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核酸分离和纯化过程中需要特别注意的问题是防止核酸的降解和变性，应尽可能保持其在生物体内的天然状态。要制备天然状态的核酸，必须采用温和的条件，防止过酸、过碱、高温、剧烈搅拌，尤其要防止核酸酶的作用。天然核酸具有生物活性，这是检验其完整性的重要指标。物理化学性质也常用来作为评价核酸质量的标准。
1 核酸密度梯度超离心
核酸密度梯度超离心是指液体在离心时，其密度随转轴距离而增加。碱基GC配对的双链DNA片段密度较大，利用精密的密度梯度超离心技术可使切割适当片段的不同DNA按密度大小分布开来。进而通过与某种放射性标记的mRNA杂交来检验，分离相应的基因。非洲爪蟾rDNA.5sDNA和海胆组蛋白基因就是这样分离得到的。密度梯度超离心技术不仅可以分离细胞中的DNA，也可以利用它分离到生物细胞中的某些目的基因的mRNA。
2 “沉降平衡”超离心技术的常用介质、操作原理
1 影响核酸电泳迁移率的因素
（1）凝胶的孔径：胶太浓，孔径太小，核酸样品无法进入胶内；胶太稀，机械强度差，无法维持固定形状，因此孔径也不可能太大。
（2）核酸的相对分子质量、电荷量、分子空间构象：在一定范围内，线性双链DNA在电场中的迁移率与其碱基对数目的对数成反比。这是因为较大的分子穿过凝胶介质所受拖曳阻力较大以及蠕动通过凝胶孔径的效率较小。RNA在变性凝胶中电泳时，相对分子质量的对数才与迁移率成反比。
2 被分离出的核酸种类顺序
分子量的常用对数与泳动率成反比关系，分子量相同的质粒DNA迁移速率则是：闭环型＞线性＞单链开环型。
3 比较琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）对样品的种类和分子量的要求
（1）琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子大小从数百bp到上百kb。琼脂糖凝胶电泳较少用于RNA，它只能分离某些大分子的RNA，如rRNA和病毒RNA。
（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于分离RNA样品以及分子小于2kb的DNA片段，因其高分辨率常用于DNA和RNA的测序。
（3）脉冲电场凝胶电泳分离大分子DNA并无上限，它已成为百万碱基级（Mb）基因组操作的一项关键技术。
1 分子杂交的概念
核酸的杂交是指不同的DNA分子或DNA和RNA之间通过碱基互补配对的原则，组合成新的杂交分子的过程。杂交分子可以是两条脱氧核苷酸链，也可以是一条脱氧核苷酸链和一条核糖核苷酸链。
2 DNA印迹技术的基本原理和应用范围
Southern印迹法即DNA印迹，是将基因组DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上。经碱处理凝胶使DNA变性（使双链DNA变成单链），通过具有一定盐离子浓度溶液的毛细管作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，经过干燥或紫外线照射处理。单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢牢地固定到转移膜上，转移后的单链DNA分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交。经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。
核酸杂交应用广泛，可用来检测特殊核苷酸序列的一个或更多的DNA片断，是基因芯片、基因探针的工作原理。
3 DNA印迹技术的实验过程
Southern印迹法就是将电泳凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上后，再进行杂交的DNA转移至固相支持体的过程中，各个DNA片段的相对位置保持不变，用放射性标记的DNA与固着于滤镜上的DNA杂交，经放射自显影锁定与探针互补的电泳条带的位置。该技术主要用于基因组DNA的分析。
两种常用核酸柱层析的分离特点和对样品分子特殊要求的对比情况如下表所示：
表1-7-8 核酸柱层析
1 化学法测序DNA的要点
化学法测序是用特异的化学试剂作用于DNA分子中不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，能使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段，其末端都是该特异的碱基。有4组特异的反应，如下表所示：
表1-7-9 化学法测序
2 测序DNA的两位有贡献的科学家
在1953年，F.Sanger就已完成了胰岛素的测序工作。1954年P.R.Whitfeld提出测定多聚核糖核菌酸序列的降解法，即利用高碘酸盐的氧化作用逐一降解并鉴定末端核苷酸。1975年Sanger提出了一种崭新的策略，他并不逐个测定DNA的核苷酸序列，而是设法获得一系列多核苷酸片段，使其末端固定为一种核苷酸，然后通过测定片段长度来推测核苷酸的序列。