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第二节

蛋白质分离纯化

一、根据溶解度差异分离蛋白质

1 等电沉淀、盐析、盐溶的分离原理和应用特点

(1)等电沉淀

①原理:蛋白质处于等电点时,其净电荷为零,由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时,它的溶解度达到最低点,以达到分离蛋白质的目的。

②应用特点:蛋白质的等电点会受到很多因素的影响,等电沉淀只可以应用到等电点不同的蛋白质分离。

(2)盐析和盐溶

表1-3-1 蛋白质的盐溶和盐析

2 有机溶剂沉淀、蛋白质变性沉淀的分离原理和应用特点

(1)有机溶剂沉淀

①原理:能够与水互溶的有机溶剂可以使蛋白质在水中的溶解度显著降低,并且还伴随着变性,主要原因有两方面:一是降低了水溶液的介电常数;二是有机溶剂与蛋白质直接争夺水化水,致使蛋白质聚集而沉淀。

②应用特点:有机溶剂可引起蛋白质变性,但如果在低温下操作,并且尽量缩短处理时间则可使变性速度减慢。

(2)蛋白质变性沉淀

当蛋白质溶液的稳定条件(质点大小、电荷和水化作用)被破坏,蛋白质就会从溶液中沉淀析出。

表1-3-2 蛋白质的沉淀方法

二、根据分子大小差异分离蛋白质

1 透析

透析是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里,放入透析液(蒸馏水或缓冲液)中进行的,透析液可以更换,直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最少为止。主要应用于除去蛋白质中的小分子物质。

2 超滤

超滤是利用压力或离心力,强行使水和其他小分子溶质通过半透膜,而蛋白质被截留在膜上,以达到浓缩和脱盐的目的。

3 密度梯度离心

蛋白质的密度对于蛋白质颗粒的沉降速度会产生一定影响。蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时,质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快,并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时,则静止不前,最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带。

4 凝胶过滤的分离原理和实验技术应用特点

凝胶过滤分离主要是根据蛋白质分子大小和形状不同进行分离。凝胶过滤所用的支持介质是凝胶珠,其内部是多孔的网状结构。当蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶孔径大的分子不能进入珠内的网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外;比网孔小的分子则不同程度地能自由出入凝胶珠的内外,走过的路径较长。这样不同大小的分子由于所经的路径不同而得到分离,大分子物质先被洗脱出来,小分子物质后被洗脱出来。如果质量相同的蛋白质分子,线型分子先洗脱,球状分子后洗脱出来。

表1-3-3 根据蛋白质分子大小分离方法

三、根据电荷不同分离蛋白质

1 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)、等电聚集电泳、双向电泳的分离原理和实验技术应用特点

电泳是基于荷电颗粒(如蛋白质离子)在外电场中的移动速度不同而达到分离的一项技术。在外电场的作用下,电荷荷电颗粒将向着与其电荷符号相反的电极移动。

(1)PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳):是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术,用于分离蛋白质和寡核苷酸。聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应。它有两种形式:

①非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳:在电泳的过程中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。

②SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE):SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。

(2)等电聚集电泳:即利用一种特殊的缓冲液(两性电解质)在凝胶(常用聚丙烯酰胺凝胶)内制造一个pH梯度,电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点(pI)的pH处,此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷,形成一个很窄的区带。

(3)双向电泳:是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合。蛋白质第一次分离是在薄胶条上进行等电聚焦,然后把胶条水平向铺设在片状凝胶上用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行第二次分离。即先进行等电聚焦电泳,按照pH分离至各自的等电点,形成一个很窄的区带;然后再进行SDS-PAGE,按照分子大小分离。

2 阳离子交换层析、阴离子交换层析的分离原理和应用特点

离子交换层析是利用在给定pH下蛋白质的净电荷符号和数量的不同而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂;而带有负电荷的称之阳离子树脂。

(1)阴离子交换树脂的基质带有负电荷。当蛋白质处于不同的pH条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,所以这类蛋白质被留在柱子上,然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施,将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来,结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。

(2)阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

离子交换层析技术主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质,也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。

四、根据蛋白质吸附特性分离蛋白质

1 吸附层析的定义

吸附层析是指用吸附剂作为固定相,利用被分析组对于吸附剂表面吸附能力的差异,以及在流动相中溶解度的差异来进行分离分析的一种方法。

2 吸附层析的应用特点

吸附层析特别适用于很多中等分子量的样品(分子量小于1000的低挥发性样品)的分离,尤其是脂溶性成分,一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水住化合物等的分离。吸附层析的分离效果,决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。

五、根据生物分子特异亲和力分离蛋白质

1 亲和层析的定义

生物分子间的相互作用是具有选择性的,亲和层析就是利用蛋白质分子对其配体分子具有专一性识别能力或称生物学亲和力建立起来的一种有效的纯化方法。

2 亲和层析的应用特点

(1)通常只需要经过一步的处理即可将某一含量少的所要蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度和产率还相当高;

(2)可以在活性物质中除去化学和物理性质几乎完全相同,但已失活了的“杂质”,这一点对提高酶或其他生物活性物质的比活特别有用。 84knw9C9mQHZ5pUpzqZ96YhvXm/CY6NIW1GoAKYXwuWRMHEOKBMfyqzyqjKEtdEl

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