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13世纪上半叶，德意志骑士团在第四任骑士团首领萨尔察的赫尔曼的领导下在普鲁士地区站住了脚，他在德意志皇帝和罗马教皇之间灵活地进行斡旋，获得双方给予的特许权，骑士团有了固定的领地，成为一个具有邦国性质的骑士团国家（Ordensstaat）。骑士团国家的领地范围包括原来的老普鲁士地区，即东普鲁士、西普鲁士、直至1561年一直是独立的立沃尼亚、今天的爱沙尼亚和拉脱维亚的大部分地区，此外还包括在德意志帝国境内直属骑士团首领的教会省区。与其他邦国有所不同的是，德意志骑士团国家依然保留比较浓重的、类似修道院的宗教性质。骑士团的成员依然要无条件地遵守自己的誓言，要禁欲、放弃财产和对遗产的继承。另一方面，骑士团国家还具有很强烈的军事机构的特点，骑士团国家下设多个辖区，由骑士团首领任命的团长统治管理，每个辖区都修建骑士团城堡（Ordensburg）。在骑士团国家里，骑士团的首领亲自指定五大头领（Grogebietiger）协助其处理日常事务，即：负责骑士团所有赋税和相关条约事务的大头领（Grokomtur）、负责军事的大长官（Ordensmarschall）、负责医疗救济的大院长（Grospittler）、掌管财政大权的大财政官（Ordenstressler）、负责装备的大军需官（Ordenstrappier）。骑士团国家还效仿西西里王国，与神圣罗马帝国之间缔结了一种“君合国”（Personalunion）的关系。
自13世纪末期以后，骑士团以反对异教为名不断地向立陶宛扩张。1308年，骑士团渡过维斯瓦河，占领维斯瓦河左岸大片地区以及但泽市。1309年骑士团又占领波莫瑞海湾地区，并且在但泽市东南方向的诺佳特河畔修建马林堡（Mareinburg），把在威尼斯的骑士团总部迁移至此。1346年爱沙尼亚被并入骑士团的领地。1398年哥得兰岛也在骑士团的管辖之下。骑士团国家这一系列的扩张不可避免地与立陶宛之间从已有的摩擦升级为武力冲突，由此发生了一场持续一个世纪之久的立陶宛战争（Litauerkriege des Deutschen Ordens）。
14世纪初，立陶宛西部的萨莫基迪恩（Samogitien）还是一片荒芜的“无人区”，为了在普鲁士和立沃尼亚地区之间架起一座“桥梁”，骑士团曾多次进攻该地，但始终未能在这个地区立住足。40年代，立陶宛的雇佣军侵入骑士团的领地，对骑士团的核心地区造成极大的威胁。1347年，英法之间持续了百年的战争落下帷幕，大批的雇佣兵以反对异教的名义被招募加入德意志骑士团，增强了骑士团的军事实力。1348年1月中旬，骑士团及其雇佣兵挺进到考纳斯的东南地区，在涅曼河的支流斯特勒瓦河遭遇立陶宛军队，骑士团在这场激烈的战斗中大获全胜，失利的立陶宛最终丧失在普斯科夫和斯摩棱斯克地区的控制权。50年代，立陶宛皈依基督教，换取了德意志皇帝卡尔四世给予立陶宛大公国和平的保证，但后者却向皇帝提出骑士团应撤离波罗的海东岸地区的要求，遭到严辞拒绝。1362年，立陶宛军队再次入侵骑士团的领地。1370年2月，双方军队在柯尼希山附近的鲁道再次进行了激烈的战斗，立陶宛军队也再次惨败，铩羽而归。
1377年，立陶宛大公瓦迪斯瓦夫二世（Wladyslaw II.Jagie……o，1362—1434，1377—1434年在位）与他的叔父克斯托迪斯（Kstutis，1297—1382）争夺王位。为了减小来自外部的威胁，瓦迪斯瓦夫二世于1380年5月31日与骑士团签订停战协议，向其承诺不再侵入普鲁士和立沃尼亚，并保证不介入骑士团与克斯托迪斯的争斗。1386年，瓦迪斯瓦夫二世和他的支持者维托尔德（Vytautas，1350—1430）合谋夺取波兰的王冠，维托尔德成为立陶宛大公，波兰和立陶宛联合在一起，组成君合国。然而，来自蒙古金帐汗国的威胁迫使维托尔德不得不与骑士团和平相处，他于1398年10月12日与骑士团签订一个有关确定边界维护双方和平的《萨林维尔德条约》（Vertrag von Sallinwerder），条约中订立多项条款，其中包括立陶宛大公承认德意志骑士团对萨莫基迪恩的控制权；确定双方的边界并保证双方的自由贸易往来；双方保证不与他人签订不利于双方和平的条约；允许在立陶宛大公国境内传播基督教；等等。此后，骑士团频频染指波罗的海和北海地区的事务，从中谋取利益。1402年，立陶宛大公为了获得骑士团在军事上的支持，把奥德河东岸的诺伊马克租赁给骑士团。波兰同样早就对诺伊马克有着极大的兴趣，这就使德意志骑士团与波兰之间原本就紧张的关系更加恶化，波兰贵族甚至进入波莫瑞海湾，立陶宛大公则公开支持萨莫基迪恩摆脱骑士团独立，骑士团与波兰和立陶宛之间的战争一触即发。1408年，在匈牙利国王西吉斯蒙德（Sigismund von Luxemburg，1368—1437，1387—1437年在位）的支持下，骑士团在帝国境内招募雇佣兵，这无疑为此后与波兰的战争做好了军备准备。
骑士团是依仗着军事力量建起的“国家”，也依仗着军事力量对外扩张，因此需要庞大的军费开支，征收赋税是军费开支的主要来源。骑士团的国家包含了波罗的海沿岸一些重要的汉萨城市，诸如但泽、柯尼斯堡等海上贸易极为活跃的港口城市，以及地处内陆的托伦、库尔姆等贸易重镇。汉萨城市都享有着城市的自由和自治，汉萨商人们一直自由地从事海外贸易，向斯堪的纳维亚、佛兰德和英国输送谷物和木材，也与匈牙利和俄国有密切的贸易往来。骑士团不仅依仗着强大的军事实力垄断波罗的海沿岸地区的经济大权，而且还在其权力能及的范围内设立总督（Groschffer），向城市和商人征收各种高额的赋税。另一方面，在骑士团国家的辖区内，维斯瓦河右岸就有千余村庄承担着缴纳各种租的义务。骑士团国家的大部分地区都是新皈依基督教，而且是在骑士团刀剑下强行皈依的，与西欧其他地区比较而言基督教教会在社会各方面的影响还很有限，强行征收的什一税增加了民众对教会的不满情绪。1405年，在萨莫基迪恩发生了抵制什一税的起义。不满骑士团强权的市民、贵族等社会各等级多次提出参政的要求，都遭到骑士团首领的拒绝，这就为此后发生的等级起义埋下反抗的火种。
1409年，萨莫基迪恩再次发生反对骑士团的起义，成为波兰立陶宛君合国组成联军共同向德意志骑士团宣战的契机。1410年7月15日，双方军队在坦嫩贝格进行激战，骑士团不败的神话终被打破。1411年2月1日，波兰立陶宛君合国与骑士团在托伦签订了和约，即第一次托伦和约（Erster Frieden von Thorn）。和平协议中规定，骑士团必须把有争议的地区转交给前者，同时还要向其交付十万朔克（Schock）的波希米亚格罗申（Groschen）作为损失赔偿费，为此骑士团不得不在其所辖区域内的城市和贵族征收高额的赋税。另一方面，骑士团的首领并不甘于失败，在筹集赔偿费的同时也在筹集军费，这不仅加剧了城市市民的赋税负担，而且还促使他们在农村加紧实行“遗产复归”（Heimfall）的政策。这一政策的关键在于，骑士团不再需要贵族履行服兵役的义务，因此从他们手中收回土地转而租赁给农民，以此扩大骑士团的收入来源。这一系列强制性的经济措施引起普鲁士贵族和城市市民的极大不满。1440年3月14日，53位贵族和19个城市在克维普结成普鲁士联盟（Preuischer Bund），共同抵制骑士团的强权和不公正。1441年，在普鲁士东部的埃姆兰德地区爆发了农民起义与之相呼应。
为了缓和内部不断激化的社会矛盾，新上任的骑士团首领埃里克豪森·冯·康拉德（Konrad von Erlichshausen，1390或1395—1449）改变了前任强硬的政策，他一方面认可普鲁士联盟，另一方面又企图借助教皇和德意志皇帝的法律权威调停骑士团和普鲁士联盟之间的矛盾。1450年3月，埃里克豪森·冯·路德维希（Ludwig von Erlichshausen，1410或1415—1467）被选为新一任首领，他重又对普鲁士联盟采取强硬的态度，与普鲁士联盟的冲突再起。普鲁士联盟试图在欧洲寻求政治上和军事上的支持，但只有波兰国王积极响应支持。1453年6月24日，德意志皇帝弗里德里希三世（Friedrich III.，1415—1493，1452—1493年在位）在维也纳设立法庭，就有关骑士团和普鲁士联盟的纠纷进行审理，12月1日作出判决，普鲁士联盟是违法组织，下令其解散。普鲁士联盟中的城市成员都不甘心作茧自缚，在曾经为骑士团服役的骑士汉斯·冯·拜森（Hans von Baysen，1390—1459）的领导下奋起反抗。1454年2月4日，普鲁士联盟向骑士团宣战，仅在几天之内，起义者就占领骑士团的大部分领地，攻占普鲁士西部几乎所有的城市。与此同时，普鲁士联盟的起义也得到波兰国王卡斯米尔四世（Kasmir IV. Jagie……o，1427—1492，1447—1492年在位）的支持，他于2月22日向骑士团宣战，由此开始了“十三年战争”（Dreizehnjhriger Krieg）。3月6日卡斯米尔四世接受普鲁士各等级的投诚，把普鲁士联盟占领的地区并入波兰王国，将其划分为库尔姆、波莫瑞海湾、埃尔宾、柯尼斯堡四个公爵领地，任命汉斯·冯·拜森为总督。然而，9月18日在克尼茨（Konitz）的一场战役改变了战局，骑士团以少胜多，收回众多城市和柯尼斯堡。尽管如此，骑士团依然因为失地过多而减少了重要的收入来源，为了筹集经费不得不把诺伊马克出售给勃兰登堡，甚至还用一纸协议把一些城堡租赁给骑士团的雇佣兵们。
15世纪60年代，普鲁士联盟和波兰的军队再次取得一系列胜利，控制了维斯瓦河流域地区。然而，骑士团于1466年却失去了波莫瑞海湾。在教皇使节吕德斯海姆的鲁道夫（Rudolf von Rüdesheim，1402—1482）的调停下，骑士团与波兰于10月19日在托伦第二次签订和约（Zweite Frieden von Thorn）。尽管这个合约从未获得教皇和德意志皇帝的认可，但它却为双方持续了13年的战争画上句号。至此，埃姆兰德、波莫瑞海湾、库尔姆、德莱文茨河畔的米歇劳以及马林堡、施图姆和克里斯特堡周边地区以自治为先决条件臣服于波兰国王，但泽、埃尔宾、托伦等汉萨城市重又获得自治权。普鲁士联盟占领的西部地区广泛地获得自治，形成一个在波兰王室控制之下的“普鲁士王室属地”（“Preuen kniglichen Anteils”）。普鲁士的东部地区虽然仍然归属骑士团，但骑士团的首领要向波兰国王个人宣誓效忠，骑士团国家成为波兰国王的采邑。
进入16世纪，德意志帝国开始帝国改革和宗教改革，骑士团的首领阿尔布雷希特（Albrechtvon Preuen，1490—1568）试图重新恢复昔日的骑士团国家，解除与波兰国王的采邑关系，于1520年再次与波兰进行了一场未有结果的战争。1522年，为了寻求德意志皇帝的支持，阿尔布雷希特前往纽伦堡，然而他的希望落空了。1523年11月，阿尔布雷希特在纽伦堡结识宗教改革运动的发起者马丁·路德（Martin Lu the r，1483—1546），在此后的书信来往中，路德建议阿尔布雷希特放弃骑士团首领的称谓，将骑士团国家改为公爵领地。次年，对德意志皇帝极度失望的阿尔布雷希特拒绝为皇帝出兵意大利，再次面临陷入战争的危险，为此不得不又投入波兰国王的庇护之下。1525年4月8日，阿尔布雷希特在克拉科夫向波兰国王西吉斯蒙德一世（Sigismund I.，1467—1548，1507—1548年在位）宣誓效忠，此时他不再是以骑士团的首领的身份，而是作为世俗诸侯接受普鲁士公爵领地（Herzogtum Preuen）。阿尔布雷希特是普鲁士公爵领地的第一任公爵，在此之后普鲁士公爵领地逐渐发展成为德意志帝国内最强大的君主国。