊乱达到缓解肾组织炎症的目的。在该作用中，清热化湿药物的疗效优于益气健脾药物，而益气健脾法、清热化湿法的联合运用则比采用单一治法具有更好的疗效。
3）血清补体、免疫球蛋白与炎症的关系及健脾清化方的干预作用：健脾清化方及其拆方清热化湿方、健脾益气方、尿毒清能够有效干预FSGS模型大鼠的血清补体及免疫球蛋白水平，具有调节体液免疫的作用，结合本部分炎症介质水平的改善，提示健脾清化方及其拆方、尿毒清能够通过调节体液免疫减轻肾组织的炎症损伤。在该作用中，清热化湿药物具有更多的贡献，而益气健脾法、清热化湿法相结合运用优于两种方法单独使用。
4）TRAF6对NF κBp65的活化作用与炎症的关系及健脾清化方的干预作用：实验结果显示，模型大鼠模型组大鼠肾组织中P NF κBp65蛋白、NF κBp65mRNA、TRAF6蛋白、TRAF6mRNA的水平与正常组相比明显升高，提示模型大鼠中存在TRAF6表达上调引起的NF-κB的激活；经药物治疗后，健脾清化方组肾组织P-NF-κBp65蛋白、NF κBpe5mRNA、TRAF6蛋白、TRAF6mRNA水平均明显下降（ P ＜0.01或 P ＜0.05），结合炎症介质的变化，提示健脾清化方能通过降低TRAF6水平实现对其活化NF κB作用的抑制，减轻模型大鼠的炎症反应。其拆方清热化湿方、益气健脾方亦能不同程度地降低肾组织P NF κBp65蛋白、NF κBp65mRNA、TRAF6蛋白、TRAF6mRNA水平（ P ＜0.01或 P ＜0.05），但部分指标的降低程度与健脾清化方组相比有明显差异（ P ＜0.01或 P ＜0.05），提示益气健脾法、清热化湿法同用对于抑制TRAF6对NF κB的激活优于采用单一治法。清热化湿组P NF κBp65蛋白NFκBp65mRNA、TRAF6蛋白、TRAF6mRNA水平相比益气健脾组较低（ P ＜0.01），提示健脾清化方中清热化湿药物在抑制NF κB激活方面优于益气健脾药物。尿毒清组肾组织P NF κBp65蛋白、NF κBp65mRNA、TRAF6蛋白、TRAF6mRNA水平亦明显下降（ P ＜0.01或 P ＜0.05），但其水平稍高于健脾清化方组，由于数据离散度的原因，两组间尚无统计学差异，提示健脾清化方通过降低TRAF6抑制NF-κB活化的作用优于尿毒清。
5）健脾清化方抗肾纤维化的机制：健脾清化方能够通过改善炎症介质、干预脂质代谢紊乱调节体液免疫及抑制TRAF6对NF-κB的激活而改善肾脏炎症，基于炎症与纤维化的关系，提示健脾清化方是通过以上多种途径改善肾脏炎症状态，最终实现其抗肾纤维化的作用。
健脾清化方能够有效降低FSGS模型大鼠血肌酐、尿素氮水平，改善其肾功能；健脾清化方能够有效干预模型大鼠脂质代谢紊乱、调节体液免疫、改善肾脏炎症及纤维化，基于脂质代谢紊乱、体液免疫损伤、肾脏炎症反应均可导致肾脏损害、引起肾功能减退，本研究提示健脾清化方改善肾功能的机制可能与其干预脂质代谢紊乱、调节体液免疫、减轻肾脏炎症反应有关。因此健脾清化方能通过有效降低多种炎症介质、抑制TRAF6对NF-κB的活化改善FSGS模型大鼠肾脏炎症反应。健脾清化方抗肾纤维化的机制可能与其降低炎症介质、干预脂质代谢紊乱、调节体液免疫、抑制NF-κB的活化，从而多途径改善炎症状态有关。健脾清化方中的清热化湿药物对于改善肾脏炎症反应起主要作用，其疗效优于益气健脾药物。清热化湿法、益气健脾法的联合使用在改善肾脏炎症反应方面优于两种治法单独使用。
5. 抑制局灶节段性硬化大鼠成纤维细胞增生研究 细胞外基质（extracellular matrix，ECM），是由细胞合成并分泌到胞外，分布在细胞表面或细胞之间的大分子多糖和蛋白。当ECM合成与降解之间动态失衡，大量ECM积聚，沉积于肾小球、肾间质，致使肾脏血管堵塞，导致肾小球硬化。定量逆转录-聚酶链反应（quantitative reversetranscription-polymerase chain reaction，qRT PCR）是对组织和细胞进行目的基因表达的检测方法，是目前常用的分子水平检测手段，与其他检测方法相比有灵敏、快速、准确的优点。某些因素的刺激可活化成纤维细胞并使其发生表型和功能的转化，转变为表达肾小管间质骨架蛋白α平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin，α SMA）的肌成纤维细胞（myofibroblast，MyoF），肌成纤维细胞分泌的纤维连接蛋白（fibronectin，FN）为其他胶原纤维的形成和基质成分的沉积提供支架。为进一步观察该方影响成纤维细胞活化并抑制其向肌成纤维细胞转化作用，应用左侧肾切除加尾静脉注射多柔比星建立大鼠肾脏局灶节段性硬化（focal segmental glomerulosclerosis，FSGS）模型，从分子水平探讨健脾清化方对多柔比星致肾脏FSGS模型大鼠肾纤维化的影响，进一步探讨健脾清化方改善肾纤维化的机制。
（1）研究结果：定量RT-PCR检测各组大鼠肾小管间质α-SMAmRNA、Col-ⅢmRNA、FNmRNA、Col-ⅣmRNA的影响：治疗56日后，与正常组相比，模型组大鼠肾小管间质α-SMAmRNA、Col-ⅢmRNA、FNmRNA、Col-ⅣmRNA相对荧光值明显-升高（ P ＜0.01）；健脾清化方组、健脾方组、清化方组、尿毒清组与模型组相比αSMAmRNA相对荧光值明显降低（ P ＜0.01），健脾清化方组明显低于尿毒清组（ P ＜0.01）；健脾清化方组、清化方组、尿毒清组与模型组相比，Col-ⅢmRNA相对荧光值明显降低（ P ＜0.01），健脾清化方组明显低于尿毒清组（ P ＜0.01）；健脾清化方组、清化方组与模型组相比，FNmRNA相对荧光值明显降低（ P ＜0.01），健脾清化方组明显低于尿毒清组（ P ＜0.01）；健脾清化方组、清化方组、尿毒清组与模型组相比Col-ⅣmNA相对荧光值明显降低（ P ＜0.01），健脾清化方组明显低于尿毒清组（ P ＜0.01）；与健脾方比较，健脾清化方组、清化方组α-SMAmRNA、Col-ⅢmRNA、FNmRNA、Col-ⅣmRNA明显降低（ P ＜0.01）；组间无统计学差异（ P ＞0.05）。
（2）讨论与分析：以健脾清化湿热为治疗原则的健脾清化方是我们的临床经验方，在临床用于治疗慢性肾衰患者。该方由党参、生黄芪、草果、苍术、黄连、制大黄组成，具健脾益气、清热化湿之功。关于该方的临床疗效、抗氧化、抗炎、改善肾功能、改善肾脏病理、抑制免疫炎症等相关研究在文献中有相关报道。实验结果提示，与模型组相比，健脾清化方组可明显降低α SMAmRNA，明显抑制成纤维细胞向MyoF的转变，减少MyoF的分泌；健脾清化方明显降低FNmRNA，对FN这一始动因素的抑制，可减少Col Ⅳ的形成，而实验结果中该方可明显较少Col-ⅣmRNA的含量，与其抑制了始动因素的结果一致，并可减少ECM的沉积；同时健脾清化方可抑制Col-ⅢmRNA的升高，减少ECM的聚集。健脾清化方干预后，肾功能明显改善，α-SMA、FN、Col-Ⅲ及Col-Ⅳ明显下降，在肾功能改善的同时，成纤维细胞的激活也受到抑制，说明肾小管损伤、间质纤维化程度与肾功能的改善水平有关。健脾清化方对以上各指标的抑制效果优于尿毒清和健脾方。
成纤维细胞被某些因子激活转化为高表达α SMAmRNA的MyoF，加之Col Ⅲ的高表达，两者的共同结果加重ECM的沉积；MyoF首先分泌的FN不仅可刺激ECM合成增多，还可诱导Col Ⅳ的生成，加重肾小球的硬化。对动物模型的研究表明，健脾清化方不仅可以改善模型大鼠肾功能，还可抑制其肾间质纤维化及肾小球硬化的进程，该结果可能与健脾清化方抑制成纤维细胞的激活，减少α SMA、Col Ⅲ高表达及由于成纤维细胞的激活转化产生的MyoF数量，进而降低分泌ECM的能力、减少肾小球硬化及肾间质纤维化的始动因素FN，减少Col Ⅳ的形成降低ECM的合成有关。而且健脾清化法优于健脾法。
6. 抑制局灶节段性硬化大鼠 NF κB 及下游因子过度活化的研究 核因子NFκB（nuclear factor kappa B，NF κB）的活化可促进其主要下游因子肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）的表达，TNF-α是早期炎症反应的重要介质。TNF的下游因子TRAF6是肿瘤坏死因子受体相关因子（tumor necrosis factor recep-torassociated factors，TRAF）家族中唯一可以直接与NF κB受体激活因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）相结合的信号分子，在Tol样受体（Toll-like receptors，TLR）介导的信号转导途径激活NF κB，TRAF6是激活NF κB通路和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路的交叉点。以上3种互为上下游关系的因子相互作用，扩大了对肾纤维化的作用。对Platt模型大鼠使用健脾清化方后发现，该方不仅对模型大鼠的肾功能和蛋白尿有明显改善，而且对p38MAPK免疫炎症通路也有明显抑制作用。为进一步观察该方对NF-κB通路的影响，研究从抑制NF-κB激活角度，探讨健脾清化方对多柔比星致局灶节段硬化肾病模型大鼠FSGS的影响，进一步探讨健脾清化方改善肾纤维化的机制。
（1）研究结果
1）Western blot法检测各组大鼠肾组织P NF κBp65的表达：P NF κBp6在肾组织均有表达，在肾间质表达更明显。与正常组相比，模型组大鼠肾小管间质P-NF-κB65表达明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、清化方组明显下降（ P ＜0.01），尿毒清组较模型组下降（ P ＜0.05）；健脾清化方组、清化方组较尿毒清组下降（ P ＜0.05）；与健脾方组相比，健脾清化方组、清化方组P-NF-κB65表达明显下降（ P ＜0.01）；组间差异无统计学意义（ P ＞0.05）。
2）Western blot法检测各组大鼠肾小管间质TNF-α的表达：与正常组相比，模型组大鼠肾小管间质TNF-α表达明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、健脾方、清化方组明显下降（ P ＜0.01）；与尿毒清组相比，健脾清化方组明显下降（ P ＜0.01），健脾方组、清化方组较尿毒清组下降（ P ＜0.05）；与健脾方相比，健脾清化方表达降低（ P ＜0.05）；组间差异无统计学意义（ P ＞0.05）。
3）Western blot法检测各组大鼠肾小管间质TRAF6的表达：与正常组相比，模型组大鼠肾小管间质TRAF6表达明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、健脾方组、清化方组下降（ P ＜0.05）；健脾清化方组较尿毒清组下降（ P ＜0.05）；组间差异无统计学意义（ P ＞0.05）。
（2）讨论与分析：具健脾益气、清热化湿之功的健脾清化方在改善临床慢性肾衰患者肾功能及蛋白尿方面取得明显疗效，此结果与抑制NF κB活性可降低肾病大鼠的尿蛋白的研究结果一致。健脾清化方组、清化方组P NF κBp65明显低于模型组，效果优于尿毒清组和健脾方组，提示健脾清化方可以抑制NF κBp炎症通路的激活。狼疮性肾炎、UUO动物模型中发现，NF-κB的活化与肾小管间质损伤呈正相关；给子NF-κB抑制剂后，5／6肾切除模型大鼠上调的NF κBp下降，肾间质慢性炎症的病理改变和炎症细胞浸润明显减轻。健脾清化方对NF κBp炎症通路的抑制可能是其改善模型大鼠肾纤维化的途径之一，而且健脾清化效果最佳。
健脾清化方中药单体如大黄酚、大黄素、大黄酸、黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、党参炔苷可抑制活化的肾成纤维细胞株和系膜细胞株的增殖，有效防治肾纤维化。健脾清化方改善肾纤维化的作用可能是通过抑制NF-κB通路激活，减少下游因子TNF-α的基因转录，降低TRAF6的表达，阻止TNF-α对NF-κB的再次激活有关。
7. 抑制局灶节段性硬化大鼠 IL 6、MCP 1、ICAM 1 的研究 IL 6主要通过JAK／STAT途径、Ras／ErK途径等信号转导通路发挥生物学功能。有研究表明血清IL-6水平与BUN、Scr明显相关，IL-6可诱导单核巨噬细胞产生MCP-1，参与调节ICAM-1的表达和其他促炎细胞因子产生。由于免疫失调可引起炎症改变，为进一步从炎症角度探讨健脾清化方的作用，我们从阻断炎症细胞生物功能角度，探讨健脾清化方对多柔比星致大鼠FSGS的影响，进一步探讨健脾清化方改善肾纤维化的机制。
（1）研究结果
1）Western blot法检测各组大鼠肾小管间质IL-6的表达
与正常组相比，模型组大鼠肾小管间质IL-6表达明显升高 P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、健脾方组、清化方组、尿毒清组明显下降（ P ＜0.01）；与健脾方组相比，健脾清化方组、清化方组IL-6水平降低（ P ＜0.05）；健脾清化方组与尿毒清组比较无统计学意义（ P ＞0.05）；组间差异无统计学意义（ P ＞0.05）。
2）Western blot法和免疫荧光法检测各组大鼠肾小管间质MCP-1表达
Western blot法：与正常组相比，模型组大鼠肾小管间质MCP-1表达明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、健脾方组、清化方组、尿毒清组明显下降（ P ＜0.01）；健脾清化方组较尿毒清组下降（ P ＜0.05）；与健脾方组相比，健脾清化方组、清化方组MCP-1表达下降（ P ＜0.01， P ＜0.05）；组间差异无统计学意义（ P ＞0.05）。
免疫荧光法：除正常组及假手术组，其余各组MCP-1在肾小管、肾小球系膜区均有不同程度表达，呈现红色荧光。与正常组相比，模型组大鼠肾小管间质MCP-1荧光强度明显增强，其表达明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、健脾方组、清化方组、尿毒清组荧光强度明显减弱，其表达明显降低（ P ＜0.01）；与尿毒清组比较，健脾清化方组、清化方组荧光强度明显减弱，其表达明显降低（ P ＜0.01）；与健脾方组相比，健脾清化方组、清化方组荧光强度明显减弱，其表达明显降低（ P ＜0.01）；组间差异无统计学意义（ P ＞0.05）。
3）Western blot法和免疫荧光法检测各组大鼠肾小管间质ICAM-1表达
Western blot法：与正常组相比，模型组大鼠肾小管间质ICAM-1表达明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、清化方组、尿毒清组明显下降（ P ＜0.01），健脾方组较模型组下降（ P ＜0.05）；健脾清化方组较尿毒清组下降（ P ＜0.05）；与健脾方组相比，健脾清化方组ICAM-1表达明显下降（ P ＜0.01），清化方组ICAM-1表达下降（ P ＜0.05）；组间差异无统计学意义（ P ＞0.05）。
免疫荧光法：除正常组及假手术组，其余各组ICAM-1在肾小管、肾间质、肾小球系膜区均有不同程度表达，呈现绿色荧光。与正常组相比，模型组大鼠肾小管间质ICAM-1荧光强度明显增强，其表达明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、健脾方组、清化方组、尿毒清组荧光强度明显减弱，其表达明显降低（ P ＜0.01）；与尿毒清组比较，健脾清化方组、清化方组荧光强度明显减弱，其表达明显降低（ P ＜0.01）；与健脾方组相比，健脾清化方组、清化方组荧光强度明显减弱，其表达明显降低（ P ＜0.01）；组间差异无统计学意义（ P ＞0.05）。
（2）讨论与分析：在临床对慢性肾衰患者的治疗中发现，健脾清化方可明显改善患者肾功能、蛋白尿，且有抗炎、抗氧化和改善肾脏病理的作用，临床疗效显著。在对Plat模型大鼠和多柔比星所致FSGS模型大鼠的研究中发现，健脾清化方可明显改善模型大鼠肾功能和蛋白尿，通过清化湿热法抑制3条重要细胞通路中的NF κB和MAPK炎症通路，改善FSGS大鼠的炎症损伤，延缓肾纤维化的进程。实验提示健脾清化方可明显降低Platt模型大鼠肌酐和尿素氮水平。实验中我们发现健脾清化方组、健脾方组、清化方组、尿毒清组IL-6表达明显低于模型组，且健脾清化方组的效果优于健脾方组。实验表明，健脾清化方组、健脾方组、清化方组、尿毒清组MCP-1表达较模型组明显下降，且健脾清化方组优于尿毒清组和健脾方组。实验结果提示健脾清化方组、清化方组、尿毒清组ICAM-1的表达与模型组相比明显下降，健脾方组低于模型组，且健脾清化方组效果优于尿毒清组和健脾方组。通过激光共聚焦显微镜观察提示，健脾清化方组、健脾方组、清化方组、尿毒清组MCP-1、ICAM-1荧光强度表达与模型组相比明显减弱，健脾清化方组、清化方组荧光强度表达明显低于尿毒清组；与健脾方组相比，健脾清化方组、清化方组荧光强度明显减弱，其表达明显降低。
实验中对MCP-1、ICAM-1分别采用了Western blot和免疫荧光两种方法进行了检测，其中Western blot法是在蛋白水平对其进行检测，而免疫荧光是显示组织内抗原的方法。我们在两个不同层面对MCP 1、ICAM 1检测的结果一致，提示在蛋白和分子水平上，上述两个指标的表达是一致的，提示其参与组织炎症反应在分子和蛋白水平都有表达。
IL-6诱导单核巨噬细胞产生MCP-1，诱导B细胞产生抗体促进细胞毒性细胞形成，进一步加重血管的炎性反应。MCP 1的增加会引起巨噬细胞的聚集和活化，释放炎症介质和细胞因子，同时促进系膜细胞分泌纤维连接蛋白，介导肾小球硬化、间质纤维化。受MCP-1调控的ICAM-1是诱导炎性细胞向肾间质组织浸润的主要黏附分子。健脾清化方的效果优于尿毒清和健脾方，说明健脾清化法优于通腑降浊法和健脾法。该方明显降低IL-6、MCP-1和受MCP-1调控的ICAM-1的表达，改善肾纤维化的进程，可能与其终止IL-6信号通路、阻断IL-6发挥生物学效应，减轻由MCP-1、ICAM-1的增加引起的肾纤维化的同时又具健脾清化的作用有关。
8. 调节局灶节段性硬化大鼠 Th17 细胞免疫的研究 细胞免疫参与并介导局灶节段性硬化（focal segmental glomerulosclerosis，FSGS），其介导的肾脏损伤是肾小球疾病的始发因素，并导致肾小球炎症及纤维化，是肾纤维化重要的发病机制之一。免疫功能低下是中医脾虚证的病理变化之一，此免疫功能异常主要为细胞免疫功能低下。T淋巴细胞是细胞免疫的主要细胞，CD4 ＋ 和CD8 ＋ 显著降低时T淋巴细胞总数降低。免疫介导的肾小球疾病与T淋巴细胞功能紊乱相关，其中CD4 ＋ T细胞平衡紊乱、Th17细胞功能改变与该疾病关系更为密切、T细胞功能紊乱可能是肾小球病的发病机制之一。研究从细胞免疫介导的炎症损伤角度，观察了健脾清化方对模型大鼠FSGS的影响，以进一步探讨健脾清化方改善肾纤维化的机制。
（1）研究结果
1）定量RT-PCR检测各组大鼠肾小管间质IL-17 AmRNA相对荧光值：治疗56日后，与正常组相比，模型组、健脾方组、尿毒清组大鼠肾小管间质IL-17 AmRNA相对荧光值明显升高（ P ＜0.01）；健脾清化方组、清化方组与模型组相比，IL-17 AmRNA相对荧光值明显降低（ P ＜0.01），尿毒清组与模型组相比，IL-17 AmRNA相对荧光值降低（ P ＜0.05），健脾清化方组、清化方组明显低于尿毒清组（ P ＜0.01）；与健脾方组比较，健脾清化方组、清化方组IL-17 AmRNA相对荧光值明显降低（ P ＜0.01）；组间无统计学差异（ P ＞0.05）。
2）流式细胞术检测各组大鼠脾淋巴细胞CD4 ＋ ／CD8 ＋ 值：模型组与正常组和假手术组相比，CD4 ＋ ／CD8 ＋ 值升高（ P ＜0.01）；健脾清化方组CD4 ＋ ／CD8 ＋ 值低于模型组（ P ＜0.05）；与健脾方组相比，健脾清化方组CD4 ＋ ／CD8 ＋ 值降低（ P ＜0.05）；健脾清化方组与尿毒清组相比，无统计学意义（ P ＞0.05）；余组间差异无统计学意义（ P ＞0.05）。
3）流式细胞术检测各组大鼠Th17百分比：与正常组相比，模型组CD4 ＋ 、IL-17 A、Th17百分比明显升高（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、健脾方组、清化方组、尿毒清组CD4 ＋ 百分比明显降低（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组、健脾方组、清化方组、尿毒清组IL-17 A百分比明显降低（ P ＜0.01）；与尿毒清组相比，健脾清化方组IL-17 A百分比降低（ P ＜0.05）；与模型组相比，健脾清化方组、清化方组、尿毒清组Th17百分比明显降低（ P ＜0.01），健脾方组Th17百分比降低（ P ＜0.05）；与尿毒清组相比，健脾清化方组Th17百分比明显降低（ P ＜0.01），清化方组Th17百分比降低（ P ＜0.05）；与健脾方组比较，健脾清化方组、清化方组IL-17 A、Th17百分比明显降低（ P ＜0.01）；组间无统计学差异（ P ＞0.05）。
（2）讨论与分析：实验结果显示，健脾清化方组与模型组相比CD4 ＋ ／CD8 ＋ 值明显降低，可明显抑制CD4 ＋ 、CD8 ＋ 的激活。CD4 ＋ ／CD8 ＋ 值增高见于自身免疫性疾病、恶性肿瘤病毒性感染、变态反应等。FSGS肾组织（肾实质）中T淋巴细胞增多，以CD8 ＋ 为主，间质中T淋巴细胞和单核／巨噬细胞浸润，以CD4 ＋ 为主，且处于激活状态。机体有赖于各T细胞亚群维持一定的比例来维持正常的免疫功能状态，淋巴细胞亚群CD4 ＋ ／CD8 ＋ 值是反映机体免疫紊乱的敏感指标。健脾清化方对CD4 ＋ ／CD8 ＋ 值的影响提示该方对细胞免疫有一定的调节作用。
在Th17的观察中提示，与模型组相比，健脾清化方组、健脾方组、清化方组、尿毒清组Th17百分比明显降低；与尿毒清组相比，健脾清化方组Th17百分比明显降低，清化方组Th17百分比降低。Th17可分泌炎症因子IL-17A，健脾清化方对Th17的抑制，可能减少IL-17A的分泌。同时健脾清化方组、清化方组与模型组相比，IL-17 AmRNA相对荧光值、IL-17A百分比明显降低，尿毒清组与模型组相比，IL-17 AmRNA相对荧光值降低，IL-17A百分比明显降低；与尿毒清组相比，健脾清化方组IL-17 AmRNA相对荧光值、IL-17A百分比明显降低。健脾清化方对IL-6、IL-17 AmRNA相对荧光值和IL-17A百分比的抑制，可能与健脾清化方对与细胞介导的自身免疫性、炎性疾病相关的Th17的抑制有关。Th17淋巴细胞的成熟是在转化生长因子β（TGF β）和IL 6共存时，TGF β诱导Th17细胞的大量形成，在TGF β和IL 6共同诱导下分化成的Th17分泌IL-17和IL-6，参与炎症反应和自身免疫性疾病。因此，健脾清化方改善多柔比星肾病模型大鼠FSGS的结果可能与健脾清化方抑制Th17，减少炎症因子IL-17A的分泌有关。IL-17是T细胞诱导的炎症反应的早期启动因子，可以通过促进释放前炎性细胞因子来放大炎症反应，它的主要生物学效应是促进炎症反应，IL-17A的抑制说明健脾清化方可抑制炎症反应的早期启动因子，阻止炎症反应的放大。
中医认为“脾旺不受邪”“脾胃所伤，百病由生”，说明脾与免疫关系密切，脾虚证的病理变化之一为免疫功能的低下，主要表现为T细胞免疫低下和T细胞网络紊乱。现代研究提示脾虚时淋巴细胞增殖降低，免疫功能下降。实验中我们将健脾清化方拆方后，组成清化方和健脾方，清化方以清热化湿为主，健脾方以健脾益气见长，而健脾清化方则兼顾两方之治法，研究中发现与健脾方组比较，健脾清化方组、清化方组IL-17 AmRNA相对荧光值和IL-17A、Th17百分比明显降低，健脾清化方组CD4 ＋ ／CD8 ＋ 值下降。健脾清化方和清化方在抑制T淋巴细胞和成纤维细胞激活、改善肾脏纤维化方面的效果好于健脾方。健脾方只有健脾益气之功而无清化湿热之力，健脾方对模型大鼠的效果逊于具有清热化湿功效的健脾清化方和清化方，且具有清热化湿、健脾益气功效的健脾清化方效果最好。因此，在FSGS大鼠模型的治疗中，仅用健脾益气之法不能奏效，必须兼有清热化湿之力。健脾清化法在调节细胞免疫、抑制炎症反应、改善肾纤维化方面的作用明显。
T细胞介导的免疫发病机制中其效应细胞主要为单核／巨噬细胞，当FSGS时，肾组织和肾间质中的T淋巴细胞和单核／巨噬细胞增多，CD4 ＋ 、CD8 ＋ 处在激活状态。在分化与调节上，Th17细胞与具有显著免疫抑制效应的调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）反向调节关系密切。在功能上，Th17细胞及其细胞因子介导炎症反应，在感染炎症、自身免疫性疾病及移植物抗宿主病中发挥着重要作用。健脾清化方不仅可改善临床慢性肾脏病患者的肾功能及蛋白尿，而且同时可以通过抑制细胞免疫介导的炎症反应，健脾清化方对CD4 ＋ ／CD8 ＋ 值的抑制效果，说明其对模型大鼠FSGS的作用，可能是通过抑制T淋巴细胞的激活，抑制细胞免疫介导的炎症损伤的途径，并且通过清热化湿法调节细胞免疫，改善肾脏纤维化。Th17是T淋巴细胞两大亚群中CD4 ＋ 亚群的效应淋巴细胞，同时参与炎症因子IL-17的调节，为细胞免疫介导的炎症损伤的重要环节。该方改善大鼠肾功能、肾间质纤维化及肾小球硬化可能是健脾清化方通过对与细胞介导的自身免疫性、炎性疾病相关的Th17的抑制，使CD4 ＋ 、CD8 ＋ 得到调节，抑制炎症早期启动因子IL-17A的分泌有关。健脾清化方通过调节细胞免疫进而抑制炎症反应早期启动因子，使肾脏的早期炎症得到改善，阻止炎症反应放大的途径。健脾清化法在上述作用中表现了明显的优势。因此健脾清化方不仅可以改善模型大鼠肾功能和蛋白尿，还可抑制其肾间质纤维化及肾小球硬化的进程。作用机制可能通过下面4条途径：与健脾清化方抑制成纤维细胞的激活，降低分泌ECM的能力，抑制肾小球硬化及肾间质纤维化的始动因素（FN），减少ColⅣ的形成和ECM的合成有关。可能是通过抑制NF κB通路激活，降低下游因子TNF-α、TRAF6的表达，阻止TNF-α对NF-κB的再次激活。通过抑制IL-6信号通路及IL-6生物学效应，减少由IL-6刺激产生的炎症因子（MCP-1、ICAM 1）的生成。与调节细胞免疫，抑制Th17及调节CD4 ＋ 、CD8 ＋ 的平衡，抑制炎症早期启动因子IL-17A的分泌，使肾脏的早期炎症得到改善，阻止炎症反应放大，改善模型大鼠肾脏的细胞免疫介导的炎症损伤有关。
（二）对5／6肾切除大鼠的干预作用
（1）实验材料
1）实验动物：健康雄性SPF级SD大鼠，体重（180±20）g，上海西普尔必凯实验动物有限公司提供，实验动物安全合格证号：SYXK（沪）2008—0016。由上海中医药大学实验动物中心饲养，12 h光照，45％左右相对湿度，自由饮水饮食。
2）实验药物：健脾清化方由党参15 g、生黄芪15 g、草果6 g、苍术10 g，黄连3 g、制大黄9 g组成，共58 g，按照人体6倍剂量换算，大鼠每日用量为58×6／70＝4.97 g／kg，水煎浓缩，使用时稀释，灌胃体积控制在2 ml，由上海中医药大学中药研究所制备提供。
（2）实验方法。实验动物分组：假手术组10只，模型组10只，健脾清化组10只，氯沙坦组10只。造模方法：5／6肾切除（Platt）法，具体同上。
（3）检测指标：肾组织超氧化物歧化酶（SOD）活力的检测、肾组织丙二醛（MDA）的检测、Western Blot法检测肾组织ATⅡ受体的蛋白表达、RT PCR法检测肾组织NADPH氧化酶亚基p47 phoxmRNA的表达。免疫组化法检测肾组织NF κBp65的表达，免疫组化法检测肾组织TNF-α的表达，ELISA法检测肾组织白细胞介素10的表达，Western Blot法检测肾组织磷酸化p38MAPK的蛋白表达。
1. 对 5／6 肾切除大鼠 ATⅡ／NADPH 氧化应激通路的干预作用 肾脏纤维化是慢性肾脏病的共同病理过程，是所有CKD发展至终末期肾病（ESRD）的最后共同通路，肾脏纤维化是一个多因素参与的复杂过程，包括转化生长因子细胞因子、氧化应激炎症刺激等影响途径。越来越多的研究证明，氧化应激在肾脏疾病进展及其并发症发病中的作用十分重要，氧化应激存在于各种肾脏疾病的始末，在肾功能正常的CKD1期即已出现，并随着肾功能减退而不断加重，是影响CKD患者预后的重要危险因素，所以深入研究氧化应激在慢性肾衰进程中的作用机制，并寻求有效的遏制手段，对于延缓肾衰纤维化进程，具有重要意义。
NAD（P）H氧化酶作为产生活性氧的主要来源，参与氧化应激损伤并进而影响多种疾病的发生发展，是目前公认的肾脏疾病中细胞增殖和基质积聚的关键因子，已有研究证实，AngⅡ是NADH／NADPH氧化酶重要的刺激因子，两者共同作用诱发氧化应激反应，在慢性肾脏病的进展中起到重要的作用。
健脾清化方作为我们治疗慢性肾衰的基本方，其中黄芪、大黄、草果、黄连等已有实验证实其抗氧化的作用，本研究的第一部分亦初步说明了健脾清化方对慢性肾衰大鼠肾脏功能的保护作用，本部分实验旨在进一步研究健脾清化方对慢性肾衰大鼠ATⅡ／NADPH氧化应激的影响，以探讨其临床疗效的可能作用机制。
（1）研究结果
1）各组肾组织超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）表达：与假手术组比较，各组大鼠MDA含量明显增加（ P ＜0.05），SOD含量明显降低（ P ＜0.05）；与模型组比较，健脾清化方组和氯沙坦组MDA含量明显降低（ P ＜0.05），SOD含量明显升高（ P ＜0.05），健脾清化方组SOD和氯沙坦组组间比较具有统计学意义。说明健脾清化方和氯沙坦对慢性肾衰大鼠肾脏MDA含量和SOD活性具有显著的改善作用。
2）各组大鼠肾组织ATⅡ蛋白表达：与模型组相比较，各组ATⅡ表达明显降低，具有显著性差异（ P ＜0.01）。
3）各组大鼠肾组织NADPH氧化酶亚基p47 phoxmRNA表达：与假手术组比较，各组大鼠肾组织p47 phoxmRNA表达均显著升高（ P ＜0.05）；与模型组比较，健脾清化方组与氯沙坦组大鼠肾组织p47 phoxmRNA表达均明显降低（ P ＜0.05），氯沙坦组与健脾清化方组p47 phoxmRNA表达差异无显著性（ P ＞0.05）。说明健脾清化方和氯沙坦均能明显减少NADPH氧化酶p47 phoxmRNA的产生，具有显著的改善氧化应激的作用。
（2）讨论与分析：健脾清化方全方集清燥、淡渗、和中为一体，具有益气和中、清热化湿之功效，在前期的临床研究工作中，发现能较好地降低肌酐和尿素氮，从动物实验的角度证实了其改善肾功能的作用。研究发现，与假手术组比较，模型组大鼠MDA含量明显上升，SOD含量显著下降，存在统计学意义，说明5／6肾切除大鼠模型中存在明显的氧化激活状。健脾清化方给药后，大鼠血肌酐、尿素氮较模型组降低显著，肾组织MDA含量亦明显降低，SOD含量显著上升，具有显著差异（ P ＜0.05），提示健脾清化方改善肾功能可能与有效地清除氧自由基及减少氧自由基的合成相关。实验中同时发现，模型组大鼠肾组织中A蛋白及p47 phoxmRNA表达较假手术组显著上升（ P ＜0.05）；健脾清化方给药后，肾组织中AT1受体及p47 phoxmRNA表达较模型组大鼠显著降低。实验结果显示MDA／SOD与AT1／NADPH的表达存在显著的相关性，表明健脾清化方能显著增加组织抗氧化能力和减少过氧化物的产生，对ATⅡ／NADPH氧化应激通路的抑制很可能是其作用机制之一。说明健脾清化方可以通过改善ATⅡ／NADPH介导的氧化应激通路，从而延缓肾脏纤维化进程，为健脾清化方在慢性肾衰中的治疗提供新的作用途径。
2. 对 5／6 肾切除大鼠磷酸化 p38 丝裂原活化蛋白激酶介导的炎症因子的调控作用 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKS）级联反应是细胞内重要的信号传导系统之一，参与了多种生理病理过程的调节。作为其中重要的分支p38MAPK信号传导通路通过转录因子磷酸化而改变基因的表达水平，参与多种细胞内信息传递过程，介导细胞生长、发育、分化及凋亡全过程，且在调控细胞因子产生、转录调节及缺血再灌注、氧化应激方面起到重要作用，近年研究发现，p38MAPK在慢性肾脏疾病的发病过程中占有举足轻重的地位，参与多种发病机制的形成和病理过程的演化。
研究发现，ROS是诱导MAPKS磷酸化而活化的重要因素，实验研究已证实健脾清化方能显著抑制血管紧张素Ⅱ／NADPH氧化应激通路的活化，从而减少ROS的生成，那么是否健脾清化方能因为活性氧的减少对p38MAPK信号转导通路的磷酸化起到一定的抑制作用呢？从而减少p38信号通路下游炎症因子的表达呢？鉴于此，实验旨在通过检测磷酸化p38MAPK在慢性肾衰大鼠体内的活化情况以及下游炎症因子的表达，并用健脾清化方进行干预，以此来探讨此方在细胞信号转导通路以及抑制炎症方面可能的作用机制，为临床疗效提供进一步药理研究基础。
（1）研究结果
1）各组大鼠肾组织NF-κB65表达：各组大鼠与假手术比较，NF-κB65表达明显上调（ P ＜0.01），药物干预后NF κBp65表达较模型组显著下降（ P ＜0.01）。健脾清化方与氯沙坦组组间比较不存在统计学差异（ P ＞0.05）。
2）各组大鼠肾组织TNF-α表达：与假手术组比较，各组大鼠TNF-α阳性面积显著增加（ P ＜0.05）；与模型组比较，健脾清化方组和氯沙坦组TNF-α阳性面积显著降低（ P ＜0.05），其有统计学意义。
3）各组大鼠肾组织白细胞介素-10（IL-10）表达：与假手术组比较，各组大鼠IL-10表达均明显升高（ P ＜0.05）；与模型组比较，健脾清化方组大鼠IL-10表达明显下降（ P ＜0.05），具有统计学意义。
4）各组大鼠肾组织磷酸化p38MAPK蛋白表达：与假手术组比较，各组大鼠肾组织p p38MAPK蛋白表达均显著升高（ P ＜0.05）；与模型组比较，氯沙坦组与健脾清化方组p p38MAPK表达均显著下降（ P ＜0.05），氯沙坦组与健脾清化方组比较无统计学意义（ P ＞0.05）。
（2）讨论与分析：实验表明，模型组大鼠磷酸化p38MAPK水平较假手术组明显升高，健脾清化方给药后，p p38MAPK表达出现显著下调（ P ＜0.05），提示5／6肾切除后，p38MAPK信号传导通路被激活，而健脾清化方能明显降低p38MAPK信号通路的活化。模型组大鼠NF-κB表达较假手术组显著增多，提示在慢性肾衰模型中NF-κB65作为炎症因子产生的核心环节参与其中发挥重要的作用，而健脾清化方和氯沙坦干预后能显著下调NF κB的活化，与p38的蛋白表达相平行。
模型组大鼠TNF-α的阳性面积显著高于假手术组，健脾清化方组阳性面积显著低于模型组，差异显著（ P ＜0.05），提示5／6肾切除后炎症反应明显被激活，而健脾清化方能显著降低炎症反应的高表达。与假手术组比较，各组大鼠IL-10表达均明显升高（ P ＜0.05）；与模型组比较，健脾清化方组大鼠IL-10表达明显下调（ P ＜0.05），正如健康人外周血单核细胞中无细胞因子的基因表达，不产生炎症因子，但肾功能衰竭时机体内毒性物质堆积，肾脏清除细胞因子能力降低，使细胞因子水平升高，假手术组大鼠体内无明显炎症状态，故保护因子IL-10处于较低的表达状态，而肾大部切除模拟的肾衰状态触发了众多炎症因子的高表达，继而激活了IL-10的抗炎反应，所以出现了模型组IL-10的高表达。健脾清化方给药60日后，大鼠体内的炎性因子诸如TNF-α等明显下降，炎症状态得以改善，故而作为保护因子的IL-10同样出现明显下降。各组之间TNF-α与IL-10表达的高度相关性正反映了致炎因子与促炎因子间的动态平衡。
模型组大鼠AT1的高表达，p17phox激发了ROS的显著增多，与p38的显著活化趋势完全一致，可以推测由AngⅡ诱导的氧化应激反应经过NADPH氧化酶的介导，继而引起了p38信号转导通路的活化，NF κB参与其中启动了下游多种炎症因子的瀑布式产生，从而加重ECM的沉积，促进了肾脏纤维化的发展。与已有的报道相符。结合药物干预组的实验结果，推测健脾清化方可能通过有效抑制NADPH氧化应激反应，减少ROS的生成，从而一定程度下调了p38MAPK的活化，后者又进一步降低了与NF κB密切相关的炎症因子的表达，动态调控致炎因子TNF-α与抑炎因子IL-10的产生，而有效改善慢性肾衰炎症状态，延缓肾衰进程。
（三）对UUO大鼠模型肾间质纤维化的作用研究
目前对肾间质纤维化的研究主要集中于以下两个方面：细胞生长因子的作用，主要包括促纤维化的转化生长因子（transforming growth factor β，TGF β）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和起保护作用的肝细胞生长因子（HGF）；肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化（epithelial mesenchymal transdifferentiation，EMT）过程的作用，包括表达α平滑肌肌动蛋白（α SMA）的肌成纤维细胞细胞外基质（ECM）成分如胶原（Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ）、纤维连接蛋白（FN）等。因此从中选择几个较为常用的指标（TGF β、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA）来作为研究指标。
（1）实验材料
1）实验动物：健康雄性SPF级SD大鼠100只，体重（180±20）g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供，实验动物安全合格证号：SYXK（沪）2008—0016。由上海中医药大学实验动物中心饲养，2 h光照，45％左右相对湿度，自由饮水饮食。适应性喂养1周。
2）实验药物：健脾清化方由党参15 g、生黄芪15 g、草果6 g、苍术10 g、黄连3 g、制大黄9 g组成，共58 g，按照人体6倍剂量换算，大鼠每日用量为58×6／70＝4.97％kg，水煎浓缩，使用时稀释，灌胃体积控制在2 ml，由上海中医药大学中药研究所制备提供。
（2）实验方法
1）实验动物分组：100只雄性大鼠按体重随机分为10组，即：假手术组10只，模型组10只，健脾清化组10只，氯沙坦钾片组10只。
2）造模方法：模型组和治疗组大鼠以2％戊巴比妥钠（40 mg／kg）腹腔注射麻醉，将大鼠右侧卧位固定于手术台上，备皮，用碘酒、75％乙醇消毒手术区后铺巾，选择左侧腹纵向切口，依次切开皮肤至腹腔，游离输尿管，将左侧输尿管用组织钳托起中段，1号丝线分别结扎输尿管，两结扎线相距5 mm，不剪断输尿管，手术时注意不碰伤肾包膜并保护好周围组织，手术后把肾脏、输尿管复位，然后连续缝合腹膜间断缝合皮肤，术中遵守无菌操作，假手术组大鼠不结扎输尿管，其余步骤同上。
3）给药方法：大鼠按体重随机分组并行UUO造模后第2日起，治疗组和对照组用各组药物每日灌胃，假手术组和模型组同体积生理盐水灌胃，灌胃容积控制在2 ml，共14日。
（3）检测指标：生化指标及尿蛋白检测。血样经离心后留取血清，血尿素氮肌酐及尿蛋白的测定，用BECMAN 5大型生化仪常规检测方法检测。
（4）研究结果
1）肾脏肉眼外观改变：假手术组大鼠两侧肾脏外观正常。模型组大鼠左肾（术侧）肿大，有囊性改变，内含混浊的褐色尿液，肾实质变薄，肾盂扩张，肾盏乳头受压，和周围组织无明显粘连，残肾易分离；右肾稍有肿大，颜色浅，组织结构清楚。
2）肾组织HE染色：HE染色显示假手术组大鼠肾小球、肾小管结构基本正常，细胞排列整齐，小管周围肾间质无增宽，肾间质无明显炎性细胞浸润。模型组大鼠上皮细胞胞质疏松，间质水肿并伴有淋巴细胞、单核细胞浸润，纤维组织增生，部分肾小管萎缩、管腔闭塞或空泡样、坏死，部分管腔内有红细胞管型，小管间质区增宽，皮质极薄，小管结构遭到严重破坏，健脾清化方组和氯沙坦组与模型组相比有所减轻。
3）马松染色结果：蓝染纤维在假手术组仅在肾间质有少量表达，在模型组表达增多，健脾清化方组和氯沙坦组相比模型组均有不同程度的下降，表达部位主要在肾间质。
蓝染纤维阳性面积比例上，与假手术组相比，模型组蓝染纤维面积比例明显增高，差异有统计学意义（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组和氯沙坦组的蓝染纤维面积比例均减少，有统计学意义（ P ＜0.01）；与氯沙坦组相比，健脾清化方组表达减少，差异无统计学意义（ P ＞0.05）。
4）免疫组织化学染色结果：免疫组化染色Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA、TGF-β的阳性物质呈棕黄色。在假手术组仅在肾间质有少量表达。在模型组表达增多，表达部位主要在肾间质，健脾清化方组与氯沙坦组的表达较模型组减轻。
阳性面积比例上，与假手术组相比，模型组阳性面积比例明显增高，差异有统计学意义（ P ＜0.01）；与模型组相比，健脾清化方组和氯沙坦组的Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA、TGF-β表达面积均降低，差异有统计学意义（ P ＜0.01）；与氯沙坦组相比，健脾清化方Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性表达面积均减少，差异有统计学意义（ P ＜0.01），健脾清化方的α-SMA阳性表达面积减少，但无统计学意义（ P ＞0.05），健脾清化方的TGF-β阳性表达面积减少差异有统计学意义（ P ＜0.05）。
（5）讨论与分析：本研究发现，UUO模型中，与假手术组相比，模型组肾组织中的Ⅰ、Ⅲ型胶原、α SMA和TGF β表达均明显增加（ P ＜0.01），说明肾间质纤维化形成，纤维化的模型造模成功。与模型组相比，用药组肾组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原、α SMA和TGF-β表达有明显降低（ P ＜0.01），说明健脾清化方能有效降低梗阻肾脏中Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA和TGF-β的表达。本研究证实健脾清化方能抑制TGF-β的表达，延缓CRF进展，与以往的研究一致。健脾清化方组α-SMA的表达要明显低于模型组，表明健脾清化方能延缓FN的进展，这可能是健脾清化方延缓肾间质纤维化的部分机制。
健脾清化方可以改善UUO模型梗阻肾脏的病理表现，降低肾脏组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原、α SMA和TGF β的表达，具有抗肾间质纤维化的作用，其作用机制可能是健脾清化方通过降低TGF-β的产生，从而抑制EMT的发生，减少Ⅰ、Ⅲ型胶原等EMC的产生和积聚，使α-SMA的表达减少，从而减轻肾间质纤维化。
（四）对AngⅡ刺激下大鼠系膜细胞NADPH／p38MARK氧化应激通路的影响
慢性肾衰通常表现为肾小球硬化，肾小球周围和间质的纤维化，以及间质中不同程度的单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞的浸润和慢性炎症、肾小管萎缩。无论是细胞外基质（ECM）还是广泛的肾小球硬化，系膜细胞（ECM）在其中均起到非常重要的作用，由于ECM增多首先表现在系膜区，滤过的大分子蛋白更易在系膜区沉积继而诱发一系列炎症反应从而刺激细胞外基质合成，最终ECM的合成与分解平衡紊乱导致了肾小球的硬化发生。
众多的研究表明，氧化应激和细胞因子在系膜细胞增生中发挥了重要作用，前两个部分的实验已经证明健脾清化方能明显减少NADPH亚基p47phox的表达，从而使活性氧产生减少，MDA及SOD均较模型组有显著改善，进一步减少p38信号转导通路的活化。本部分研究采用体外培养大鼠MCs，观察其在AngⅡ的刺激下NADPH／p38MAPK信号转导通路的活化和活性氧表达标志物MDA、SOD的表达情况，以及健脾清化方的干预作用，旨在进一步从细胞水平，排除其他影响因素验证健脾清化方在改善慢性肾衰大鼠氧化应激可能的作用途径。
（1）实验材料
1）细胞来源：正常大鼠肾脏系膜细胞株（HBZY-1）购自上海复盟基因生物科技有限公司。
2）实验动物：健康成年雄性SD大鼠（SPF级），8周龄，体重（200±20）g，由上海西普尔必凯实验有限公司提供，共12只。分笼饲养于上海中医药大学实验动物中心，25℃、12 h光照，45％相对湿度的环境中，自由饮水，进食标准普通饲料。
3）实验药物。健脾清化方水煎剂制备：党参15 g、生黄芪15 g、草果6 g、黄连3 g、制大黄9 g，共计58 g。由上海中医药大学中药研究所提供，水煎浓缩为生药含量0.58 g／ml。
对照药：氯沙坦钾片，100 mg／片（杭州默沙东制药有限公司生产，药物批号100395），将药研成细粉，用生理盐水配成1 mg／ml的混悬液。
（2）实验方法
1）含药血清的制备：选择SD大鼠12只分为正常组、健脾清化方组、氯沙坦组，健脾清化方治疗组按每日5.8 g／kg灌胃；氯沙坦治疗组按每日10 mg／kg灌胃，用药剂量按人体用药量6倍进行换算，灌胃每日1次，共3日。正常组同体积生理盐水灌胃。末次给药后2 h腹主动脉取血，冷冻离心机3 000 Pm离心10 min，0.22μm过滤除菌，分装，放入－80℃低温冰箱冻存。
2）大鼠肾小球系膜细胞的培养与血清处理：大鼠肾小球系膜细胞株常规培养于含10％胎牛血清的MEM培养基中，培养条件为37℃，饱和湿度5％CO 2 。每2～3日用含0.05％EDTA的胰酶消化传代，传代后第3～5代的细胞用于实验，按不同检测指标同时加入AngⅡ和不同浓度的血清处理细胞，每组3个复孔，检测各组细胞的表达情况。
（3）检测指标与方法
1）系膜细胞内NADPH氧化酶亚基p47phox的检测。RT PCR法检测AngⅡ刺激下不同时间点p47 phoxmRNA的表达：将系膜细胞传到培养板中，加入100 nM AngⅡ，分别处理不同时间（30 min、4h、8h、12h、24h）后收取细胞提取RNA，反转录成cDNA，采用Real-time PCR法检测系膜细胞在AngⅡ刺激下不同时间点p47 phoxmRNA的表达。并在保证实验效果和稳定性的前提下，以表达量最高峰时对应的时间点，作为后续各项指标的检测时间点。
RT PC法检测AngⅡ刺激下不同浓度含药血清p47 phoxmRNA的表达，分组如下。
A组：10％大鼠正常血清。
B组：5％健脾清化方＋5％大鼠正常血清。
C组：10％健脾清化方。
D组：5％氯沙坦＋5％大鼠正常血清。
E组：10％氯沙坦。
F组：10％胎牛血清＋AngⅡ。
G组：10％大鼠正常血清＋AngⅡ。
H组：5％健脾清化方＋5％大鼠正常血清＋AngⅡ。
I组：10％健脾清化方＋AngⅡ。
J组：5％氯沙坦＋5％大鼠正常血清＋AngⅡ。
K组：10％氯沙坦＋AngⅡ。
2）系膜细胞内超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的检测，分组如下。
A组：10％大鼠正常血清。
B组：10％健脾清化方。
C组：10％氯沙坦。
D组：10％大鼠正常血清＋AngⅡ。
E组：10％健脾清化方＋AngⅡ。
F组：10％氯沙坦＋AngⅡ。
3）Western blot法检测磷酸化p38MAPK蛋白的表达，分组如下。
A组：10％大鼠正常血清。
B组：10％健脾清化方。
C组：10％氯沙坦。
D组：10％大鼠正常血清＋AngⅡ。
E组：10％健脾清化方＋AngⅡ。
F组：10％健脾清化方＋AngⅡ。
（4）研究结果
1）AngⅡ刺激下系膜细胞内不同时间点p47 phoxmRNA表达：实验分别取0 min、30 min、4h、8h、12h、24h时间点进行检测，结果发现p47 phoxmRNA表达峰值出现在24h时，各时间点的表达量呈时间依赖性升高。
2）AngⅡ刺激下不同浓度含药血清p47 phoxmRNA的表达：A组与B、C、D、E组比较，均不存在组间差异，无统计学意义（ P ＞0.05）；F组与G组比较，不存在组间差异，无统计学意义（ P ＞0.05），F组与H、I、J、K组比较有显著组间差异（ P ＜0.01）；H组与I组、J组与K组两两比较具有统计学意义（ P ＜0.01）；H组与J组、I组与K组两两比较具有显著差异（ P ＜0.01），与I组比较两者间无统计学意义（ P ＞0.05）；A组与G组、B组与H组、C组与I组、D组与J组均有显著统计学意义（ P ＜0.01）；E组与K组间无明显统计学意义（ P ＞0.05）。
3）AngⅡ刺激下超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的表达：A、B、C组两两比较不存在组间差异，无统计学意义（ P ＞0.05）；加入AngⅡ后，D、E、F组与A组比较差异显著，具有明显的统计学差异（ P ＜0.05）；E组和D组、F组和D组两两比较均具有显著差异（ P ＜0.05）。说明药物干预后能明显降低MDA的表达，上调SOD的活力。
4）AngⅡ刺激下磷酸化p38MAPK的蛋白表达：健脾清化方干预组可明显抑制AngⅡ培养条件下肾小球系膜细胞内磷酸化p38MAPK的蛋白表达，与氯沙坦干预组比较无显著差异（ P ＞0.05）。
（5）讨论与分析：本部分研究采用体外实验的方法，以AngⅡ刺激系膜细胞观察由AngⅡ诱导的NADHP氧化应激以及p38MAPK信号转导通路的表达情况，并健脾清化方干预后通路变化的情况，以进一步验证前期的体内实验，为慢性肾衰的发病机制和健脾清化方的作用途径提供更翔实的实验依据。
对于系膜细胞内p47phox的表达，本次研究显示，AngⅡ刺激后肾小球系膜细胞内NADPH氧化酶亚p47 phoxmRNA的表达量与刺激时间呈正相关，至24 h达峰值，且表达稳定，故在随后的指标观察中均选择24h这个时间点进行观察。与A组比较，B、C、D、E组系膜细胞加入不同含药种类和不同浓度的血清后其p47 phoxmRNA的表达无组间差异（ P ＞0.05），排除了药物本身引起p47异常表达的可能；F组10％胎牛血清和G组10％大鼠血清经过AngⅡ的刺激后无组间差异，证明来源于不同种属的动物血清本身不会引起p47分泌的差异性；与10％胎牛血清＋AngⅡ即空白对照组比较，H、I、J、K各组的p47 phoxmRNA表达量明显减少，统计学差异明显（ P ＜0.01），证明健脾清化方或氯沙坦药物干预后能明显下调NADH的表达，从而减少氧化应激的发生，且不同含药血清浓度均能获效；H组与I组、J组与K组两两比较，发现较高浓度的含药血清较低浓度的含药血清降低p47的表达更为明显具有统计学差异，呈明显的量效关系。H组与J组、I组与K组的比较中发现，对于相同血清浓度的两种药物，氯沙坦显示出更好的疗效，但是较低浓度的氯沙坦（5％）＋AngⅡ组（J组）与较高浓度的健脾清化方（10％）＋AngⅡ组（I组）比较，统计学差异消失，为提高健脾清化方血药浓度以更好地改善氧化应激提供佐证。与加入AngⅡ刺激之前比较，A组与G组、B组与H组、C组与I组、D组与J组均存在显著的组间差异，未经AngⅡ刺激的各组p47表达量低，加入AngⅡ刺激后p7表达显著升高，提示NADPH介导的氧化应激途径由AngⅡ诱发而迅速活化，而E组与K组组间比较无统计学意义（ P ＞0.05），说明加入AngⅡ受体拮抗剂氯沙坦后能明显阻断由AngⅡ诱导的氧化应激过程，更有力地说明了AngⅡ除了作为血管活性物质以外氧化应激诱导剂这个重要的生物学功能，与众多的国内外研究结果一致。健脾清化方能有效抑制肾小球MCs的氧化应激反应，且随着含药血清浓度的增高呈现更强的抑制氧化应激的作用。
ROS是氧化应激反应的核心环节，因其寿命极其短暂，很难被直接检测到，所有我们通过检测SOD和MDA这两种氧化应激标志物来反映ROS的表达情况，D组大鼠正常血清加入AngⅡ培养后系膜细胞内氧化与抗氧化平衡被打破，SOD的显著下降显示存在抗氧化防御能力的代偿不足，最终导致了氧化应激的发生，生物膜的脂质过氧化增加，使MDA大量生成，两者与A组正常血清组差异明显（ P ＜0.01）呈氧化应激状态。加入药物干预后，无论是健脾清化方还是氯沙坦组与D组比较，都能明显降低MDA的含量，提高SOD的表达量。与前期的体内实验结果完全一致。E组和F组组间比较，SOD表达量无组间差异（ P ＞0.05），MDA表达量氯沙坦组更低，表明氯沙坦抑制细胞膜脂质过氧化减少ROS生成的作用更强。已有研究发现，在血管紧张素Ⅱ的刺激下，由NADPH氧化酶介导的氧化应激产生过量ROS，后者又是诱导MAPKS磷酸化而活化MAPK信号通路的重要因素。在此次研究中，同时发现正常大鼠血清加入AngⅡ后p p38MAPK表达量显著升高，据此结果可推测，氧化应激确实与炎症因子密切相关，与p38的信号通路激活密不可分，与研究报道一致。加入健脾清化方和氯沙坦干预后，与D组比较，可见磷酸化p38表达量明显下降（ P ＜0.01），说明两者均能明显抑制系膜细胞p38MAPK信号转导通路的磷酸化，且氯沙坦与健脾清化方组组间比较无统计学差异（ P ＞0.05），均具有很好的效果。
研究证实AngⅡ可以上调肾小球系膜细胞NADPH氧化酶亚p47phox基因和刺激细胞内ROS的生成，活化p38MAPK信号转导通路，健脾清化方和ATR拮抗剂氯沙坦干预后能够明显抑制上述氧化反应，并抑制继而发生的p38信号转导通路的磷酸化。这一实验结果与前两部分的整体动物实验研究相似，此部分实验进一步从细胞水平验证了氧化应激在慢性肾衰发病中的作用机制以及健脾清化方临床取效的作用途径，提示AngⅡ可能部分通过诱导细胞内NADPH介导的ROS产生，进而激活p38信号转导通路，促进肾小球系膜细胞表达下游炎症因子，从而引起肾小球系膜基质增生和系膜区增宽，最终导致肾小球纤维化、肾功能衰竭而健脾清化方治疗对于氧化应激的改善作用可能有助于延缓慢性肾衰的发生发展进程。鉴于中药的多层次多靶点的治疗特色，今后可考虑从其他氧化应激通路和炎症信号转导通路，以及各信号通路之间的相互关系进行更为深入的研究。
慢性肾脏病不仅包括肾病等原发性肾小球肾炎、肾小管间质性疾病及遗传性肾炎等传统意义上的慢性肾脏疾病，而且还包括狼疮性肾炎、紫癜性肾炎、乙型肝炎相关性肾炎和糖尿病、高血压、肾动脉狭窄等引起的肾损害及伴随年龄增长引起的肾功能的下降。
肾小管间质的病变程度是反映肾功能下降严重程度和判断预后的最重要指标，过去有大量的研究显示，各种肾脏疾病肾功能的损害程度与肾小管间质纤维化的程度密切相关。肾间质纤维化是各种慢性肾脏病发展至慢性肾衰竭的共同通路，其主要病理特点为肾间质成纤维细胞的增生和细胞外基质的过度积聚。因此，进一步研究肾间质纤维化的发病机制，探索有效的防治措施，从而延缓慢性肾功能衰竭，降低ESRD的发病率已成为医学界肾脏病学的首要问题。
目前，中医药在抗肾间质纤维方面已成为临床和实验研究的热点，且取得了很大的进展，根据患者不同的病因病机和临床症状，予不同的中药复方，单体及其有效成分进行治疗，均有不同程度的改善，从病理学上来说主要是通过抑制肾间质纤维化，从而延缓慢性肾功能衰竭的进展。中医认为肾间质纤维化的病机主要是本虚标实，以脾肾两虚为本，以湿热瘀毒为标。临床实践证明，补益类和清热泻浊类药物对于延缓肾间质纤维化取得了显著的疗效。健脾清化方是由何氏所创立，前期研究已证实健脾清化方的抗肾纤维化的作用。所以，本研究主要以健脾清化方中的两味主要药物（黄芪和大黄）的有效单体（黄芪甲苷和大黄酚）进行研究，试图寻求黄芪甲苷和大黄酚延缓肾间质纤维化的可能作用机制，为中医药延缓肾衰进程提供了新策略，同时也为中药有效成分进步的开发与应用提供了实验资料和参考。
（1）实验材料
1）实验动物：健康成年SD雄性大鼠36只，体重（180±20）g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK（沪200016），大鼠分笼饲养于上海中医药大学实验动物中心，予12 h光照，室温20～25℃，45％湿度的环境中，自由饮水，进食标准普通饲料。
2）实验药物：大黄酚（Chrysophanol1），分子式：C 15 H 10 O 4 ，分子量：254.24，纯度为99％，批号：110627，购自上海融禾医药科技有限公司。
黄芪甲苷（Astragalus Saponin I），分子式：C 41 H 68 O 14 ，分子量：784，纯度为98％，批号：10702，购自上海融禾医药科技有限公司。
（2）实验方法
1）模型制作：先用3％戊巴比妥钠（40 mg／kg）对大鼠行腹腔注射，待大鼠麻醉后，备皮、用75％乙醇消毒后铺巾，再将大鼠右侧卧位固定于手术台上，行左侧腹纵向切口，依次切开皮肤至腹腔，夹住脂肪组织，取出肾脏，用生理盐水纱布覆盖于切口两侧，找到输尿管，用1号丝线将左侧输尿管结扎。术后将肾脏、输尿管放回原处，然后依次缝合肌肉层、皮肤层。假手术组除不结扎输尿管外，其余操作步骤同上。
2）实验分组及给药。根据大鼠体重随机分为4组：假手术组、模型组、大黄酚组、黄芪甲苷组，每组各9只。自术后第1日起予每日灌胃，大黄酚组按每日5 mg／kg的剂量（相当于人的6.25倍剂量）灌胃，黄芪甲苷组按每日1.5 mg／kg的剂量（相当于人的6.25倍剂量）灌胃，灌胃容积控制在2 ml以下，持续灌胃14日。假手术组和模型组均予等量蒸馏水灌胃。整个实验过程中并无老鼠死亡。
3）标本采集：中药治疗2周后处死大鼠，采取心脏采血，用于检测血肌酐、尿素氮。
（3）检测指标
1）一般情况观察：观察各组大鼠进食量、饮水量体重、活动及精神状态的变化。
2）血肌酐、尿素氮检测：将采集的血液经离心后提取血清，用于检测血肌酐及尿素氮，将血清送至上海中医药大学附属曙光医院检验科用生化仪常规检测方法进行检测。
3）尿NAG、尿β2 MG、尿α1 MG、尿TRF、24h尿蛋白定量。
4）肾组织病理观察HE染色、Masson染色。
5）免疫组化指标：肾组织LN的表达Ⅲ型胶原。
6）肾组织CTGF、TGF-β表达。
1.大黄酚 、 黄芪甲苷对 UUO 模型大鼠血肌酐 、 尿素氮的影响
（1）一般情况观察：假手术组大鼠进水进食量正常，活动灵活，精神状态良好，体重增长均匀，体毛光泽；模型组大鼠进水进食量减少，身体消瘦，活动迟钝，精神萎靡，体毛无光泽；黄芪甲苷组与大黄酚组大鼠进水进食量增多，活动逐渐灵活，整体状况均较模型组明显改善。
（2）肾功能水平的比较。①血肌酐的比较：模型组与假手术组比较有明显增高，呈显著性差异（ P ＜0.05）；经治疗后，黄芪甲苷组和大黄酚组的血肌酐较模型组相比均有所下降，有统计学意义（ P ＜0.05）。而与假手术组相比，黄芪甲苷组和大黄酚组的血肌酐仍有所升高，有统计学意义（ P ＜0.05）。②尿素氮的比较：模型组与假手术组比较有明显增高，呈显著性差异（ P ＜0.05）；经治疗后，黄芪甲苷组和大黄酚组的尿素氮较模型组相比均有所下降，有统计学意义（ P ＜0.05）。而与假手术组相比，黄芪甲苷组和大黄酚组的尿素氮仍有所升高，有统计学意义（ P ＜0.05）。
2.大黄酚 、 黄芪甲苷对 UUO 模型大鼠尿蛋白的影响
（1）研究结果
1）尿NAG比较：模型组与假手术组比较有明显增高，呈显著性差异（ P ＜0.05）；经治疗后，黄芪甲苷组的尿NAG较模型组相比均有所下降，有统计学意义（ P ＜0.05）。而大黄酚组的尿NAG与模型组比较差异无统计学意义（ P ＞0.05）。而与假手术组相比黄芪甲苷组的尿NAG无统计学意义（ P ＞0.05）。
2）尿β2-MG比较：模型组与假手术组比较有明显增高，呈显著性差异（ P ＜0.05）；经治疗后，黄芪甲苷组和大黄酚组的尿β2-MG较模型组相比均有所下降，有统计学意义（ P ＜0.05）。而与假手术组相比，黄芪甲苷组和大黄酚组的尿β2-MG均无统计学意义（ P ＞0.05）。
3）尿α1-MG比较：模型组与假手术组比较有明显增高，呈显著性差异（ P ＜0.05）；经治疗后，黄芪甲苷组的尿α1-MG较模型组相比均有所下降，有统计学意义（ P ＜0.05）。而大黄酚组的尿α1-MG与模型组比较差异无统计学意义（ P ＞0.05）。而与假手术组相比，黄芪甲苷组的尿α1-MG仍有所升高，有统计学意义（ P ＜0.05）。
4）尿TRF比较：模型组与假手术组比较有明显增高，呈显著性差异（ P ＜0.05）；经治疗后，黄芪甲苷组和大黄酚组的尿TRF较模型组比较差异均无统计学意义（ P ＞0.05）。
5）24h尿蛋白定量比较：模型组与假手术组比较有明显增高，呈显著性差异（ P ＜0.05）；经治疗后，黄芪甲苷组的24 h尿蛋白定量较模型组相比均有所下降，有统计学意义（ P ＜0.05）。而大黄酚组的尿24 h尿蛋白定量与模型组比较差异无统计学意义（ P ＞0.05）。而与假手术组相比，黄芪甲苷组的24h尿蛋白定量仍有所升高，有统计学意义（ P ＜0.05）。
（2）讨论与分析：本实验研究重点筛选出具有同类功效的有效中药：具有健脾益气功效的黄芪和具有清热泻浊功效的大黄，来探讨它们的有效单体对抑制肾间质纤维化，延缓慢性肾衰的可能作用机制。
1）黄芪对肾间质纤维化的影响：黄芪是膜荚黄芪或者内蒙黄芪（两者均为豆科多年生草本植物）的干燥根，性微温而味甘，入肺、脾经。黄芪具有补气固表、利尿托毒排脓、敛疮生肌等功效，还可益气养阴、通调血脉、流行经络，虽性温补却“无碍于壅滞”（《本经逢原》）。然黄芪的诸多功效，皆源于其补气之功，故有“补气诸药之最”的美称。
现代临床抗肾间质纤维化的补益类药物中，单药以黄芪应用最为普遍。药理研究表明，黄芪在调节免疫，对细胞缺血、缺氧等损伤的保护，对胶原合成和代谢的影响，抗肿瘤等方面中具有重要作用。近年来有研究证实黄芪在治疗慢性肾脏病中发挥重要作用。其主要作用机制可概括为：①抗氧化作用，减少氧自由基的生成；②调节内皮素与氧化氮的平衡，改善血液流变学的异常；③改善肾小球滤过屏障；④改善血小板功能；⑤抗蛋白非酶糖化作用及抗细胞因子的作用，抑制炎症因子、减少纤维生成的作用；⑥改善水钠代谢，利尿消肿；⑦改善蛋白质及脂代谢；⑧调节免疫系统。
2）大黄对肾间质纤维化的影响：大黄始载于《神农本草经》，其性苦、寒，归脾、胃、大肠、肝、心经。具有泻下攻积，清热泻火，利湿退黄，止血、解毒、活血化瘀等功效，能攻能守，有毒能解，有阻能通，出血能止，瘀浊能排，倍受古今医家的推崇。《神农本草经》云：“大黄主下瘀血、血闭、寒热、破癥瘕积聚、留饮宿食、荡涤肠胃、推陈致新、通利水谷、调中化食、安和五脏。”
现代药理研究表明，大黄具有泻下、抗菌、抗炎、抗肿瘤、调血脂、保肝利胆等作用，且大黄是改善肾功能、缓解肾间质纤维化、治疗慢性肾衰竭的有效药物。其作用机制主要包括：①对细胞因子（转化生长因子、肿瘤坏死因子、白细胞介素-6等）的调节作用；②对糖、脂质代谢的影响；③抑制成纤维细胞的增殖；④改善微循环，调节肾组织血流动力学；⑤清除氧自由基的作用，减轻肾脂质过氧化损伤。
大黄能抑制肾单位高代谢，防止细胞外基质的堆积并促进其降解，延缓肾小球硬化；通过荡涤肠腑，能使一部分氮质从肠道排出，抑制系膜细胞及肾小管上皮细胞增生，减轻代偿性肥大，同时还能改善肾衰患者的高凝、高黏状态，改善肾血流量，从而保护残余肾功能，减少蛋白尿，延缓慢性肾衰的进展。大黄味苦，寒，归脾、胃、大肠、肝、心经，具有清湿热泻火、活血祛瘀、解毒功效，是临床上治疗慢性肾衰的主要药物之一。现代药理研究表明：大黄具有保护肾、肝、胃等重要器官的功能，具有促进新陈代谢、抑制胃肠毒素、抑制炎症、改善微循环的作用。大黄主含大黄蒽醌类成分，以游离蒽醌、结合蒽醌和总蒽醌等多型体存在，游离蒽醌代表性成分是大黄酚大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素甲醚等。大黄酚又名大黄根酸，属单蒽核类蒽醌衍生物，具有抗菌、缩短血液凝固时间、兴奋神经、麻痹肌肉、止咳、利尿、抗癌的作用。实验表明大黄酚具有改善学习记忆及延缓衰老、促智作用。大黄素、大黄酸在慢性肾衰中已有较多研究，但对大黄酚的研究较少。近期体外研究发现大黄酚可抑制活化的成纤维细胞和系膜细胞的增殖和TGF-β的表达。
3.大黄酚 、 黄芪甲苷对 UUO 模型大鼠肾组织病理学的影响
（1）研究结果
1）光镜观察：通过HE、Masson染色可观察到假手术组肾小球和肾小管结构清晰，小管上皮细胞排列整齐，未见肾小球及肾小管扩张、变形，血管壁正常，间质中未见明显的炎症细胞浸润和胶原纤维增生；模型组可见部分肾小管和集合管呈囊性扩张，伴有蛋白管型，上皮细胞变性、坏死、脱落，少量小管萎缩消失，间质宽度增加，且可见大量炎症细胞浸润和大量的胶原纤维沉积。黄芪甲苷组和大黄酚组肾小管间质病变均有不同程度改善。
2）Masson染色结果显示：细胞核被染成蓝紫色，红细胞、肾间质细胞胞质和肾小管上皮细胞被染成红色，肌成纤维细胞被染成蓝色。根据本实验结果分析，模型组与假手术组相比，蓝染纤维阳性面积率显著增加，具有统计学意义（ P ＜0.05）；经治疗后，黄芪甲苷组和大黄酚组的蓝染纤维阳性面积率较模型组相比表达明显减少，具有统计学意义（ P ＜0.05）。而与假手术组相比，黄芪甲苷组和大黄酚组的蓝染纤维阳性面积率仍有所升高，有统计学意义（ P ＜0.05）。
（2）讨论与分析：各代医家对肾间质纤维化的中医认识也持有不同的看法。黄氏等认为本病以肾虚为本，日久则蕴浊成毒。水湿、浊毒、瘀血等邪相互交结，阻滞肾络，致使肾失所养，进一步加重肾脏的虚损程度，如此反复形成恶性循环，缠绵难愈，甚则日久产生变证。有专家认为肾虚为本病发生发展的基础，湿瘀既是病理产物，又是致病因素，湿瘀互结是本病进展的中心环节。何小萍等则认为该病多因实致虚，湿热和血瘀病邪贯穿疾病发展的始终，病邪羁留体内，久而伤肾，导致肾失开阖，不能分清泌浊。郑平东认为脾肾虚损是本病的本因，标因乃肾病日久，损及分清泌浊的功能，使湿浊贮留体内，弥漫三焦，波及其他脏腑，而引发本病。程丑夫认为慢性肾衰其病机重点当在气机升降失调，指出关格虽症见于上下，而病变实与三焦气机不利密切相关，故其论治以擅调气机升降出入为主，用药遣方多以升降散加减常有奇效。
4.大黄酚 、 黄芪甲苷对 UUO 模型大鼠纤维化指标的影响
（1）研究结果
1）肾组织LN的表达：假手术组肾小管间质中LN表达少，而模型组肾间质中LN表达明显增强。模型组与假手术组相比，肾组织LN的阳性表达面积明显升高，呈显著性差异（ P ＜0.05）；经治疗后，与模型组相比，黄芪甲苷组和大黄酚组均能显著降低LN的阳性表达面积，有统计学意义（ P ＜0.05）。而与假手术组相比，黄芪甲苷组和大黄酚组的大鼠肾组织LN的阳性表达面积仍有所升高，有统计学意义（ P ＜0.05）。
2）肾组织Ⅲ型胶原的表达：正常情况下，在肾小球系膜区Ⅲ型胶原呈微弱的阳性，除稍大的动脉周围结缔组织呈阳性表达，余肾间质Ⅲ型胶原无表达。在病理条件下，Ⅲ型胶原可表达于肾间质，围绕在萎缩的肾小管周围，或散在于肾间质中。本实验结果中，模型组与假手术组相比，大鼠肾组织Ⅲ型胶原的阳性表达面积明显升高，呈显著性差异（ P ＜0.05）；经治疗后，与模型组相比，黄芪甲苷组和大黄酚组均能显著降低Ⅲ型胶原的阳性表达面积，有统计学意义（ P ＜0.05）。而与假手术组相比，黄芪甲苷组和大黄酚组的大鼠肾组织Ⅲ型胶原的阳性表达面积仍有所升高，有统计学意义（ P ＜0.05）。
（2）讨论与分析：在前期研究中，已证实黄芪甲苷和大黄酚在抗肾纤维化，延缓慢性肾衰进程中发挥的作用，为本研究提供了实验依据。王东等通过体外实验，观察了健脾清化方有效单体对活化的肾成纤维细胞株和系膜细胞株的影响。研究结果中，发现活化的两种细胞株抑制效果最好的是黄芪甲苷，其次是大黄酚。抑制活化的两种细胞株TGF-β的分泌效果最好的是黄芪甲苷，其次是大黄酚。表明TGF β刺激因子可促进成纤维细胞和系膜细胞的活化，黄芪甲苷和大黄酚可抑制活化的成纤维细胞和系膜细胞的增殖和TGF-β的表达。
在本次实验中，模型组大鼠血肌酐、尿素氮、尿蛋白、纤维化指标等均高于假手术组，提示UUO造模成功，成功模拟了肾小管受损，肾间质纤维化的状态。也恰恰证明了肾间质纤维化程度与肾功能减退密切相关。经黄芪甲苷治疗后，我们发现：
肾功能指标：黄芪甲苷组的血肌酐和尿素氮水平较模型组相比均显著下降，具有统计学意义（ P ＜0.05）。但与假手术组相比，黄芪甲苷组的血肌酐和尿素氮水平仍有升高，具有统计学意义（ P ＜0.05）。说明黄芪甲苷能够下降血肌酐和尿素氮的水平，改善肾功能，起到延缓肾功能衰竭的进程，但并不能逆转。
尿蛋白指标：黄芪甲苷组的尿NAG、尿β2 MG、尿α1 MG、24 h尿蛋白定量的水平较模型组相比较显著降低，具有统计学意义（ P ＜0.05）。黄芪甲苷组的尿TF水平较模型组相比无差异，无统计学意义（ P ＞0.05）。但与假手术组相比，黄芪甲苷组的尿α1- MG和24 h尿蛋白定量的水平仍有升高，具有统计学意义（ P ＜0.05）；黄芪甲苷组的尿NAG和尿β2-MG无差异，无统计学意义（ P ＞0.05）。说明黄芪甲苷能明显下降小分子量尿蛋白如尿β2 MG和尿α1 MG以及尿NAG的水平，可以有效改善肾小管变性坏死引起的肾小管功能下降，也可下降24 h尿蛋白定量，改善肾功能。但对于中分子量的尿TRF，黄芪甲苷则无明显作用。其原因可能是TRF在正常情况下不能通过肾小球滤过膜，当肾小管滤过膜电荷选择屏障受损时，尿TRF才会升高。说明本实验中，黄芪甲苷的治疗作用主要表现在肾小管上，对肾小球的作用则较弱。过去的研究表明尿中β2- MG、α1-MG增高提示肾小管重吸收功能下降，可早期反映肾小管功能障碍。尿NAG活性升高可作为肾小管损伤的标志酶。24h尿蛋白定量测定作为诊断肾脏疾病和判断其预后的方法，一直被誉为是“金指标”。
肾组织病理情况：经HE和Masson染色观察，模型组可见部分肾小管和集合管呈囊性扩张，伴有蛋白管型，上皮细胞变性、坏死、脱落，少量小管萎缩消失，间质宽度增加，且可见大量炎症细胞浸润和大量的胶原纤维沉积。黄芪甲苷组的肾小管间质病变与模型组比较，其病变程度较轻，肾小管结构损伤较轻，间质中炎症细胞浸润较少；黄芪甲苷组的蓝染纤维阳性面积率较模型组相比表达明显减少，具有统计学意义（ P ＜0.05）。而与假手术组比较，黄芪甲苷组的蓝染纤维阳性面积率仍有升高，具有统计学意义（ P ＜0.05）。说明黄芪甲苷能够改善UUO模型肾组织纤维化的程度，但并不能逆转纤维化的程度。
5.大黄酚 、 黄芪甲苷对 UUO 模型大鼠细胞因子的影响
（1）研究结果
1）肾组织CTGF的表达：假手术组大鼠肾小管上皮细胞胞质中CTGF呈少量表达，而模型组中大鼠肾小管上皮细胞及肾间质细胞胞质中CTGF呈强阳性表达。模型组与假手术组比，大鼠肾组织CTGF的阳性表达面积明显升高，呈显著性差异（ P ＜0.05）；经治疗后，与模型组相比，黄芪甲苷组和大黄酚组均能显著降低CTGF的阳性表达面积，具有统计学意义（ P ＜0.05）。而与假手术组相比，黄芪甲苷组和大黄酚组的大鼠肾组织CTGF的阳性表达面积仍有所升高，具有统计学意义（ P ＜0.05）。
2）肾组织TGF-β的表达：假手术组大鼠肾间质中TGF-β呈弱性表达，模型组中TGF β呈强阳性表达，可表达在成纤维细胞和肾小管上皮细胞胞质。模型组与假手术组比，大鼠肾组织TGF-β的阳性表达面积明显升高，呈显著性差异（ P ＜0.05）；经治疗后，与模型组相比，黄芪甲苷组和大黄酚组均能显著降低TGF-β的阳性表达面积，有统计学意义（ P ＜0.05）。而与假手术组相比，黄芪甲苷组和大黄酚组的大鼠肾组织TGF-β的阳性表达面积仍有所升高，有统计学意义（ P ＜0.05）。
（2）讨论与分析：何氏研究认为，抗纤灵冲剂可减少单侧输尿管梗阻模型大鼠的微量蛋白尿水平，增加肾纤维化保护因子的表达，减少胶原纤维的积聚，抑制ECM的沉积，促进ECM的降解，从而达到改善抗肾间质纤维化的作用。
经过多年的临床试验和动物实验，都已证实健脾清化方在延缓肾纤维化，治疗慢性肾衰中确实发挥了较好的疗效。在临床试验中，健脾清化方能够提高慢性肾衰患者白细胞介素-2含量，降低尿转化生长因子和血白细胞介素-6的含量，改善患者炎症状态，提高免疫功能，防治肾小管间质的损伤以及由此产生的一系列肾损伤；能改善慢性肾衰患者脂质代谢紊乱，提高细胞免疫功能，从而改善肾功能，降低蛋白尿；能降低超敏C反应蛋白水平及细胞炎症因子白细胞介素-17和干扰素-γ的水平，改善患者微炎症状态，进而延缓慢性肾衰的进程。在动物实验中，健脾清化方能降低5／6肾切除大鼠24h尿蛋白定量、肌酐、尿素氮的水平；减少肾组织TGF β、CTGFmRNA的表达，降低细胞外基质的沉积，改善肾纤维化；降低ATⅡ及NADPH氧化酶的表达，改善氧化应激反应；并能有效阻止p38MAPK信号通路的活化，继而动态调控致炎因子TNF α与抑炎因子IL 10的表达，改善炎症状态，从而起到保护肾脏，防止慢性肾衰进一步恶化。
由此可见，具有益气健脾、清热化湿功效的健脾清化方在治疗慢性肾衰，延缓其发生发展的过程中，其作用机制并不是单一孤立的，而是通过多途径、多靶点、多环节、多层次共同发挥作用的。
1）黄芪甲苷对肾间质纤维化的影响：在细胞因子方面，黄芪甲苷组的TGF-β和CTGF的表达较模型组相比较显著降低，具有统计学意义（ P ＜0.05）。而与假手术组比较，黄芪甲苷组的TGF β和CTGF的表达仍有升高，具有统计学意义（ P ＜0.05）。说明黄芪甲苷能够减少细胞因子TGF-β和CTGF的释放，从而抑制肾间质纤维化的进程，同样不能逆转纤维化的程度。前面已证实细胞因子TGF-β和CTGF是促进肾间质纤维化的重要致病因子。
在纤维化指标方面，黄芪甲苷组的Ⅲ型胶原、FN、LN及α-SMA的表达较模型组相比较显著降低，具有统计学意义（ P ＜0.05）。而与假手术组比较，黄芪甲苷组的Ⅲ型胶原、FN、LN及α SMA的表达仍有升高，具有统计学意义（ P ＜0.05）。说明黄芪甲苷能够直接下调Ⅲ型胶原、FN、LN及α-SMA纤维化指标的表达，进而减少细胞外基质的沉积，改善肾间质纤维化的程度，延缓慢性肾衰的进程，但并不能逆转纤维化的程度。前面也已证实Ⅲ型胶原、FN及LN时细胞外基质的主要成分，α SMA是平滑肌和肌成纤维细胞的标志蛋白，α SMA表达增多，意味着肌成纤维细胞数量增多，进而分泌胶原及产生大量的细胞外基质。
本次实验结果中，我们发现：黄芪甲苷能够减轻UUO模型大鼠梗阻侧肾组织的病理损伤，改善肾功能，减少蛋白尿，其作用机制可能是通过减少细胞因子TGF β和CTGF的释放，降低纤维化指标Ⅲ型胶原、α SMA、FN和LN的水平，抑制成纤维细胞的增殖及向肌成纤维细胞的转化，减少细胞外基质的合成，起到抗肾间质纤维化的作用，进而延缓慢性肾衰的进程。
2）大黄酚对肾间质纤维化的影响：对于大黄酚对肾间质纤维化的研究，过去报道较少。因我们前期研究已初步证实大黄酚对抗肾脏纤维化、延缓慢性肾衰的作用。故本次实验中，以大黄酚作为另一研究对象来进一步探讨其对肾间质纤维化的影响。本次研究结果中，经大黄酚治疗后，肾功能指标：大黄酚组的血肌酐和尿素氮水平较模型组相比均显著下降，具有统计学意义（ P ＜0.05）。但与假手术组相比，大黄酚组的血肌酐和尿素氮水平仍有升高，具有统计学意义（ P ＜0.05）。说明大黄酚能够下降血肌酐和尿素氮的水平，改善肾功能，但并不能逆转。
在尿蛋白指标方面，大黄酚组的尿β2 MG水平较模型组相比均显著下降，具有统计学意义（ P ＜0.05）；但与假手术组相比，大黄酚组的尿β2-MG无差异，无统计学意义（ P ＞0.05）。而大黄酚组的尿NAG、尿α1 MG、24h尿蛋白定量的水平较模型组相比无差异，无统计学意义（ P ＞0.05）。说明大黄酚在治疗尿蛋白上效果欠佳。肾组织病理情况：经Masson染色观察，模型组可见部分肾小管和集合管呈囊性扩张，伴有蛋白管型，上皮细胞变性、坏死、脱落，少量小管萎缩消失，间质宽度增加，且可见大量炎症细胞浸润和大量的胶原纤维沉积。大黄酚组的肾小管间质病变较模型组比较，其病变程度较轻，肾小管结构损伤较轻，间质中炎症细胞浸润较少；大黄酚组的蓝染纤维阳性面积率较模型组相比表达明显减少，具有统计学意义（ P ＜0.05）。而与假手术组比较，大黄酚组的蓝染纤维阳性面积率仍有升高，具有统计学意义（ P ＜0.05）。说明大黄酚能够改善UUO模型肾组织纤维化的程度，但不能逆转纤维化的程度。
在细胞因子方面，大黄酚组的TGF β和CTGF的表达较模型组相比较显著降低，具有统计学意义（ P ＜0.05）。而与假手术组比较，大黄酚组的TGF-β和CTGF的表达仍有升高，具有统计学意义（ P ＜0.05）。说明大黄酚通过减少细胞因子TGF β和CTGF的释放，从而抑制肾间质纤维化的进程，同样不能逆转纤维化的程度。
在纤维化指标方面，大黄酚组的Ⅲ型胶原、FN、LN及α-SMA的表达较模型组相比较显著降低，具有统计学意义（ P ＜0.05）。而与假手术组比较，大黄酚组的Ⅲ型胶原、FN、LN及α SMA的表达仍有升高，具有统计学意义（ P ＜0.05）。说明大黄酚能够直接下调Ⅲ型胶原、FN、LN及α-SMA纤维化指标的表达，减少细胞外基质的沉积，进而改善肾间质纤维化，延缓慢性肾衰的进程，同样不能逆转纤维化的程度。
实验结果中，我们也发现：大黄酚能够显著改善肾功能，减轻UUO模型大鼠梗阻侧肾组织的病理损伤，其作用机制可能是通过减少细胞因子的释放，降低纤维化指标的水平，减少细胞外基质的合成，进而延缓肾间质纤维化的进程。黄芪甲苷和大黄酚虽都能改善肾功能、起到抗肾间质纤维化的作用，但两者之间仍有各自的侧重点。黄芪甲苷在降低尿蛋白上明显优于大黄酚，说明黄芪甲苷在改善肾小管功能上优于大黄酚。究其原因，可能是因为蛋白尿为人体精微物质，由脾生化且有肾封藏，若脾失于运化，肾失封藏，则精微下注形成蛋白尿。脾肾气虚是蛋白尿的根本病机，而黄芪的功效主要是益气健脾，后天又可滋养先天，补气力量显著，故能明显减少蛋白尿的形成。
黄芪侧重补气，大黄侧重清热化湿排毒，本实验中结果显示黄芪甲苷在改善肾间质纤维化的程度明显优于大黄酚，可能是因为肾间质纤维化的发病与脾虚湿热内蕴关系密切，而虚贯穿疾病的始终，尤以虚为主。因黄芪补气功效较强，故证实具有补气功效的黄芪与具有清热化湿的大黄比较，黄芪的有效单体——黄芪甲苷在改善肾间质纤维化的程度上效果显著。说明补气药比清热化湿药更能缓解肾间质纤维化的程度。
大黄酚在改善肾功能这方面优于黄芪甲苷，其原因可能是：肌酐、尿素氮在体内长期蓄积便成为人体有毒物质，可引发各种系统疾病，而大黄清热化湿排毒的功效使浊邪有出路，促进有毒物质的排出，进而保护肾功能。
由此可见，因本研究采用单侧输尿管结扎来制作肾间质纤维化模型，主要影响肾小管的功能，导致肾小管间质的损伤。结合本实验结果，发现具有益气健脾的黄芪对肾小管功能的改善优于具有清热化湿排毒的大黄。
黄芪甲苷、大黄酚虽能改善肾功能、下降尿蛋白、改善肾组织病理情况，减少细胞因子及纤维化指标，但都未能达到正常水平，说明黄芪甲苷、大黄酚只能延缓肾间质纤维化，但不能逆转。但到底是通过何种途径减少TGF-β和CTGF的分泌以及是否存在信号转导通路有待于下一步研究探讨。且本次对黄芪甲苷、大黄酚的研究仅限于动物实验，还需要通过临床实验进一步验证其疗效。
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