【摘要】 细菌学检查仍是结核病诊断的重要辅助检查，主要包括抗酸染色镜检、分枝杆菌培养及表型药敏检测等，鉴于其简单、易行及经济实惠，国内基层医院均广泛开展。今年关于细菌学检查的应用及研究主要集中在对于抗酸染色的脱蜡方法探索、各种细菌学检查手段与分子诊断技术的比较，以及全国各地大样本的耐药情况分析。细菌学检查仍是临床上不可忽略的检查手段，但医院对检验的质量和医师的培训应严格把关，临床医师也应根据当地条件、患者病情酌情选择及推荐诊断方法，必要时联合应用多种检验方式可以大大提高结核分枝杆菌的阳性检出率。

【关键词】 涂片镜检；分枝杆菌培养；药物敏感性试验；耐药情况分析；非结核分枝杆菌；药敏试验结果的判读

虽然目前结核分枝杆菌（ Mycobacterium tuberculosis ， MTB ）的分子生物学诊断已被列作结核病确诊的一种重要方法，其检测的灵敏度与特异性均已达到较高的水平，但结核病细菌学诊断作为结核病诊断“金标准”的地位在我国一直未被撼动，但从方便、普及性等各方面来看，细菌学的诊断仍占据主导地位。抗酸染色涂片镜检因其价格低廉、易于开展，仍是各级医院与预防机构初筛结核病的主要手段；病理组织切片中找到 MTB 仍然是结核病诊断的“金标准”； MTB 培养为表型药敏检测提供了基础；表型药敏检测方法因可同时检测十几种一线和二线抗结核药物的单药和两种药物联合的耐受水平，简单、经济，适合基层。2018年国内科学家将结核病细菌学诊断的各种新、旧方法应用于临床、科学研究及大样本统计调查，从而能更有效地指导临床、预防控制管理及公共卫生决策，现将相关研究结果总结归纳如下。

一、涂片镜检

不同的脱蜡剂会对抗酸染色的结果产生不同的影响，薛晓伟等 ^[1] 就分别选择环保型脱蜡剂和常规二甲苯脱蜡进行抗酸染色的使用效果进行比较，作者选取北京协和医院病理科2010—2017年间诊断的符合纳入标准的结核病例40例，进行回顾性抗酸染色研究。结果提示，使用常规二甲苯脱蜡的抗酸染色，其中阳性35例，可疑阳性3例，阴性2例；使用环保型脱蜡剂脱蜡的抗酸染色，阳性36例，可疑阳性2例，阴性2例，两者阳性率分别为87.5%和90%，差异无统计学意义。因此，作者认为环保型脱蜡剂为无色、无味的有机溶剂，不含芳香族化合物，具有较强的溶解石蜡的作用，对所要显示的组织和细胞无影响，并且与乙醇的相容性好，本次实验中将其试用于抗酸染色的过程中，结果显示其脱蜡效果较好，抗酸染色的结果与二甲苯脱蜡效果接近一致。

李玉雪等 ^[2] 通过选取肺结核确诊病例的痰标本共325份（其中涂阳标本81份），同时采用改良抗酸染色法、交叉引物恒温扩增（crossing priming amplification，CPA）技术、改良抗酸染色法联合CPA技术和Xpert MTB /RIF技术对标本进行检测，评估4种方式的阳性检出率。结果显示，81份涂阳标本中改良抗酸染色法、CPA、改良抗酸染色法联合CPA技术和Xpert MTB /RIF 4种方式的总体阳性检出率分别为91.4%（74/81）、93.8%（76/81）、95.1%（77/81）、98.8%（80/81），4组比较差异无统计学意义；244份涂阴标本，改良抗酸染色法、CPA、改良抗酸染色法联合CPA技术和Xpert MTB /RIF 4种方式的总体阳性检出率分别为20.1%（49/244）、46.7%（114/244）、54.9%（134/244）、54.5%（133/244），改良抗酸染色法阴性率低于CPA技术组、改良抗酸染色法+CPA技术组、Xpert MTB /RIF技术组，差异有统计学意义（ P <0.05），后3组比较差异无统计学意义（ P >0.05）；改良抗酸染色法、CPA、改良抗酸染色法联合CPA技术和Xpert MTB /RIF 4种方式的总体阳性检出率分别为37.8%（123/325）、58.5%（190/325）、64.9%（211/325）、65.5%（213/325）。综上所述，改良抗酸染色法、CPA技术、改良抗酸染色法联合CPA技术和Xpert MTB /RIF技术对肺结核均具有良好的辅助诊断价值，诊断涂阳及涂阴肺结核时，改良抗酸染色法联合CPA技术可以有效替代高成本的Xpert MTB /RIF检测技术，在基层医院有良好的应用前景。

涂片镜检因操作方便、实验无需特别仪器、价格低廉，一直以来都是临床诊断结核病重要的诊断依据，但传统的涂片镜检法阳性率低，国内研究者对涂片镜检法进行改进和评估。西安市胸科医院杨翰等 ^[3] 探讨了胞内菌抗酸染色法检测体液标本结核分枝杆菌（ MTB ）的应用价值，共纳入1 236份疑似结核病患者的脑脊液（237份）、胸腹腔积液标本（999份）。结果显示，在胸腹腔积液中，MGIT 960培养法的敏感度（18.52%）高于胞内菌抗酸染色法（13.66%， P <0.01）和PCR法（6.94%， P <0.01）；在脑脊液中，胞内菌抗酸染色法的敏感度（22.15%）高于MGIT 960培养法（12.03%， P =0.02）和PCR法（3.16%， P =0.02）。由此可见，胞内抗酸染色对体液标本中 MTB 的检验是一种经济、简单且可达到预期阳性率的检验方法。北京胸科医院Wu等 ^[4] 评估了Mono-Prep涂片镜检法（MPSM，一种双层膜过滤并自动涂片的方法）在结核病中的诊断价值，共纳入117份痰标本。结果显示，直接涂片法、MPSM法、固体培养法和Xpert的阳性率分别为27.4%、40.2%、35.9%、52.1%，但MPSM法的特异度（81.3%）较直接涂片法（90.7%）有所降低。由此可见，MPSM法可提高痰涂片的阳性率，但降低了特异度，该方法仍需进一步改进。杭州市红十字会医院岳永宁等 ^[5] 评估了半自动化结核分枝杆菌扫描仪与萋-尼法人工镜检对分枝杆菌的诊断价值，共纳入225份痰标本。结果显示，仪器镜检组的检测时间为（2.0±0.0）分钟，人工镜检组为（4.8±0.8）分钟，差异有统计学意义（ P <0.01）。以罗氏培养结果为“金标准”，仪器镜检与人工镜检的敏感度分别为55.31%和42.55%，特异度分别为95.51%和99.44%，尤登指数分别为0.51和0.42。半自动化 MTB 扫描仪镜检较人工镜检检测时间短、诊断效能高，具有很好的应用前景。由此可见，胞内菌抗酸染色法或改良抗酸染色法的敏感度高于传统涂片镜检法，半自动化结核分枝杆菌扫描仪可缩短检测时间、提高诊断效能，可为结核病提供良好的诊断依据。

二、分枝杆菌培养

分枝杆菌培养目前仍然是基层医院开展较多、诊断价值较高的细菌学诊断方法之一。高方方等 ^[6] 报道了内蒙古自治区二级以上医疗机构实验室结核病相关检测开展情况。作者选取2015年7—11月对全区12个盟市265家二级以上医疗机构进行问卷调查，内容包括医院的类别、规模、2014年实验室开展结核病相关检测项目及实际检测数量。共收回154家医疗机构的有效调查问卷，总体应答率为58.1%（154/265），其中三级医院占82.0%（41/50），二级医院占52.6%（113/215）。结果显示，三级医院各检测项目的开展率均优于二级医院，其中抗酸杆菌涂片镜检开展率分别为87.8%（86/41）和31.9%（36/113）， MTB 改良固体培养分别为24.4%（10/41）和9.7%（11/113），分子生物学检测分别为12.2%（5/41）和1.8%（2/113），γ-干扰素释放试验分别为31.7%（13/41）和1.8%（2/113），差异均有统计学意义（ χ ² =37.83， P =0.000； χ ² =5.49， P =0.019； χ ² =7.54， P =0.006； χ ² =0.67， P =0.000）；含8家传染病医院在内的非综合医院 MTB 改良固体培养开展率（23.4%，11/47）优于综合医院（9.3%，10/107），差异有统计学意义（ χ ² =5.48， P <0.05）；8家传染病医院（三级5家，二级3家）结核病相关检测项目[抗酸杆菌涂片镜检（8/8）、 MTB 改良固体培养（7/8）、分子生物学检测（3/8）、γ-干扰素释放试验（6/8）]开展情况均较好。

王晶 ^[7] 则探讨了不同检验方法对肺结核患者痰液 MTB 的检验价值。作者选择2014年1月—2017年10月期间共100例确诊肺结核患者与100例健康志愿者，分别设置为肺结核组、对照组，所有受检者均接受痰液采集，行痰液 MTB 检验，分别采用痰涂片、快速培养法、荧光定量聚合酶链反应法测定痰中 MTB ，比较痰涂片、快速培养法、荧光定量聚合酶链反应法对肺结核组与对照组的 MTB 阳性检出率，并以痰快速培养法检测结果为参照，计算痰涂片、荧光定量聚合酶链反应法对 MTB 的检测灵敏度、特异度、准确性。结果显示，肺结核组经过3种检验方法检测的痰中 MTB 阳性检出率均显著高于对照组（ P <0.01）。以痰快速培养法检测结果为参照，荧光定量聚合酶链反应法对 MTB 的检测灵敏度、准确性均高于痰涂片（ P <0.01），但其特异度与痰涂片比较无统计学意义（ P >0.05）；荧光定量聚合酶链反应法与痰快速培养法检测结果之间的一致性良好（Kappa=0.745），痰涂片与痰快速培养法检测结果之间的一致性为中等（Kappa=0.531）。综上所述，肺结核患者的痰中 MTB 多呈阳性表达，在肺结核病变早期诊断时，应采用痰涂片、痰快速培养法、荧光定量聚合酶链反应法联合测定痰中 MTB ，以提高肺结核的早期诊断准确性。

孙蕊等 ^[8] 探讨Xpert MTB /RIF法、痰涂片、固体培养对临床疑似肺结核诊断的应用价值。作者收集315例疑似肺结核患者痰样本，分别进行金胺荧光涂片镜检、固体培养、传统药敏、Xpert MTB /RIF检测，并将结果进行分析。结果提示，Xpert MTB /RIF检测的阳性率与结核分枝杆菌培养比较，差异并无统计学意义（ χ ² =2.57， P =0.05）。

MTB 培养为结核病实验室诊断的“金标准”，培养阳性的菌株还可以进行后续的菌种鉴定和药敏试验，对临床的应用价值较高。很多因素可影响 MTB 的培养阳性率，国内研究者对影响因素进行了分析。重庆市公共卫生医疗救治中心袁婧等 ^[9] 分析了HIV/TB共感染患者中 MTB 血培养阳性率的影响因素，共纳入328例患者，血培养阳性率为17.7%，多因素分析显示发热时体温、发病后体重下降程度及低蛋白血症对血培养阳性率有明显影响（ P <0.05）。在HIV/TB共感染者中，血液 MTB 培养对诊断结核病是一种有效的辅助诊断工具；发热时体温越高、体重下降越明显、白蛋白越低， MTB 血培养阳性率越高。山东省聊城市中医医院孙宇航等 ^[10] 探讨了不同技术在脊柱结核标本 MTB 培养的阳性率，共纳入262例脊柱结核患者的脓液、肉芽组织、病灶壁标本。BacT/ALERT 3D和改良罗氏培养的阳性率分别为32.82%和20.99%，差异有统计学意义（ P <0.05）；BacT/ALERT3D法中脓液、肉芽组织、病灶壁的阳性率分别为34.17%、23.08%、15.58%，差异有统计学意义（ P <0.05）；改良罗氏培养法中，上述3种标本的阳性率分别为26.13%、12.43%、5.84%，差异有统计学意义（ P <0.05）。由此可见，与改良罗氏培养法相比，BacT/ALERT3D液体培养系统具有明显缩短检出时间、提高检出率的优势；脓液标本培养过程简单，且其培养阳性率高于结核肉芽组织及病灶壁，可作为脊柱结核标本培养的首选。北京结核病控制研究所中杨新宇等 ^[11] 分析了初治肺结核患者留取痰标本的质量对于细菌学检查结果的影响，每例患者留取3份痰标本进行涂片检查，并选取2份性状较好的痰标本同时进行培养检查，共留取痰标本1 692份，标本合格率为67.3%；3份标本均合格者311例，占55.1%。涂片、固体培养、液体培养检测在合格痰标本中的阳性率分别为21.1%、37.4%和68.0%；在不合格痰标本中的阳性率分别为3.4%、16.2%和27.8%，差异均有统计学意义（ P 值均<0.001）。由此可见，初治肺结核患者痰标本合格率较低，合格痰标本的 MTB 检出率明显高于不合格痰标本，故重视并提高留取痰标本的质量十分重要。泽普县人民医院卢为琴 ^[12] 探讨了痰液性状和保存条件对 MTB 培养阳性率的影响，干酪痰的培养阳性率（84%）显著高于黏液痰（44%）、血性痰（24%）和唾液（8%）（ P 值均<0.05）。-18℃保存温度下0天、3天、7天、14天、21天各时间段内 MTB 的培养阳性率无统计学差异（ P >0.05），其他温度环境下不同时间段内 MTB 的阳性培养率存在一定的差异。由此可见，应尽量选择干酪痰进行 MTB 培养，同时痰标本尽可能保存于-18℃的低温环境下并及早开展培养实验。因此，重视标本的质量和保存条件，并留取多种类型的标本进行 MTB 培养，可提高 MTB 培养的阳性率。

三、药物敏感性试验

表型药敏检测方法因可同时检测十几种一线和二线抗结核药物的单药和两种药物联合的耐受水平，被广泛应用于各地大样本的耐药情况分析总结，也因其简单、经济的特点在基层医院开展良好，同时在肺外结核、非结核分枝杆菌中也应用较多。

1.药敏试验新方法

南通市第六人民医院陈俊林等 ^[13] 探讨了微孔板变色硅胶显色法快速检测 MTB 对利福平（RIF）耐药的临床应用价值，共纳入50株 MTB 。以Bactec MGIT960法为“金标准”，微孔板变色硅胶显色法对涂阳痰标本RIF药敏检测灵敏度达94.12%，特异度为100%，准确度为97.37%。结果提示，微孔板变色硅胶显色法可直接检测痰标本中 MTB 对RIF的药物敏感性。黑龙江省结核病预防控制中心陈丽等 ^[14] 探讨了直接法固体药物敏感性试验的应用效果，以比例法药敏试验结果为“金标准”，当直接法固体药敏试验以>1%的耐药百分比为耐药检测界限时，对RIF耐药检测的敏感度、特异度、一致率分别为75.0%、82.9%、81.8%，两种方法一致性一般（Kappa=0.43）；对异烟肼（INH）耐药检测的敏感度、特异度、一致率分别为64.9%、86.0%、83.7%，一致性较差（Kappa=0.39）。当直接法固体药敏试验以含药培养基上的菌落数多于20个为耐药检测界限时，对RIF耐药检测的敏感度、特异度、一致率分别为75.0%、86.2%、84.7%，一致性一般（Kappa=0.49）；对INH耐药检测的敏感度、特异度、一致率分别为64.9%、88.7%、86.1%，一致性一般（Kappa=0.43）。结果提示，直接法固体药敏试验与传统比例法药敏试验检测的耐药性结果差异较大，对耐药结核病的临床诊断效果不理想。

2.药敏试验方法学评价

上海市疾病预防控制中心张阳奕等 ^[15] 评估了MGIT 960法、吡嗪酰胺酶（PZase）活性检测法和pncA基因序列分析法在检测 MTB 对吡嗪酰胺（PZA）耐药中的应用价值，共纳入207株 MTB 。以3种方法结果完全一致或2种方法结果一致的PZA耐药性检测结果为参考，MGIT 960法、PZase活性检测法和pncA基因序列分析法的敏感性分别为94.8%、100.0%和94.8%，特异性分别为93.3%、83.9%和98.0%，与参考结果的一致性Kappa值分别为0.85、0.74和0.93。结果提示，MGIT 960法和pncA基因序列分析法具有较好的一致性。MGIT960法存在假阳性，建议对MGIT 960法检测PZA耐药的样本进行pncA基因序列分析，若两者结果不符则进行MGIT 960法重复性试验，以提高PZA耐药性检测的准确性。

3.药敏试验方法改良结果分析

淮安市疾病预防控制中心曹敏 ^[16] 分析了 MTB 罗氏培养基药敏试验结果的合理判读时间，共纳入2 371例肺结核患者。初治患者培养4周药敏试验结果准确率INH（98.60%）、链霉素（95.22%）、RIF（96.54%）、乙胺丁醇（95.88%）与培养6周准确率（94.48%、96.54%、97.94%、97.24%）比较，差异均有统计学意义（ P <0.05）。复治患者培养4周（98.30%）与培养6周（93.62%）INH准确率差异具有统计学意义（ P <0.05）；培养4周链霉素（94.89%）、利福平（96.60%）、乙胺丁醇（96.32%）药敏试验准确率与培养6周（95.74%、97.87%、97.02%）比较，差异均无统计学意义（ P >0.05）。对于初治和复治患者，4周和6周的准确率比较差异无统计学意义。结果提示，药敏试验结果准确性与判读时间存在一定联系。佛山市顺德区慢性病防治中心黄英河等 ^[17] 研究了比例法检测 MTB 药敏试验中的最适菌液浓度，共纳入107株 MTB 。原对照组（1×10 ^-2 g/L、1×10 ^-4 g/L）、1号实验组（2×10 ^-2 g/L、2×10 ^-4 g/L）、2号实验组（4×10 ^-2 g/L、4×10 ^-4 g/L）、3号实验组（8×10 ^-2 g/L、8×10 ^-4 g/L）在罗氏对照培养基上菌落生长合格率分别为86.0%、100%、100%、100%；检测RIF耐药的正确率分别为83.2%、99.1%、88.8%、83.2%。本研究中，比例法检测 MTB 药敏试验中的最适菌液浓度为2×10 ^-2 g/L、2×10 ^-4 g/L。

4.在肺外结核中的应用

袁阳等 ^[18] 分析了近年就诊于一所省级三甲综合医院肺外结核病的分布和耐药情况，作者收集2013年1月—2017年7月就诊于遵义医学院附属医院的肺外结核病患者组织标本，经罗氏培养基培养、比例法进行4种一线抗结核药物的DST，进行人口学和临床资料以及耐药情况分析。结果显示，获得的84例肺外结核病培养及药敏信息中，单纯肺外结核病30例，肺外结核合并肺结核54例。单纯肺外结核以泌尿系统结核最为常见，其次为颈部淋巴结结核和结核性胸膜炎；肺外结核合并肺结核以结核性胸膜炎和脑膜炎多见。30例单纯肺外结核病中，初治29例，耐药率13.8%（4/29）；复治1例，其耐INH和Sm，耐药率100%（1/1）；初治、复治中均无多药耐药病例。54例肺外结核合并肺结核中，初治51例，耐药率13.7%（7/51），耐多药5.9%（3/51）；复治3例，其中无耐药病例。综上所述，单纯肺外结核病中，以泌尿系统结核最为常见，耐多药发生率低；肺外结核合并肺结核中，以结核性胸膜炎和脑膜炎多见，耐多药率较高。应加强肺外结核病组织标本的收集与耐药检测，以达早期诊断与合理治疗的目的。

5.全国各地耐药情况分析

杨安文等 ^[19] 收集2012—2016年湖南省胸科医院住院诊疗的所有肺结核患者病历信息，以菌型鉴定证实为 MTB 且进行了一线4种抗结核药物（INH、RFP、Sm、EMB）敏感度测试者为研究对象。结果显示，2012—2016年共有11 486例患者纳入研究，其中男性8 081例（70.4%）、女性3 405（29.6%）；平均年龄为（44.6±14.5）岁；户籍以农村患者为主，共7 816例（68.0%），城市3 670例（32.0%）；职业以农民为主，为7 183例（62.5%）。肺结核总耐药率为30.6%，其中单耐药率为7.0%，耐多药率为16.4%，多耐药率为7.2%；对RFP、INH、Sm和EMB的总耐药率分别为22.3%、20.8%、8.5%和15.8%；对RFP、INH、Sm和EMB单耐药率分别为1.9%、1.9%、1.4%和1.8%。湘西、湘北、湘中等地区的耐药率及耐多药率高于其他地区（ χ ² =36.295， P =0.000 1； χ ² =50.970， P =0.000 1）；2012—2016年各年份耐药率分别为35.2%、32.0%、34.4%、27.7%、24.7%，总体呈下降趋势（ χ ² =91.792， P =0.000 1），耐多药率分别为18.9%、17.1%、18.5%、13.8%、14.3%，总体呈下降趋势（ χ ² =60.933， P =0.000 1）。

杨新宇等 ^[20] 分析了北京市结核病防治机构（简称“结防机构”）和结核病定点医院疑似耐多药肺结核（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）患者的耐药状况，采用回顾性调查方法，对2014年1月—2016年12月北京市14家结核病防治机构和6家定点医院收治的881例疑似MDR-TB患者痰培养阳性的临床分离株进行初步菌种鉴定和药物敏感性试验（drug susceptibility testing，DST），包括INH、RFP、Sm、EMB、Lfx、Am、Cm、Pro、PAS，并分析、归纳北京市3年间疑似MDR-TB患者的耐药情况。结果显示，881例疑似MDR-TB患者菌株中，分离出 MTB 复合群占88.6%（781/881），非结核分枝杆菌群占11.4%（100/881）； MTB 复合群临床分离株的总耐药率为33.3%（260/781），耐多药率为17.2%（134/781）；耐药菌株药敏试验显示，对4种一线抗结核药物（INH、RFP、Sm、EMB）的高耐药百分比（>67.0%）分别为69.0%（127/184）、57.1%（92/161）、60.5%（107/177）、31.7%（19/60）。

巫株华等 ^[21] 通过获取广东省32个耐药监测点的活动性肺结核病例的药敏试验结果，来研究广东省耐药结核病的疫情及相关的影响因素。通过对纳入耐药监测的涂阳痰标本进行分离培养，并采用世界卫生组织和国际防痨和肺部疾病联合会推荐的比例法对分离培养物进行RFP、INH、EMB、Sm、卡那霉素（Kanamycin，Km）、氧氟沙星（Ofloxacin，Ofx）、卷曲霉素（Capreomycin，Cm）、丙硫异烟胺（Protionamide，Pto）、对氨基水杨酸（P-aminosalicylate，PAS）DST。结果显示，2 911例纳入耐药分析的患者中，总体耐药率为23.05%，耐多药率为4.09%，8.4%的耐多药为广泛耐多药，广泛耐多药率为0.34%；研究发现非结核分枝杆菌感染57例，占总涂阳患者的1.85%；所有的临床分离株中，Sm的耐药率最高（14.84%），在复治患者的临床分离株中，INH的耐药率最高（21.69%）。

马爱静等 ^[22] 报道了中国西南地区肺结核患者的耐药状况。通过选取2014—2015年重庆市、四川省、云南省的8个国家耐药监测点收集的610例涂阳肺结核患者的 MTB 临床分离株，采用固体比例法DST对INH、RFP、EMB、Sm共4种一线抗结核药物及Km、Ofx、Cm、Pto、PAS共5种二线抗结核药物进行药敏试验检测。结果显示， MTB 分离株对9种抗结核药物的总体耐药率和耐多药率分别是19.51%（119/610）和5.74%（35/610）；各抗结核药物的耐药顺位由高到低依次为INH（11.97%，73/610）、Sm（10.66%，65/610）、RFP（6.56%、40/610）、Ofx（6.56%、40/610）、PAS（2.62%，16/610）、Km（2.13%，13/610）、EMB（1.15%，7/610）、Cm（0.49%，3/610）、Pto（0.16%，1/610）。统计结果显示，西南地区8个监测点 MTB 临床分离株的耐多药率四川省通江县最高，为10.91%（6/55）；INH耐药率四川省通江县最高，为23.64%（13/55）；Km耐药率四川省通江县最高，为10.91%（6/55）。不同年份之间 MTB 临床分离株的总耐药率[2014年为20.08%（51/254）；2015年为19.10%（68/356）]及耐多药率[2014年为4.72%（12/254）；2015年为6.46%（23/356）]差异均无统计学意义（ χ ² =0.09， P =0.764； χ ² =0.83， P =0.363）。

周云等 ^[23] 收集2014年1月—2016年12月期间海南省结核病医院收治的经痰分离培养DST鉴定为MDR-TB的菌株共128株，对其结果进行分析。结果显示，6种抗结核药物耐药率由高到低依次为Sm（54.69%）、Ofx（51.56%）、EMB（27.34%）、Km（10.94%）、Cm（5.47%）、Pto（1.56%）；3年间EMB耐药率差异有统计学意义（ P <0.05），2016年EMB耐药率（42.50%）明显高于2014（20.41%）和2015（20.51%）年；3年间Sm、Ofx、Km、CPM、Pto耐药率变化差异均无统计学意义（ P >0.05）；耐多药组合模式有18种，前3顺位组合模式耐药率依次20.31%（INH+RFP）、18.75%（INH+RFP+Sm）、14.84%（INH+RFP+Ofx）；前3顺位耐多药种类耐药率依次为35.94%（耐3种药）、25.00%（耐4种药）、20.31%（耐2种药）。

杭州疾病预防控制中心Li等 ^[24] 分析了杭州耐药结核的流行特征，共纳入1 326例患者，22.3%的患者对任一药物耐药，8.0%为MDR；复治患者的耐药率显著高于初治患者。2011—2015年间复治患者对INH、RIF、乙胺丁醇、链霉素和MDR的耐药率显著下降，而初治患者对RIF的耐药率显著下降。由于DOTS-Plus策略的实施，获得性耐药呈下降趋势，但由传播引起的原始耐药率仍很高。上述提示，应通过加强耐药患者的治疗和管理降低耐药结核的传播。北京胸科医院Huo等 ^[25] 分析了2005—2015年间我国 MTB 对RIF耐药的趋势变化，共纳入2005年分离的273株和2015年分离的269株 MTB 临床株。2015年RIF（36.4%）、INH（39.0%）和左氧氟沙星（25.7%）的耐药率显著高于2005年（28.2%、30.0%和15.4%， P <0.05）。基因型数据显示，2015年256株（95.2%）为北京基因型，显著高于2005年（86.4%， P <0.01）。rpoB基因的RIF耐药决定区的突变率在2015年（99.0%）也显著高于2005年（85.7%， P <0.01）。此外，2015年（31.6%）携带补偿突变的菌株数显著多于2005年（7.8%），这些补偿突变主要发生在rpoB基因的531位（91.9%）。由此可见，在2005—2015年的10年间，RIF、INH和左氧氟沙星的耐药率呈上升趋势，而且北京基因型菌株的流行也呈上升趋势。北京胸科医院Zong等 ^[26] 分析了新型 唑烷酮类delpazolid与利奈唑胺在体外对MDR-TB和XDR-TB的MIC分布，并且对于耐 唑烷酮类的菌株测定了其23S rRNA、rplC和rplD基因的突变情况。共纳入了120株MDR-TB和120株XDR-TB菌株，利奈唑胺和delpazolid的MIC ₉₀ 分别为0.25mg/L和0.5mg/L。利奈唑胺和delpazolid的流行病学cut off值（ECOFFs）分别设定为1.0mg/L和2.0mg/L，尽管在XDR-TB菌株中利奈唑胺和delpazolid的耐药率差异不显著（ P >0.05），但在MDR-TB菌株中利奈唑胺耐药率显著高于delpazolid（ P =0.036）。53.85%（7/13）的利奈唑胺耐药菌株在上述3个基因中存在突变。由此可见，delpazolid的抗菌活性与利奈唑胺相当。上海市公共卫生临床中心郭倩等 ^[27] 分析了HIV感染者对一线药物的耐药特征，共纳入HIV/ MTB 共感染154例和单纯结核病357例。结果显示，HIV/ MTB 共感染组总耐药率为44.2%，初始耐药率为42.2%，初始耐多药率为13.3%，链霉素总耐药率为31.8%，初始耐药率为28.9%，显著高于单纯结核病组（33.9%、25.0%、3.8%、22.7%、11.4%， P 均<0.05）。INH、RIF、乙胺丁醇耐药率与单纯结核病组差异无统计学意义（ P 均>0.05）。由此可见，HIV/TB共感染者对一线抗结核药物耐药率和耐多药率较高。另外，还有多位专家对各市及医院的相关情况进行统计分析，各省市/医院报道的耐药情况分析有利于我们对全国各地的结核病耐药疫情有更直观的了解，为公共卫生决策提供数据及建议，同时指导耐药结核病的监测、临床治疗方案的合理选择。

6.基因型与耐药的相关性

广州市胸科医院蔡杏珊等 ^[28] 研究了 MTB 不同基因型在广东省各地区的流行情况及其耐药相关性，共纳入504株菌株，其中386株为北京家族，118株非北京家族中T家族高达48株，其余是H3家族、EAI家族、MANU家族、AMBIGO家族、LAM家族以及新发基因型。504株菌株分为49种寡核苷酸类型，归类于30个簇，其主要流行簇依次为SIT1、SIT53、SIT52、SIT19、SIT523。SIT1基因型的INH、RIF、链霉素、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、阿米卡星、左氧氟沙星耐多药、泛耐药的耐药率均高于SIT53、SIT52、SIT19，而SIT523在利福平、链霉素、乙胺丁醇MDR的耐药率方面高于SIT1。北京家族的INH、PZA、AMK的耐药率高于非北京家族，差异有统计学意义（ P <0.05），其余药物的耐药性无显著性差异（ P >0.05）。综上所述，广东省 MTB 呈基因多态性，北京基因型菌株为本省 MTB 主要流行株，而且与INH、吡嗪酰胺、阿米卡星耐药相关。内蒙古医科大学董文竹等 ^[29] 评价了MDR及XDR菌株对抗结核新药乙胺丁醇类似物SQl09的耐药性，共纳入109株MDR和114株XDR菌株。根据临床菌株对SQl09的MIC值频数分布情况，确定ECOFF值为1.0mg/L。XDR菌株耐药率为4.4%，MDR菌株中无耐药菌株。北京基因型菌株对SQl09耐药率为2.4%，非北京基因型菌株中未发现耐药菌株，两者差异无统计学意义（ P >0.05）。EMB敏感菌株对SQl09耐药率为0.7%；EMB耐药菌株对SQl09耐药率为4.7%，两者差异无统计学意义（ P >0.05）。综上所述，SQl09在体外药敏试验中表现出对MDR和XDR菌株具有良好的抑菌效果。菌株对EMB的耐药性及北京基因型菌株与SQl09耐药性无相关性。

我国结核病耐药情况依然严峻，加强药敏试验的开展，并改进或研发药敏试验新技术，以便更加快速、简便地诊断耐药，更好地控制结核病。

四、非结核分枝杆菌的检测

随着技术进步和医务工作者对NTM认识的提高，NTM的发现率呈上升趋势。国内研究者对我国NTM的菌种鉴定技术、菌种分布和药物敏感性等做了报道。

1.NTM菌种鉴定技术

广州中医药大学第二附属医院李松等 ^[30] 评价基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）技术对NTM的鉴定和分型能力，共纳入55株NTM。RPOB基因对55株NTM显示了很好的鉴定和分型能力；MALDI-TOF技术可将89.1%菌株鉴定到属，78.2%鉴定到种；对蛋白指纹图谱的聚类分析也显示出了良好的分型能力。由此可见，MALDI-TOF技术可以有效地对NTM进行鉴定和分型，其检测周期短、操作简便，在实验室中与RPOB基因联合应用有着很好的互补性。

2.NTM的菌种分布

云南省疾病预防控制中心结核病防治所陈涛等 ^[31] 分析了云南省NTM流行状况，优势流行菌种的前4位为胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、偶发分枝杆菌，且肺结核疫情与NTM分离率呈负相关。由此得出结论，云南省NTM分离率低，肺结核疫情高的地区NTM分离率低，反之则高，地区差异明显，因此应加强NTM流行状况监测，同时结合优势菌种优化诊治流程。徐州医科大学研究生院潘永等 ^[32] 分析了NTM和下呼吸道病原菌分布及耐药性，共纳入152例NTM肺病患者，分离鉴定出7个NTM菌种，包括快速生长群64株（42.11%），以龟/脓肿分枝杆菌（78.13%）为主；缓慢生长群88株（57.89%），以鸟分枝杆菌复合群（68.18%）为主。152例NTM肺病患者下呼吸道样本共分离出病原菌88株，包括革兰阴性菌53株（60.23%），真菌32株（36.36%），革兰阳性菌3株（3.41%）。革兰阴性菌以肺炎克雷伯菌（22.64%）为主，真菌以白色假丝酵母菌（84.37%）为主，革兰阳性菌均为金黄色葡萄球菌（100.00%）。由此可见，NTM肺病患者NTM以缓慢生长群为主；下呼吸道病原菌以革兰阴性菌为主；临床应根据药敏试验结果合理选择抗菌药物。广州市胸科医院罗少珍等 ^[33] 分析了广州城市老区NTM的流行现状与特点。在40 418例样本中分离到1 689株NTM，分离率为4.18%。其中，2012—2016年度的分离率分别为4.05%、4.58%、3.24%、4.67%和4.28%，2014年明显低于其他年份；男、女的分离率分别为3.64%和5.18%，差异有统计学意义（ P <0.001）；青、中、老3个年龄组的分离率分别为2.85%、5.16%和7.37%，各年龄组两两之间比较差异有统计学意义（ P <0.001）；春、夏、秋、冬4个季节的分离率分别为3.39%、4.72%、4.66%和4.00%，两两比较除夏-秋之外，差异均有统计学意义（ P 值均<0.05）。在进行菌种鉴定的716株NTM中，位列前5位的菌种为龟脓肿分枝杆菌（304株）、鸟胞内分枝杆菌（172株）、堪萨斯分枝杆菌（99株）、戈登分枝杆菌（74株）、偶然分枝杆菌（51株）。由此可见，广州城市老区NTM流行菌种主要为龟脓肿分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌和偶然分枝杆菌，NTM在人群中的流行主要受性别、年龄和季节的影响。

3.NTM的药物敏感性

北京胸科医院王淑琦等 ^[34] 分析了我国胞内分枝杆菌临床分离株的耐药谱及基因型特征，共纳入150株胞内分枝杆菌，克拉霉素（97.3%）、莫西沙星（94.0%）和阿米卡星（90.0%）对胞内分枝杆菌具有较好的抗菌活性；75.3%、64.0%、52.7%%和8.7%的菌株对RIF、利奈唑胺、卷曲霉素和乙胺丁醇敏感；3种注射类抗结核药物的MIC ₅₀ 与MIC ₉₀ 值为阿米卡星4mg/L和16mg/L，链霉素4mg/L和16mg/L，卷曲霉素8mg/L和16mg/L；5种喹诺酮类药物的MIC ₅₀ 与MIC ₉₀ 值为莫西沙星0.5mg/L和2mg/L，环丙沙星1mg/L和8mg/L，左氧氟沙星1mg/L和8mg/L，安妥沙星2mg/L和16mg/L，氧氟沙星2mg/L和16mg/L。采用16位点VNTR方法对胞内分枝杆菌进行基因分型，150株胞内分枝杆菌共分为21个簇、121种基因型，总Hunter-Gaston指数为0.997。由此可见，克拉霉素、莫西沙星和阿米卡星在体外对胞内分枝杆菌具有较好的抗菌活性；16位点VNTR方法对胞内分枝杆菌临床分离株的分辨率较高；胞内分枝杆菌的耐药谱与菌株是否成簇并无明显相关性。上海肺科医院Li等 ^[35] 研究了脓肿分枝杆菌对贝达喹啉的MIC值分布。贝达喹啉对于脓肿分枝杆菌具有较强的杀菌活性，MIC ₅₀ 和MIC ₉₀ 分别为0.062mg/L和0.125mg/L。全基因组测序显示未发生atpE基因突变，而在6株对贝达喹啉敏感性下降（MIC值：0.5～1mg/L）的菌株中，3株在mab　4384发生了非同义突变，该基因的编码产物可抑制外排泵MmpS5/MmpL5。qRT-PCR结果显示，与中等MIC值（0.125～0.5mg/L）和低MIC值（<0.062mg/L）菌株相比，贝达喹啉敏感性下降的菌株中MmpS5/MmpL5的表达量下降，但具有升高MIC值菌株的MmpS5/MmpL5表达量并未升高。该研究结果显示，MmpS5/MmpL5与贝达喹啉的敏感性相关。

王斌等 ^[36] 对自贡市临床分离鉴定的23株非结核分枝杆菌分别进行26种抗生素的药物敏感试验，方法为采用微孔板阿尔玛蓝测定法测试每种药物对每株非结核分枝杆菌的最低抑菌浓度（MIC值），通过MIC值判断该菌对此种抗生素是否耐药。结果显示，非结核分枝杆菌对大部分抗结核药物耐药，并且对部分药物的耐药存在种间差异。其中脓肿分枝杆菌耐药率达84.6%，鸟分枝杆菌与胞内分枝杆菌分别达53.8%与52.3%，堪萨斯分枝杆菌耐药率最低为38%。由此可见，对临床非结核分枝杆菌肺病（nontuberculous mycobacteria，NTM）快速菌株鉴定及药敏试验是治疗的关键。

吴海燕等 ^[37] 对苏州地区NTM临床特点、耐药特点进行了分析总结。作者选取苏州市第五人民医院2014年9月—2016年9月64例NTM患者为研究对象，对患者临床资料（包括年龄、性别、既往病史、症状、影像学）、实验室检查（包括γ-干扰素释放实验、痰抗酸杆菌涂片、结核分枝杆菌TB-DNA痰液检测、痰结核分枝杆菌培养）、治疗方案选择、治疗期间药物不良反应及治疗效果进行回顾性分析。结果显示，NTM以老年男性多见，通常合并基础肺病如支气管扩张、硅肺、慢性阻塞性肺疾病患者容易好发，临床症状及影像学表现与肺结核相似但病情进展较慢，γ-干扰素释放实验多为阴性（83.0%），痰抗酸杆菌涂片阳性率高（66.0%）及结核分枝杆菌TB-DNA痰液检测有助于早期诊断，耐药严重，耐药率由高到低分别INH（98.4%）>PAS（95.3%）>SM（73.4%）>Lfx（82.8%）=RFP（82.8%）>Am（73.4%）>EMB（56.3%）>Pto（40.6%）。患者治疗期间药物不良反应大，治疗效果差。综上所述，对于老年患者，特别是合并基础肺疾病如支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病等查痰涂片找抗酸杆菌阳性及常规抗结核后治疗效果差的肺结核患者，均需警惕NTM可能。因NTM与肺结核有很多相似点，早期易被误诊为肺结核，因此需及时关注早期疑似NTM患者的分枝杆菌培养报告及DST结果，并根据DST结果调整治疗方案。

细菌学检查仍是结核病诊断的重要辅助检查，鉴于其简单、易行及经济实惠，基层医院应广泛开展，但医院对检验的质量和医师的培训应严格把关，临床医师也应根据当地条件、患者病情酌情选择及推荐诊断方法，必要时联合应用多种检验方式可以大大提高结核菌的阳性检出率。

（王桂荣　贝承丽　常蕴青　唐神结）

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