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2.1 拉曼光谱产生机理
光与物质相互作用可以分为三种情况 [1] ：假设物质是均匀的，且不存在热起伏，当光通过物质时，光与物质之间将不存在任何相互作用，即光通过该物质后将不发生任何变化，出射光仍沿原来光的传播方向行进；如果物质是不均匀的，存在着某种起伏，且该起伏与时间的变化无关，那么光通过该物质后其传播方向会发生改变，而光的频率不会发生变化，这种现象叫作弹性散射；如果物质的不均匀性与时间有关，那么当光通过该物质后其传播方向会发生改变，同时光将与物质发生能量交换，使得出射光的能量发生改变，即频率发生改变，这种现象叫作非弹性散射。
拉曼散射属于光与物质之间的非弹性散射。拉曼散射现象在1923年首次由德国科学家 A.Smekal 在理论上进行了预言 [2] ，并于 1928 年由印度科学家 C.V.Raman研究苯的光散射时由实验所发现 [3] 。C.V.Raman也因对于拉曼散射的系统研究而获得了1930年的诺贝尔物理学奖。拉曼散射光的强度约占总散射光强度的10 -6 ～10 -10 。拉曼散射的产生原因是光子与分子之间发生了能量交换而改变了光子的能量。
1.拉曼散射的经典解释 [4]
物质是由离散的电荷组成的，当物质（原子、分子、固体或者液体粒子）受到电磁波辐射时，该物质中的电荷将会在电场的诱导下受迫振荡，产生感生电偶极矩，这个振荡的感生偶极矩又可以视为一个辐射源，可以向四面八方辐射出电磁波能量，因此散射是一种二次电磁辐射。在入射光不强时，单位体积的感应电偶极矩（极化强度 M ）与入射光波的电场强度 E 成正比：
其中 α 为极化率张量。
由经典理论可知：入射光电磁场感生偶极矩为
具有加速度
的电荷辐射电磁波，其辐射强度正比于
。若电磁场中电场的分量
E
按如下形式变化：
式中 υ L 比原子振动频率要大很多，而与电子的振动频率大致相当，则感生偶极矩 M 可写成电场 E 的级数表示式
式中， α 是电子极化率，其数量级为10 -40 CV -1 m 2 ； β 是超极化率，其数量级为10 -50 CV -1 m 2 ； γ 、 ζ 是高阶秩张量。
通常， M 的方向与 E 的方向不一致，即 α 是具有 α βφ 分量的二秩张量，只须考虑各向同性系统中 E 与对称系统中某个对称轴方向平行的情况。
电子极化率
α
取决于系统中电荷的分布，即
α
=
α
（
ρ
）。若在振动期间原子表征电荷分布的参量
ρ
要发生变化，则
α
发生变化。设
E
平行于分子的轴，原子振动期间
ρ
和
α
都要发生变化：在透射和反射中，具有波矢
k
和电场
E
的光垂直入射在物质表面上，激发了振荡，在某一半振动周期，
α
较平衡位置处的
α
0
大；而在另一半振动周期，
α
较平衡位置处的
α
0
小。
α
将随简正坐标
Q
=
（
μ
是约化质量）做线性变化，将
α
的变化按泰勒级数展开：
式中， Q 的一次项确定了一级拉曼效应； Q 的二次项确定了二级拉曼效应。
若分子中的原子以频率 υ q 振动，则由 Q=Q 0 cos υ q t 可得一级拉曼效应中的电子极化率随时间变化规律为 [5]
将式（2-6）代入式（2-1）有
可见，感生偶极矩 M 的振动频率不仅有入射光频率 υ L ，而且还有两种对称分布在 υ L 两侧的新频率（ υ L ± υ q ）。它们来源于原子振动对电子极化率 α 的改变。频率为 υ L 的散射光对应的是频率不变的弹性光散射，如瑞利散射；频率为（ υ L ± υ q ）的散射光对应的是频率发生变化的非弹性光散射，即拉曼散射。频率减少的称为斯托克斯频率；频率增加的称为反斯托克斯频率。
若将电子极化率看成是标量，介质中原子都处于平衡位置时的电子极化率为 α 0 ，对于双原子分子，振动引起电子极化率的改变为Δ α ，则有
假设双原子分子振动模型频率为 υ q ，波矢为 q 的平面波，由它引起的电子极化率的改变量可表示为
而入射光波的频率仍为 υ L ，波矢为 k L 的平面电磁波为 E = E 0 cos（ υ L t-k L r ），则感生偶极矩为
式中（ υ L t-k L r ）与瑞利散射相对应，（ υ L ± υ q ）和 k L ± q 与拉曼散射相对应，这就是拉曼散射光的频率 s υ 和波矢 k s 。因此有
它们分别表示非弹性拉曼散射过程中所遵循的能量守恒和动量守恒定律，由此构成了拉曼散射的选择定则。
因为入射光对双原子分子的作用，其感生偶极矩会按周期规律变化，即振荡偶极子不停地辐射电磁波。由电磁波辐射方程组可推算出偶极子散射强度为 [6]
式中d Ω =sin θ d θ d φ ，单位立体角的散射强度为
沿平行轴方向无散射，对式中 θ 、 φ 进行积分后可得
将
表示式代入上式得拉曼散射强度为
式中，
。
在足够长的时间内，交叉项的平均辐射功率为零，可以略去。可见，拉曼散射的辐射强度中有与瑞利散射相关的项
、与斯托克斯拉曼散射相关的项
及与反斯托克斯拉曼散射相关的项
。可见，经典光电磁场理论能很好地解释拉曼频移的物理起因。但是，在斯托克斯与反斯托克斯散射强度问题的解说中出现了与实验事实相反的结论。
由
的比值
可知
，即斯托克斯散射光强小于反斯托克斯散射光强。但实测的结果相反（
I
Stokes
＞
I
anti
）。可见，用经典电磁理论不能解释散射光强的问题。
2.拉曼散射的量子解释
拉曼散射的经典理论基础是电偶极子在电磁场中振动的概念，经典理论虽然容易理解，但是不足以描述散射过程，所以需要引入量子力学的方法来描述拉曼散射。单色光与分子相互作用所产生的散射现象还可以用光量子（粒子）与分子的碰撞来解释，按照量子理论，频率为 υ 0 的单色光可以视为具有能量为 hυ 0 的光粒子， h 是普朗克（Planck）常数。当具有能量为 hυ 0 的光子与分子作用时，可能发生弹性和非弹性两种碰撞。在弹性碰撞过程中，光子与分子之间不发生能量交换，光子仅仅改变其运动方向，而光的频率不发生改变。这种弹性散射过程对应于瑞利散射。在非弹性碰撞过程中，光子与分子之间发生能量交换。光子不仅改变了运动方向，同时光子的一部分能量传递给分子，转变为分子的振动能量或转动能量，或者光子从分子的振动或者转动中得到能量。在这两种过程中，光子的频率都发生变化。光子得到能量的过程对应于频率增加的反斯托克斯散射；光子失去能量的过程对应于频率减小的斯托克斯散射。
拉曼散射的量子理论能级如图2-1所示。由图可知，分子内处于基态的电子受激发光 hυ 0 的激发而跃迁到一个受激虚态。受激虚态实际上并不存在，是假设的一个不稳定的能级。电子会立即从这个能级跃迁回基态 E 0 。此过程对应弹性碰撞，其跃迁辐射的频率跟激发光的频率一样，都为 υ 0 ，这就是瑞利散射线。处于虚态的分子也可能跃迁到基态的振动激发态 E n ，此过程对应非弹性碰撞，跃迁频率等于 υ 0 -△ υ ，光子把部分能量传递给分子，这就是拉曼散射的斯托克斯线。当处于基态振动激发态 E n 的电子受激发而跃迁到受激虚态，然后立即从这个能级跃迁到基态 E 0 ，此过程也发生非弹性散射，光子从分子的振动转动中得到部分能量，跃迁频率为 υ 0 +△ υ ，这就是拉曼散射的反斯托克斯线。由图2-1 可以看出，斯托克斯和反斯托克斯与瑞利线之间的能量差分别为 h （ υ 0 -△ υ ） -hυ 0 = -hυ 0 和 h （ υ 0 +△ υ ） -hυ 0 =+ hυ 0 ，其数值相等，符号相反，说明拉曼谱线对称地分布在瑞利线的两侧。
拉曼散射光的强度与入射光照射到的分子数成正比。斯托克斯拉曼散射光的强度与图2-1中处于基态的分子数成正比，反斯托克斯拉曼散射光的强度与图2-1中处于基态振动激发态的分子数成正比。在热平衡时，处于某振动能级的分子数目相对于另外能级的分子数目之比服从玻耳兹曼（Boltzmann）分布，即
图2-1 拉曼散射和瑞利散射能级
其中， N 2 和 N 1 分别表示处于较高和较低能级的分子数， g 2 和 g 1 分别表示较高和较低能级的简并度， K 表示玻耳兹曼常数， T 表示温度。热平衡时，处于低能级的分子数总是大于次高能级的分子数，因此斯托克斯拉曼散射光的强度总是大于反斯托克斯拉曼散射光的强度 [7] 。通常我们所说的拉曼散射都是指斯托克斯拉曼散射 [8] 。
考察散射矩的各个矩阵元，有
式中
ψ
n
和
ψ
m
是所考察系统两个态的波函数。积分号后的
M
可以用表达式（2-1）代入。因为
、
ψ
m
、
M
分别有时间因子
，[
M
]
nm
的频率应该为
υ
0
+（
E
n
-E
m
）/
h
，可得振幅为
如果式（2-20）积分对于 E n 和 E m 这两个态的值不等于零，则在入射光的影响下，能够发生从状态 n 到 m 的跃迁。同时，散射光量子的频率为 υ 0 +（ E n -E m ）/ h ，就是说将出现频率移动了（ E n -E m ）/ h 的拉曼线。式（2-20）积分的平方，正比于决定该拉曼线强度的跃迁概率。当 n=m 时，得到的是未发生移动的频率 υ 0 ，此时式（2-20）的平方决定瑞利散射的强度。
如果散射系统（例如，振子或转子）的极化率 α 是常数（与振动或转动无关），则可以把 α 提到积分号的外边。由于本征函数的正交性，除了 n=m 的情形外，所有的积分都等于零，这就是说，当 α 是常数时，只出现瑞利散射，而不出现拉曼效应，这与经典理论的结果相符。只有在考察过程中（即在分子振动或转动时）极化率 α 发生改变时，才可能发生从一个态到另一个态的跃迁，从而发生拉曼位移 [9] 。
拉曼散射的两个基本选择定则前面已经给出：一个是由能量守恒决定的频率选择定则，即 υ S = υ L ± υ q ；另一个是波矢之间的关系，即 k S = k L ± q 。除了这两个选择定则外，还有晶格振动模对称性决定的选择定则 [10] 。外加交变电磁场作用于分子内的原子核和核外电子，可以使分子电荷分布的形状发生畸变，产生诱导偶极矩。极化率是分子在外加交变电磁场作用下所产生诱导偶极矩大小的一种度量。极化率高，表明分子电荷分布容易发生变化。如果在分子振动过程中分子极化率也发生变化，则分子能对电磁波产生拉曼散射，称分子有拉曼活性。有红外活性的分子在振动过程中有偶极矩的变化，而有拉曼活性的分子振动时伴随着分子极化率的改变。因此，具有固有偶极矩的极化基团，一般有明显的红外活性，而非极化基团没有明显的红外活性。拉曼光谱恰恰与红外光谱具有互补性。凡是具有对称中心的分子或基团，如果有红外活性，则没有拉曼活性；反之，如果没有红外活性，则拉曼活性比较明显。一般分子或基团多数是没有对称中心的，因而很多基团常常同时具有红外和拉曼活性。当然，具体到某个基团的某个振动，红外活性和拉曼活性强弱可能有所不同。有的基团如乙烯分子的扭曲振动，则既无红外活性又无拉曼活性。
为了简便起见，将分子简化成偶极子。光入射到偶极子上，会发辐射，其辐射的总强度为
式中， υ 是感生偶极子的振荡频率，也就是散射光的频率； M 0 是感生偶极子的振幅。在笛卡儿坐标系中，沿任一轴方向单位立体角内单位时间的拉曼散射散射强度为 [11]
假设入射光沿 y 轴传播，其电矢量偏振方向沿 x 轴，振幅为 E 。这时在粒子（原子、分子等）中的感生偶极子振幅为
沿 x 轴方向（平行于入射光电矢量方向）测得一个粒子的散射光总强度为
将
代入式（2-23），则有
在前面的计算中，仅考虑了单个偶极子的情况，而实际测量的则是大量分子体系的平均值，极化率张量 α 与偶极子在空间的取向有关，而单个偶极子的取向是任意的。因此，我们求解大量粒子的总的散射光强必须对个别偶极子的可能取向求平均，然后乘上总的偶极子数 N 。根据文献[12]，可得到散射光强为
拉曼散射的相对强度在特定的条件下与待测样品浓度的关系为 [13]
式中， I 为样品表面被光学系统所接收到的拉曼信号强度； K 为拉曼散射截面积； φ 0 为样品表面的激光入射功率； C 为样品中产生拉曼散射的物质浓度； k 0 和 k 分别为入射光和散射光的吸收系数； z 为入射光和散射光所通过的距离； h （ z ）为光学系统的传输函数； b 为样品池的宽度。
由式（2-26）可以看出，在特定的工作条件下拉曼散射光强度与样品中待测物质浓度成正比，而这正是拉曼光谱进行定量分析的依据。但在实验中要得到它们之间的直线关系是比较困难的，因为拉曼散射的强度还受到仪器、样品等许多因素的影响，包括光源功率的稳定性、单色器的光谱狭缝宽度、样品池的大小、样品的自吸收、由于样品浓度不同引起的折射指数的变化和溶剂中的背景噪声等。其中有些因素是难以控制的，因此直接比较不同浓度样品间的拉曼散射强度来进行定量分析是困难的，这可以采用外标法或内标法 [14] 加以校正。
同一物质，用不同频率的入射光照射，产生的拉曼散射光的频率并不相同，但拉曼散射光频率相对于入射光频率的改变量△ υ 却是一个确定的值，频率的改变量△ υ 称为拉曼位移。物质的拉曼位移和激发光的频率无关，只取决于分子本身振动和转动能级的变化。不同的化学键或基态有不同的振动方式，决定了其能级间的能量变化。因此，利用拉曼位移可以知晓分子中官能团和化学键的信息，从而确定分子结构。拉曼光谱是在拉曼散射现象的基础上建立的一种光谱分析方法。将拉曼散射强度相对波长的函数图称为拉曼光谱图，横坐标表示的是散射光相对于激发光波长所偏移的波数，即拉曼位移。若波长以厘米计算，则波数就是波长的倒数，即为cm -1 。每种物质都有自己特定的拉曼光谱图，可根据拉曼谱线的频率、强度和偏振度不同来研究物质的结构和性质。表 2-1 列出了有机化合物的拉曼特征峰频率和振动基团 [15，16] 。
表2-1 有机化合物的特征吸收峰
续表
1.拉曼的噪声和噪声的估计方法
在实际测量中，拉曼光谱中存在多种干扰源，主要包括以下几种 [17，18] ：样品、样品容器等的荧光和磷光背景，样品及其周围环境的黑体辐射，激光及拉曼散射光的发射噪声，CCD探测器的散粒噪声、暗电流噪声及读出噪声，环境中射线导致的尖峰等。这些干扰源会给后续的分析带来极大不准确及不稳定。
测得样品的拉曼光谱之后，首先应对光谱的质量进行评估，以确定该次测量是否有效，如果信号已经被各种干扰所淹没，应确定干扰源并做出调整将其去除后再次进行测量，直到得到较高质量的拉曼光谱。拉曼光谱的质量可以通过噪声标准差估计进行评估。
噪声标准差估计的核心思想是将信号通过高通滤波后，利用滤波后的噪声标准差来估计原始信号中的噪声标准差。这是由于高斯噪声主要集中在高频区域，将原始信号通过高通滤波后，低频信号会被过滤除掉，剩下的高频信号主要为噪声，其信号的干扰很小，此时再进行滤波后噪声的标准差计算更加准确。而经高通滤波器滤波后的噪声方差等于原始信号中的噪声方差乘以该滤波器响应向量的模的平方，由此即可估计出原始信号中的噪声标准差 [1] 。
噪声标准差估计方法主要有小尺度小波变换法、空域相关小波变换法、Donoho 所提出的鲁棒估计法、改进的二阶差分法等 [19～21] 。
（1）小尺度小波变换法
小尺度小波变换法通过对包含噪声的信号进行小尺度小波变换，得到小尺度上的小波系数。由于小波属于高通滤波器，所以小波系数主要是由原始信号中的噪声所引起。计算出小波系数的标准差以及小波滤波器响应向量的模，即可通过计算得到原始信号中的噪声标准差。此种方法思路简单，缺点是估计的准确度较差。因为经小波滤波后的小波系数虽然主要是由原始信号中噪声所引起，但仍含有原始信号中非噪声部分的高频信号，这些信号会使小波系数的标准差估计精度下降，最终导致噪声标准差的估计不够准确。
（2）空域相关小波变换法
空域相关小波变换法由西北工业大学潘泉提出 [19] 。单纯采用一个小尺度上的小波系数来进行噪声标准差的估计容易受到原始信号中非噪声部分高频信号的干扰，潘泉选择在两个相邻的小尺度上对信号进行小波变换。由于原始信号中的一些高频特征在不同的尺度上都有较大的小波系数，而噪声的小波系数则会随着尺度的增加迅速减小，通过相邻尺度小波系数的相关运算可以识别出原始信号中的高频特征，进而将其对应的小波系数剔除，减少其干扰。
（3）Donoho 的鲁棒估计法 [21]
Donoho 的鲁棒估计法也需要对原始信号进行小尺度小波变换，为了避免小尺度小波系数中高频信号的干扰，Donoho 提出采用鲁棒估计法来估计小尺度小波系数的标准差。
（4）改进的二阶差分法
H.Georg Schulze [20] 提出一种改进的二阶差分法，该方法通过对原始包含噪声的信号进行二阶差分运算得到信号的二阶差分光谱。二阶差分运算等效于一个单位脉冲响应序列为[1，-2，1]的高通滤波器，经该滤波器滤波后原始信号中低频部分会被滤除。二阶差分光谱中主要包括原始信号中噪声所引起的元素及有用信号中的高频成分所引起的异常点，H.Georg Schulze提出一种滑动窗口搜索法识别并剔除这些异常点，来避免这些异常点对噪声标准差估计的影响。
2.去噪声方法
为了消除分析信号中背景等噪声对分析结果的影响，科研人员开发了许多基于实验技术的方法来消除背景等噪声。通过利用 632.8nm 的激光进行激发，De Faria 等 [22] 有效除去了皮肤表层和指甲中拉曼光谱原本很强的荧光。Millen 等 [23] 在获取2-吡咯烷酮和2-吡咯烷酮聚合物拉曼光谱时，利用紫外区间的244nm激光进行激发，可避免荧光产生。据O’Grady报道 [24] ，基于拉曼光谱仪器的伪二阶导数能够有效抑制荧光背景的影响。在超滤技术帮助下，Rohleder等 [25] 有效地降低了血液、血浆或血清拉曼光谱荧光背景，从而提高了它们组成预测的准确性。Zhang等 [26] 开发了一种基于下拉涂层沉积拉曼实验方法可减少氨基酸（O-磷酸-L-丝氨酸）和蛋白质（肌红蛋白）样本的荧光背景。通过漂白等技术，Macdonald 等 [27] 消除了丝绸上水彩颜料荧光背景。Oshima [28] 研究发现，通过转移激发方法可抑制蛋白质溶液拉曼光谱的荧光强度。最近，Osticioli [29，30] 利用转移激发差分谱方法有效地抑制绘图颜料拉曼光谱中的荧光。这些基于特定的实验手段常常只适用于特定的样本或对实验设备上有特殊要求，因此限制了它们的应用领域 [31] 。
另外，可以利用化学计量学的方法针对光谱的噪声进行处理消除，为此科研人员提出了众多的方法，目前较为常用的拉曼光谱去噪方法主要有 [1] 滑动窗口平均法、滑动窗口中位值法、Savitzky-Golay 滤波法、小波阈值滤波法。
滑动窗口平均法（Moving Window Average，MWA）采用一个窗口沿着光谱向量平移，逐一求取窗口内元素的算术平均值，替代原始光谱中窗口中心位置处的元素，即可得到降噪的光谱。设其宽度为2 m +1，原始光谱为 S ，平滑后的光谱为 S′ ，有下式：
滑动窗口中位值法（Moving Window Median，MWM）与滑动窗口平均法相似，采用一个窗口沿着光谱向量滑动。不同之处在于，对窗口内部的元素取中位值实现光谱的降噪。设其宽度为2 m +1，原始光谱为 S ，平滑后的光谱为 S′ ，有下式：
Savitzky-Golay滤波法（Savitzky-Golay Filter，SGF）由Abraham Savitzky和Marcel J.E.Golay于1964年提出 [32] 。该方法也是通过一个移动窗口，对窗口内部元素进行多项式最小二乘拟合，得到窗口中心位置处元素平滑后的值。该方法既能够实现良好的去噪效果，又可以较好地保留图谱信号中的有用信息，因此在各种化学图谱信号分析中获得了广泛的应用。但其仍有不足，表现为不能对边界点进行平滑计算，平滑后光谱会丢失边界点的信息；其运算复杂，计算速度很慢，当数据量很大时会很耗时间。
小波阈值滤波法（Wavelet Thresholding Denoise，WTD）。由于对含有噪声的信号进行小波变换后，噪声引起的小波系数主要集中在小尺度上，且其幅值随着尺度增加迅速减小，而有用信号引起的小波系数主要集中在各尺度中少数的位置上，且幅值较大，可利用这个特点对含有噪声的信号进行滤波，设置一个阈值，认为小于该阈值的小波系数是噪声所引起，将其变为零，而大于该阈值的小波系数则是由有用信号所引起，将其保留或者做某种收缩，然后对处理过的小波系数做小波逆变换，重构出去除噪声的信号 [21] 。