【摘要】 2018年，在结核病的分子生物学诊断领域主要集中在病原菌的分子生物学诊断方面，且主要以检测结核分枝杆菌DNA为主，其中Xpert MTB /RIF技术仍然占据主导地位；此外，其他分子生物学诊断技术，如LAMP技术、PCR技术等均取得了一些进展。而结核分枝杆菌RNA的检测，如SAT技术在结核病领域中的应用也越来越广。

【关键词】 分子生物学；诊断；DNA；RNA

在结核病分子生物学诊断方法中，病原菌的分子生物学诊断在结核病诊断中占据重要地位。病原菌DNA检测是本年度的核心，所使用的技术包括Xpert MTB /RIF技术（简称Xpert）、环介导等温扩增技术（LAMP）、PCR技术；RNA检测技术为RNA恒温扩增实时荧光检测技术（SAT）。相关分子生物学诊断技术的应用值得临床医师进一步学习及借鉴。

一、结核分枝杆菌DNA检测技术

1.Xpert MTB /RIF技术

Xpert技术对于结核病患者的初步诊断具有一定的应用价值。王蔚等 ^[1] 在对浙江省嘉兴市第一医院就诊的初诊疑似肺结核患者361例采用不同的方法检测，结果显示，Xpert检测的阳性率[32.41%（117/361）]明显高于涂片镜检[22.71%（82/361）]（ χ ² =8.49， P <0.05）；184例肺结核患者中，Xpert检测的阳性率[63.59%（117/184）]高于涂片镜检[36.41%（67/184）]和液体培养[48.91%（90/184）]（ χ ² =27.17， P <0.01； χ ² =8.05， P <0.05）；117例阴肺结核患者的Xpert检测阳性率[42.74%（50/117）]高于液体培养[24.79%（29/117）]（ χ ² =8.43， P =0.004）。以临床诊断为标准，Xpert检测初诊疑似肺结核患者的敏感度为63.59%（117/184），特异度为100.00%（177/177），正确指数为0.64。以固体比例法药物敏感性试验结果为“金标准”，Xpert检测利福平耐药的敏感度为4/5，特异度为97.70%（85/87），正确指数为0.97。由此可见，Xpert在初诊疑似肺结核患者，尤其是涂阴肺结核患者中，检测结核分枝杆菌感染及对利福平耐药具有较高的效能。

刘荣梅等 ^[2] 选择首都医科大学附属北京胸科医院261例疑似肺结核的住院患者进行检测，结果以临床诊断参考标准为“金标准”，Xpert和Hain MTB DRplus的敏感度分别为83.1%和72.3%，特异度分别为94.7%和100%。以痰罗氏培养为“金标准”，Xpert诊断肺结核的敏感度为81.7%；Hain MTB DRplus诊断肺结核的敏感度为74.4%。以绝对浓度法药敏结果为“金标准”，Xpert检测利福平耐药的敏感度为77%，Hain MTB DRplus检测利福平和异烟肼的敏感度分别为78.4%和80.5%。应用NRI比较Xpert和Hain MTB DRplus两种检测技术的诊断能力，NRI=0.055。由此得出，痰Xpert和Hain MTB DRplu检测结核分枝杆菌的敏感度和特异度高，可用于肺结核的早期诊断及其耐药性检测。

贾晨光等 ^[3] 应用Xpert系统对168例疑似脊柱结核术中脓液标本进行检测。研究发现，168例脊柱结核患者术中脓液标本中，134例Xpert检测结核分枝杆菌阳性，其中利福平耐药25例。以临床诊断为“金标准”，Xpert检测结核分枝杆菌的敏感度为79.76%（134/168），特异度为96.87%（47/50）。在134例脊柱结核脓液标本中，存在利福平耐药突变基因25例，耐药突变率为18.66%。168例脊柱结核患者脓液标本中，抗酸染色阳性51例，结核分枝杆菌快速培养阳性70例。由此可见，Xpert MTB /RIF是一种能够同时对脊柱结核行结核分枝杆菌与利福平耐药性检测的分子检测技术，在脊柱结核的快速诊断中具有较高的诊断价值。

除此之外，Xpert Ultra检测是由WHO提出的一种新方法。王淑琦等 ^[4] 指出，该方法与Xpert检测相比，对含菌量少的标本检测敏感度更高，如肺外结核、TB并发艾滋病、儿童结核病等，对于正确选择治疗药物、制定合格的治疗方案有重要的意义。

2.LAMP技术

140例临床诊断为肺结核患者的痰标本检测结果显示 ^[5] ，1 401例痰标本中，抗酸染色涂片及LAMP法的阳性检出率分别为29.3%（41/140）和45.0%（63/140）。与抗酸染色涂片法比较，LAMP法的灵敏度为97.6%（40/41）、特异度为76.8%（76/99），总体一致率82.9%（116/140）。两种方法一致性相比，差异有统计学意义（Kappa=0.642， P <0.05），两者一致性良好。在检测时间上，与涂片法相比，大批量标本检测中LAMP法所用时间较短。

樊丽超等 ^[6] 收集沈阳市胸科医院疑诊结核性脑膜炎病例109例进行检测，结果显示，109例患者中确诊为结脑的病例为81例，脑脊液抗酸杆菌涂片法、脑脊液MGIT 960液体培养法、脑脊液LAMP法阳性检出率分别为4.94%（4/81）、28.40%（23/81）、58.02%（47/81），LAMP法诊断结核性脑膜炎的敏感度为58.02%，特异度为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为45.16%，约登指数为0.58。由此可见，LAMP法诊断结核性脑膜炎的敏感度和特异度较高，对结核性脑膜炎的早期诊断有一定的临床价值。

吴丹丹等 ^[7] 用RT-LAMP、LAMP、L-J法检测100名结核病患者和22名来自无结核病患者痰标本中的结核分枝杆菌测试灵敏性；对浓度为1ng/标准株进行对倍比稀释用于RTLAMP极限检测实验。结果得出，RT-LAMP、LAMP、L-J方法的阳性率分别为100%、92%和88%；RT-LAMP和L-J、RT-LAMP和LAMP差异均有统计学意义；RT-LAMP的灵敏度比LAMP高10倍；RT-LAMP不仅可以识别活菌，并且能够重复检测 MTB 的单一拷贝。结论为RT-LAMP检测效果优于LAMP及L-J，适于基层医院结核病诊断的推广和应用。

同时，王少华等 ^[8] 比较CPA、恒温核酸扩增荧光检测（RealAmp）法与Xpert MTB /RIF法对肺结核诊断的效果，通过对3 193例疑诊肺结核患者检测分析，提出CPA、RealAmp与Xpert MTB /RIF检测痰标本的敏感度和特异性相似，但CPA与RealAmp检测快速、简便，更适于基层实验室对肺结核的诊断。

3.PCR技术

对新疆维吾尔自治区胸科医院的976例疑似结核病患者，刘艳等 ^[9] 运用探针荧光PCR溶解曲线法检测结核分枝杆菌及其对利福平、异烟肼的耐药突变情况。结果显示，以MGIT 960液体培养结果为标准，荧光PCR溶解曲线法鉴定结核DNA的敏感度为85.44%（135/158），特异度为94.01%（769/818），Kappa值为0.75，诊断符合率为92.62%（904/976）。以MGIT 960液体药敏试验结果为标准，荧光PCR溶解曲线法对异烟肼耐药突变检测的敏感度为83.33%（20/24），特异度为94.59%（105/111），Kappa值为0.76，诊断符合率为92.59%（125/135）；荧光PCR溶解曲线法对利福平耐药突变检测的敏感度为95.83%（23/24），特异度为95.50%（106/111），Kappa值为0.86，诊断符合率为95.56%（129/135）。由此得出，荧光PCR溶解曲线法检测速度快，对利福平和异烟肼耐药突变检测结果具有良好的敏感度和特异度，可用于临床上对结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药情况的快速筛查。

寿娟等 ^[10] 通过荧光PCR的方法检测胸腔中游离的DNA，检测结核组103例，cfDNA法阳性65例，阴性38例，其中3例初次实验为弱阳性，重复实验后为阳性，灵敏度为63.11%；细胞块DNA法阳性24例，阴性79例，其中4例初次实验为弱阳性，重复实验后为3例阳性，1例阴性，灵敏度为23.30%；抗酸法阳性12例，阴性91例，灵敏度为11.65%；cfDNA法灵敏度高于细胞块DNA法及抗酸法（ χ ² 值分别为18.293及7.329， P <0.05）。研究指出，荧光PCR检测胸腔积液中结核分枝杆菌cfDNA能够很大程度上提高检测阳性率，其在胸腔积液结核分枝杆菌的病原学诊断方面比起检测细菌细胞内DNA更具优势，作为结核病的诊断手段具有重要的理论和实践意义。

李自慧等 ^[11] 设计合成IS6110和IS1081扩增引物和检测探针，建立ddPCR检测体系。应用该体系检测分枝杆菌、痰和血浆3种DNA样本中靶标拷贝数，进行统计学分析。该体系具有较好的重复性（r>0.95），以非结核分枝杆菌为对照，检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异度均为100%。在痰和血浆DNA样本检测中，2个靶标拷贝数在肺结核组均显著高于对照组。由此可见，该系统可用于肺结核患者临床分离株、痰和血浆样本的微量核酸检测，对提高结核病病原学诊断能力有重要意义。

二、结核分枝杆菌RNA检测技术

廖鲁燕等 ^[12] 选取聊城市传染病医院收治的有胸腔积液的患者210例作为研究对象，比较了各检测方法的检测效能。结果显示，SAT-TB检测的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为36.36%（52/143）、98.51%（66/67）、98.51%（52/53）、42.04%（66/157）。SAT-TB检测的敏感度明显高于涂片法[3.50%（5/143）]及罗氏培养法[20.28%（29/143）]，差异均有统计学意义（ χ ² =19.08， P =0.021； χ ² =9.12， P <0.01）。SAT-TB法检测完成时间为1～2小时，罗氏培养法完成时间为6～8周。由此可见，SAT-TB法能快速检测胸腔积液中的结核分枝杆菌，敏感度高于涂片法和罗氏培养法。

许蕴怡等 ^[13] 研究发现，对疑似肺结核患者的痰液169份、支冲液151份进行SAT法检测，以BD960法为参考标准，SAT法对肺结核患者在痰液、支冲液标本的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为：84.00%、93.06%、91.80%、62.04%；51.82%、94.29%、96.61%、42.39%；51.55%、95.83%、94.34%、59.48%；33.64%、90.24%、90.24%、33.64%。由此可见，SAT-TB法检测痰液和支冲液标本中的结核分枝杆菌具有快速、敏感度高的优点，可提高结核分枝杆菌的检出率。

除了单独使用以上技术检测结核病外，王桂荣等 ^[14] 收集了1 955例诊断为结核性胸膜炎的患者，研究了不同技术联合检测痰液和胸腔积液对结核性胸膜炎的诊断价值，最终得出的结论为：联合检测痰液和胸腔积液中结核分枝杆菌的阳性检出率高于单独检测，对于疑似结核性胸膜炎的患者，应尽量进行标本检测，以提高对结核性胸膜炎的参考价值。

世界卫生组织结核病数据库中我国结核病发病率等指标的分析结果显示，整体上中国结核病发病率和新发患者数均呈现逐年递减趋势 ^[15] 。但若不采取其他更强有力的措施，很难达到世界卫生组织提出的2035年终止结核病战略的目标。

综上所述，以Xpert为主的分子生物学诊断技术得到进一步应用，国内结核病分子诊断技术的应用取得了一些进展，但与此同时，为实现2035年终止结核病战略的目标，仍需要不断提高结核病诊断技术，以实现最终目的。

（孙照刚　常蕴青　唐神结）

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