5.4 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性测定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）是C ₄ 植物光合碳同化四碳双羧酸循环途径的关键酶，它催化磷酸烯醇式丙酮酸与碳酸氢根（ ，由叶肉细胞内的碳酸酐酶催化CO ₂ 和H ₂ O形成）作用生成草酰乙酸，然后苹果酸脱氢酶催化草酰乙酸与NADPH作用形成苹果酸（Edwards and Jenkins，1988；Takahashi-Terada et al.，2005）。PEPC活性测定以这两个酶反应耦联的方法进行（Hudspeth et al.，1992；Podesta and Andreo，1989），只是所用还原剂不是NADPH，而是NADH（图5-3）。

PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；OAA，草酰乙酸；MA，苹果酸；PEPC，PEP羧化酶；MDH，苹果酸脱氢酶。

这里需要指出，由于草酰乙酸还原成苹果酸的反应是可逆的，所以酶活性测定必须在酶反应的初始阶段进行，因为这时反应体系中只有反应物而没有反应产物，只有正向反应能够进行，而逆向反应不会发生。否则，逆向反应发生后，难以测定出NADH浓度的真实变化。

5.4.1 准备工作

（1）蛋白提取缓冲液配制：提取缓冲液含浓度为50 mmol·L ^-1 的HEPES-KOH（pH 8.0）、15%甘油、10 mmol·L ^-1 的MgSO ₄ 、10 mmol·L ^-1 的巯基乙醇、0.1μmol·L ^-1 的亮抑蛋白酶肽（leupeptin，一种蛋白酶抑制剂），1 mmol· L ^-1 的苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF，丝氨酸蛋白酶抑制剂）和1%的不溶性聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP），配制后4℃预冷备用。

（2）葡聚糖凝胶（Sephadex G-25）柱平衡缓冲液配制：该缓冲液含浓度为50 mmol·L ^-1 的HEPES-KOH（pH 8.0）、15%的甘油、10 mmol·L ^-1 的MgSO ₄ 、10 mmol·L ^-1 的巯基乙醇、0.1μmol·L ^-1 的亮抑蛋白酶肽和1 mmol·L ^-1 的PMSF，配制后于4℃预冷备用。

（3）Sephadex G-25柱预平衡：预先用15 mL平衡缓冲液平衡容积为5 mL的Sephadex G-25柱备用，流速1 mL·min ^-1 。

5.4.2 叶片蛋白质提取

（1）取样：在光下取鲜重约0.5 g或相应叶面积（既可以避免叶片含水量变化的干扰，又便于分析与以单位叶面积表示的光合速率的关系）去除中脉的玉米叶片，用液氮速冻，并用研钵研磨成细粉。

（2）加入5 mL 4℃预冷的提取缓冲液，充分研磨。

（3）将匀浆液于4℃、15000×g离心10 min，取上清液。

（4）取1 mL上清液，用预先平衡好的容积为5 mL的Sephadex G-25柱脱盐，收集前面含蛋白质的流出液，立即用于PEPC活性测定，同时用Bradford（1976）法测定流出液的蛋白质浓度。

5.4.3 PEPC活性测定

测定前配制如下几种溶液。

反应液：含浓度为50 mmol·L ^-1 的HEPES-KOH（pH 8.0）、15%甘油、10 mmol·L ^-1 的NaHCO ₃ 、10 mmol·L ^-1 的MgSO ₄ 和10 mmol·L ^-1 的巯基乙醇。

NADH溶液：100 mmol·L ^-1 ，配制后于-20℃冻存。

PEP溶液：100 mmol·L ^-1 ，配制后于-20℃冻存。

按如下步骤测定酶活性。

（1）将0.96 mL反应液加入比色皿中。

（2）将1.5μL NADH（终浓度0.15 mmol·L ^-1 ），1μL苹果酸脱氢酶（终浓度4 IU）加入比色皿中，30℃保温 5 min。

（3）加入20μL经过Sephadex G-25柱脱盐的叶片蛋白质提取液（含20~40μg蛋白质）混匀。

（4）加入 20μL PEP溶液（终浓度 2 mmol·L ^-1 ）启动反应。

（5）用紫外分光光度计检测在340 nm处OD值的减少，持续检测3 min，计算每分钟OD ₃₄₀ 减少的速率，设为ΔA1。

（6）以不加PEP的实验体系为对照，也用紫外分光光度计检测每分钟OD ₃₄₀ 减少的速率，设为ΔA0。

5.4.4 酶活性计算

PEPC以每分钟催化生成1μmol草酰乙酸分子为1个活力单位。用下式计算酶活性（A，μmol CO ₂ ·min ^-1 ·mg ^-1 蛋白质）：

A =（ΔA1-ΔA0）×V ÷ξ÷P

式中，V为反应体系总体积（1 mL），ξ为NADH在340 nm处的消光系数（6.220 L·cm ^-1 ·mmol ^-1 ），P为反应体系内的蛋白质含量（mg）。

5.4.5 注意事项

（1）应当根据酶活性的高低，确定加入反应系统合适体积的蛋白提取液。如果加入的蛋白质过多，反应速度过快，底物消耗过快，导致测得的酶活力偏低；如果加入的蛋白质过少，反应速度过慢，NADH的自然氧化会对实验结果产生明显的影响。

（2）叶片蛋白粗提液用Sephadex G-25柱脱盐，主要是为了避免叶片蛋白提取液中的小分子代谢物对测定的干扰，有些实验方法利用35%饱和度的硫酸铵沉淀的方法去除这些小分子代谢物。

（3）亮抑蛋白酶肽、PMSF、PVP、巯基乙醇和苹果酸脱氢酶等溶液必须现配现用。

致谢：本研究得到中国科学院B类战略性先导科技专项（XDB27020106）支持。 j6deIj0Nw7OlS2z6rWqOLk3piaEgUY3jctmz9F65E9xg82KaobwUDqq1jkahCCIu