1 核酸的酸水解、碱水解、酶水解特性
2 限制性内切酶的作用特点及主要用途
限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列,并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶,简称限制酶。限制作用实际就是限制酶降解外源DNA,维护宿主遗传稳定的保护机制。
根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式,可将限制酶分为三种类型,分别是:
(1)第一型(Type Ⅰ),具有修饰及识别切割的作用,另有识别DNA上特定碱基序列的能力,通常其切割位距离识别位可达数千个碱基之远。
(2)第二型(Type Ⅱ),只具有识别切割的作用,修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文序,所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列,是遗传工程上,实用性较高的限制酶种类。
(3)第三型(Type Ⅲ),与第一型限制酶类似,同时具有修饰及识别切割的作用。可识别短的不对称序列,切割位与识别序列约距24~26个碱基对。
核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解离,因此核酸为两性电介质,它们在不同pH的溶液中解离程度不同,在一定条件下可形成兼性离子。
因为嘧啶和嘌呤化合物杂环中的氮和各取代基都具有结合和释放质子的能力,所以这些物质既有碱性解离又有酸性解离的性质,这样使得碱基也具有两性解离的性质。
由于戊糖的存在,使得核苷中碱基的解离受到一定的影响,增强了碱基酸性解离。
因为存在磷酸基,使核苷酸具有较强的酸性。在核苷酸中,碱基部分的解离是与核苷相似的,但由于磷酸基的存在,使得核苷酸增加了酸性解离的部分。因此,核苷酸的解离是由磷酸与碱基两部分的解离综合的结果,在不同pH溶液中的解离程度不同,可形成兼性离子。
核酸分为DNA和RNA。DNA的等电点为4~4.5,RNA的等电点为2~2.5。
1 核酸的紫外吸收波段和最大峰值
由于嘌呤碱与嘧啶碱都具有共轭双键,导致核酸在240~290nm区域内的紫外波段有一强烈的吸收峰,最大吸收值在260nm附近(蛋白质最大吸收值280nm)。
2 核酸纯度的测定公式、计算
读出260nm与280nm的吸光度(A),从A 260 /A 280 比值判断样品的纯度:纯DNA应在1.8左右,大于2.0说明有RNA污染,小于1.6说明有蛋白质污染;纯RNA应达到2.0,若样品混有杂蛋白,比值明显降低。
1 核酸变性、增色效应的定义
表1-7-6 增色效应和减色效应的比较
2 DNA热变性时影响Tm的因素
DNA的熔点或熔解温度是指加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度,用T m 表示。DNA的T m 值一般在82~95℃之间。
表1-7-7 DNA的T m 值的影响因素
3 减色效应、复性的定义及其应用
(1)减色效应:若变性DNA复性形成双螺旋结构后,其260nm紫外吸收会降低。
(2)复性是指DNA在适当条件下,原本已经分开的链通过氢键又重新缔合成为双螺旋结构的过程。DNA复性后,许多物化性质又得到恢复。
1 核酸的诱变因素
核酸诱变的因素可分为三类:
(1)物理因素:紫外线、激光、X射线等。
(2)化学因素:亚硝酸、秋水仙素、硫酸二乙酯等能改变核酸的碱基。
(3)生物因素:某些病毒的遗传物质能影响宿主细胞的DNA等。
2 酶促甲基化的作用部位及原理
甲基化是指从活性甲基化合物上将甲基催化转移到其他化合物的过程,可形成各种甲基化合物,或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。在生物系统中,甲基化是经过酶催化形成的。
脊椎动物的DNA甲基化一般发生在CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点,即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点)。经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。这种甲基化涉及重金属修饰、基因表达的调控、蛋白质功能的调节以及核糖核酸(RNA)加工。