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【摘要】 结核病依然威胁着人类健康，根据《全球结核病报告2018》数据显示，我国2017年结核病总报告病例数为778 390例，估算发病率为63/10万，仍是结核病高负担国家。因此，迫切需要更高保护效果的疫苗出现，由我国自主研发的治疗性疫苗微卡正在进行Ⅲ期临床试验阶段，另一种亚单位疫苗AEC/BC02也正在开展Ⅰ期临床试验，随着新技术的发展，新型结核疫苗抗原的发现手段逐渐优化，发现了一批候选抗原用于后续疫苗的研发，DNA疫苗的临床前研究正在开展，我国新型结核病疫苗研发进度正在逐步加快，且逐步与世界接轨。
【关键词】 亚单位疫苗；病毒载体疫苗；DNA疫苗；免疫原；佐剂
2018年我国科学家在结核病疫苗领域取得了一定成绩，尤其是在亚单位疫苗、DNA疫苗等的临床前研究，新型疫苗抗原的发现及表位分析，以及疫苗佐剂等方面均作出了一定的贡献。
都伟欣等 [1] 利用豚鼠结核病模型评估了重组AEC/BC02联合化疗的抗结核效果。该研究首先通过皮下注射高剂量 MTB 给豚鼠，2周后ESAT6-CFP10（EC）变态反应原皮试阳性的豚鼠随机分成4组：生理盐水（NS）组、AEC/BC02疫苗组、抗生素组、抗生素+AEC/BC02疫苗组。抗生素+AEC/BC02疫苗组接受异烟肼（isoniazid，INH）和利福喷丁（rifapentine，RFT）的联合化疗，1次/周，共3次，给药结束后每只豚鼠开始肌内免疫AEC/BC02疫苗，共6次，间隔10天。AEC/BC02疫苗组仅免疫AEC/BC02疫苗，抗生素组给药INH和RFT。这两组给药剂量和程序同抗生素+疫苗组。NS组以生理盐水作阴性对照。全部豚鼠于攻毒后第14周后对4组豚鼠治疗效果进行综合比较。抗生素+AEC/BC02疫苗组脏器病变最轻，而AEC/BC02疫苗组与NS组比较，差异无统计学意义。抗生素+AEC/BC02疫苗组脾脏活菌数最低，其他两组脾脏活菌载量与NS组相比，差异均无统计学意义。肺部病理组织切片，各组肺脏均出现不同程度的以肉芽肿为主的病理变化，病变程度也是抗生素+AEC/BC02疫苗组最轻。因此，该研究认为INH、RFT和AEC/BC02疫苗联合使用优于抗生素和疫苗的单一治疗方式，能显著减轻动物脏器病变，降低脾肺活菌载量，从而提高对 MTB 感染豚鼠的治疗效。单一使用重组AEC/BC02疫苗多次免疫均无较好的治疗效果，但联合化疗时可获得较好疗效，为今后临床试验的开展奠定了一定基础。
中枢记忆性T细胞（central memory T cells，T CM ）被认为是提供抗结核长期保护的重要成员，而IL-2主要由T CM 细胞分泌。但是接种亚单位疫苗后何时可以产生尚不清楚。为解决这一问题，Zhu等 [2] 开展了一项研究，该研究基于亚单位疫苗LT70，该疫苗可融合表达ESAT6-Ag85B-MPT64（190～198）- Mtb 8.4-Rv2626c，设计了3种接种方案分别为：①分别为第0周、第3周和第6周（0-3-6w）；②第0周、第4周和第12周（0-4-12w）；③第0周、第4周和第24周（0-4-24w）。研究发现，0-4-12w和0-4-24w的两种方案都比0-3-6w免疫诱导更高水平的抗原特异性IL-2、IFN-γ和TNF-α。其中，0-4-12w可诱导最高水平的IL-2，综合其他实验结果，该方案产生的T CM 细胞最多，T CM 细胞免疫应答最强且保护效果最佳。该研究在一定程度上证实间隔接种亚单位疫苗可产生较强的T CM 细胞应答和抗结核效果，但该研究以BCG攻毒，未使用毒株或临床株进行攻毒实验，结果的可靠性有待进一步验证。
赵燕慧等 [3] 研究者构建了3种抗原（EAST6、Rv3407、RpfB）重组腺病毒载体疫苗Ad5-TPA-3Ag（TPA为信号肽），以滴鼻（intranasal injection，IN）和肌内注射（intramuscular injection，IM）两种方式免疫了NIH小鼠，初步评估了该疫苗的免疫原性。当免疫剂量为8×10 7 IFU时，IM和IN免疫中3种抗原均能表现出良好的免疫原性。实验结果显示，Ad5-TPA-3Ag疫苗的最佳免疫途径为肌内注射，最佳免疫剂量为8×10 7 IFU。该研究认为，Ad5-TPA-3Ag重组腺病毒载体疫苗为针对 MTB 潜伏感染的候选疫苗，这一结论有待商榷，本研究未对其免疫保护力进行实验分析，其作为 MTB 潜伏感染的候选疫苗也需要构建潜伏感染的动物模型的相关数据支持。
Tian等 [4] 构建了真核重组质粒pCMFO（融合了4种 MTB 抗原，包括Rv2875、Rv3044、Rv2073c和Rv0577），并以二甲基双十八烷基铵（dimethyldioctadecylammonium，DDA）为佐剂制备了pCMFO/DDA疫苗，以DDA结合两种模式识别受体激动剂单磷酰脂质A和海藻糖6-6'二山嵛酸酯（trehalose 6，6'-dibehenate，TDB）为佐剂，简称DMT，制备了pCMFO/DMT疫苗，并分析了两种DNA疫苗的物理化学性质，发现DNA-DMT复合物中的DNA比DNADDA脂质体更慢且更持久地释放。选用C57BL/6小鼠气溶胶感染模型比较了两者的免疫原性和保护力，发现pCMFO/DMT接种小鼠脾脏抗原特异性IL-2 + T CM 细胞应答更强，其保护力更持久，这一现象有可能归因DMT佐剂的缓释作用。该研究表明，DNA疫苗pCMFO/DMT有较好的应用前景，有待更多临床前试验和临床试验的进一步验证与评估。
自杀性DNA疫苗在动物体内表达外源基因后，随细胞凋亡而被机体清除，安全性较好，与常规DNA疫苗相比有一定优越性。潍坊医学院邵丽军等 [5] 构建了pSCA1/Ag85B+Rv3407自杀性重组DNA疫苗，并利用ELISA法检测了其在BHK-21细胞中的表达情况。但仍有待后续研究对该疫苗的保护力进行评估。
Yan等 [6] 使用新型可溶解微针贴片（microneedle patch，MNP）通过皮肤免疫Ag85BDNA疫苗，与常规肌内注射（IM）进行比较，评估Ag85B DNA疫苗的免疫保护力。实验结果显示，当免疫剂量低（4.2μg）时，MNP和IM免疫之间没有显著差异。然而，体液免疫检测结果发现，当使用高剂量（12.61μg）时，MNP免疫可以较IM引起更强的抗体反应。通过检测脾脏产生的细胞因子，高剂量免疫时，MNP组和IM组IFN-γ表达量高于其他对照组，而MNP高剂量免疫组IFN-γ表达量显著高于IM组；TNF-α表达情况在高剂量免疫时，MNP组和IM组表达量高于其他对照组，但这两组之间无统计学差异。通过细菌计数和分析存活率来评估。该研究表明，使用溶解微针对皮肤进行DNA疫苗接种可提供针对结核病的新策略。
筛选新的结核抗原以及抗原表位深度分析是发展新型结核病亚单位疫苗的重要途径。
武汉轻工大学的余晓丽教授团队 [7-9] 利用NetMHC、BIMAS等生物信息学工具对3个结核分枝杆菌蛋白Rv1166、Rv3607c、Rv0017c的抗原表位进行了预测分析。研究发现，Rv1166具有免疫原性，综合CD4 + T和CD8 + T细胞表位综合分析得到优势表位RLWNMSTVL，该优势候选表位将作为结核特异诊断和多表位结核疫苗的研究基础。Rv3607c是叶酸生物合成途径的关键酶，可催化7，8-二氢酮转化为6-羟甲基-7，8-二氢翼和乙醇醛，其与结核分枝杆菌复合群的同源性相当高，该团队利用人工神经网络分析方法同时综合了SSPro、Bcepred等多种软件对其B细胞表位进行了分析，发现了3个潜在的优势B细胞线性表位，肽段序列分别为：GAEIADHVMDDQRVHA 77～92 、 AAEIVAGPPRKLIETV 61～76 、 GRHGVYDHERVAGQRF 14～29 。使用EpiSearch方案利用噬菌体展示肽序列自动检测得到优势构象性表位1个，即G 9 、T 11 、G 14 、G 26 、R 28 、V 30 、D 32 、A 62 、I 64 、A 66 、I 73 、E 74 、T 75 、A 96 、D 110 、V 111 、A 112 、V 113 。该团队还预测了抗原Rv0017c的T、B细胞表位，该蛋白与细菌细胞壁形成和菌体生长有关，通过运用多种生物信息学工具分析发现了Rv0017c有5个T细胞表位和6个B细胞表位以及2个T-B细胞联合表位（RLQAPVA 104～110 与GLTITWMSY 414～422 ）。余晓丽教授团队对这3种抗原蛋白的表位分析，为构建新型结核病疫苗提供了新的候选抗原，但仍有待免疫学实验数据及动物免疫效果，进一步验证其成为疫苗的可能。
潍坊医学院伊正君和付玉荣教授团队 [10～13] 对 MTB 的PKnG、Eis、BfrB和MCe4A四种蛋白的抗原表位进行了分析，PKnG为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G，是参与 MTB 逃逸溶酶体降解的关键因子，通过生物信息学分析预测其无信号肽和跨膜螺旋区，并含有7个B细胞抗原表位和4个T细胞抗原表位，具备成为结核病免疫治疗疫苗的潜力。BfrB蛋白参与维持细胞内铁元素的动态平衡，影响巨噬细胞内 MTB 的生长，通过生物信息学预测B细胞、CTL细胞及Th细胞抗原表位分别为7个、9个、11个。 MTB 的eis基因只存在于致病性结核分枝杆菌中，其编码的产物Eis蛋白可增强菌体在巨噬细胞内的生存能力，且还可能与 MTB 耐药相关，通过生物信息学预测，该蛋白至少含有6个B细胞优势抗原表位和14个优势CTL表位，优势抗原表位数个。MCe4A为哺乳动物细胞侵袭蛋白（mammalian cell-entry proteins，Mce），是 MTB 入侵和存活所必需的，而且参与诱导宿主细胞的凋亡，预测该蛋白共有18个B细胞抗原表位和23个CTL表位。该团队有针对性地选择了PKnG、Eis、BfrB及MCe4A四种抗原进行了表位分析，为进一步验证其疫苗开发价值奠定了基础。
此外，卢洋等 [14] 对 MTB 参与PhoPR双组分调控作用的PhoP蛋白进行抗原表位预测，发现潜在B细胞表位21个，CTL表位7个。
以上多个 MTB 蛋白的抗原表位分析，均为生物信息学预测所得，结果的可靠性仍有待更多的实验数据支持。
佐剂可提高疫苗的免疫效果，在研发过程中具有重要的作用。为了解水油微球/HKBCG与水油微球/ABCG复合佐剂的辅佐性，张文慧等 [15] 比较了两种复合佐剂对 MTB 融合蛋白PstS1-LEP免疫原性的影响。经皮下注射免疫BALB/c小鼠3次，间隔2周，末次免疫后2周采血，处死小鼠并无菌摘脾；ELISA法检测小鼠血清抗PstS1-LEP的IgG、IgG1和IgG2a抗体，ELISPOT法检测小鼠脾淋巴细胞经PstS1-LEP刺激分泌IFN-γ、IL-4和IL-17的斑点形成细胞数（spots forming cell，SFC）。结果发现，两种复合佐剂疫苗诱导的体液免疫无统计学差异；ABCG/PstS1-LEP疫苗免疫小鼠的IFNγ-SFC、IL-17-SFC及IL-17-SFC/IL-4-SFC值均高于HKBCG/PstS1-LEP疫苗组。因此，该研究结果表明ABCG/PstS1-LEP疫苗免疫小鼠更趋向于Th1和Th17型免疫应答，是否能改善疫苗的免疫保护力仍需进一步验证。
（王伟 李传友 唐神结）
1.苏城，卢锦标，沈小兵，等.豚鼠模型中结核菌素纯蛋白衍生物量效关系比较研究[J].微生物学免疫学进展，2018，3：8-12.
2.BAI C，HE J，NIU H，et al.Prolonged intervals during Mycobacterium tuberculosis subunit vaccine boosting contributes to eliciting immunity mediated by central memory-like T cells[J].Tuberculosis，2018，110：104-111.
3.赵燕慧，赵辉，彭少丹，等.新型肺结核三抗原组分疫苗的开发和小鼠免疫原性研究[J].中国疫苗和免疫，2018，2：176-181.
4.TIAN M，ZHOU Z，TAN S，et al.Formulation in DDA-MPLA-TDB Liposome Enhances the Immunogenicity and Protective Efficacy of a DNA Vaccine against Mycobacterium tuberculosis Infection[J].Front Immunol，2018，9：310.
5.邵丽军，李猛，伊正君.结核分枝杆菌Ag85B+Rv3407融合基因自杀性DNA疫苗的构建及鉴定[J].中国病原生物学杂志，2018，4：368-371.
6.YAN Q，CHENG Z，LIU H，et al.Enhancement of Ag85B DNA vaccine immunogenicity against tuberculosis by dissolving microneedles in mice[J].Vaccine，2018，36（30）：4471-4476.
7.李海波，王华林，张绍鹏，等.结核分支杆菌Rv1166的T细胞抗原表位预测分析[J].武汉轻工大学学报，2018，3：43-46.
8.张露，郑辉，吴启航，等.结核分枝杆菌Rv3607c B细胞表位预测及分析[J].武汉轻工大学学报，2018，2：20-24.
9.郑辉，张露，吴启航，等.结核分枝杆菌蛋白Rv0017c T、B的细胞表位分析[J].武汉轻工大学学报，2018，1：22-27.
10.刘威，付玉荣，伊正君.结核分枝杆菌PKnG蛋白结构与功能的生物信息学分析[J].中国病原生物学杂志，2018，6：567-571.
11.袁秋露，付玉荣，伊正君.结核分枝杆菌BfrB蛋白的生物信息学分析[J].中国病原生物学杂志，2018，2：131-134.
12.张西燕，付玉荣，伊正君.结核分枝杆菌eis基因及其编码蛋白的生物信息学分析[J].中国病原生物学杂志，2018，2：140-151.
13.吴姝，伊正君，付玉荣.结核分枝杆菌Mce4A蛋白结构与功能的生物信息学分析[J].中国病原生物学杂志，2018，7：704-708.
14.卢洋，王新敏，董洪昌，等.结核分枝杆菌PhoP蛋白的生物信息学分析[J].中国病原生物学杂志，2018，6：575-579.
15.何秀云，朱传智，李彬钰，等.水油微球/BCG复合佐剂对结核杆菌融合蛋白PstS1-LEP免疫原性的影响[J].中国生物制品学杂志，2018，3：230-235.